程 艷，黃 爽，馮艷靜，唐 彥△

(1.曲靖市中醫(yī)醫(yī)院，云南 曲靖 655000；2.云南中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650500)

抽動(dòng)障礙（TD）是兒童常見(jiàn)的神經(jīng)精神疾病，主要表現(xiàn)為一個(gè)或多個(gè)部位反復(fù)、快速、無(wú)目的地肌肉抽搐或聲帶抽搐，可伴有情緒障礙、注意力缺失、強(qiáng)迫運(yùn)動(dòng)或思考等行為癥狀[1]。近年來(lái)其發(fā)病率呈上升趨勢(shì)[2]。研究發(fā)現(xiàn)腦基底神經(jīng)節(jié)病變和多巴胺系統(tǒng)功能障礙與本病的發(fā)生密切相關(guān)[3]，但單純針對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)失衡的治療方案存在一定的局限性[4-5]。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外報(bào)道TD的發(fā)病機(jī)制與神經(jīng)免疫網(wǎng)絡(luò)的失衡有關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)TNF-α及白介素家族類中的IL-6、IL-1β、IL-2、IL-12等與本病可能存在關(guān)聯(lián)[6-7]，以這些細(xì)胞因子在血清及腦組織增高為主要特點(diǎn)，提示促炎癥因子介導(dǎo)了神經(jīng)免疫反應(yīng)。

根據(jù)本病的臨床癥狀，TD屬于中醫(yī)“肝風(fēng)證”范疇，目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為本病主要與風(fēng)、痰有關(guān)，以熄風(fēng)化痰為主要治法[8-9]。

全國(guó)老中醫(yī)學(xué)術(shù)思想指導(dǎo)老師、云南省名中醫(yī)劉以敏教授在辨治TD時(shí)也以“風(fēng)痰致病”立論，自擬的經(jīng)驗(yàn)方止抽湯不僅療效確切，且與同類治療TD復(fù)方相比，止抽湯主藥包含云南本地特有的中藥藍(lán)花參、山土瓜、薺菜花，有鮮明的地方特色[10]。前期研究發(fā)現(xiàn)止抽湯可通過(guò)調(diào)節(jié)紋狀體DA系統(tǒng)單胺類遞質(zhì)改善TD模型大鼠抽動(dòng)行為[11-12]。本實(shí)驗(yàn)以此為基礎(chǔ)，進(jìn)一步觀察止抽湯對(duì)TD模型大鼠細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β的影響，以期從不同環(huán)節(jié)探索其作用機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 24只Wistar大鼠，雄性，日齡28 d，體質(zhì)量（120±15）g，購(gòu)自長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK（湘）2014-0011。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周進(jìn)入正式實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥物 止抽湯組成：藍(lán)花參15 g，山土瓜15 g，薺菜 15 g，天麻 10 g，鉤藤 10 g，白芍 20 g，烏梅 10 g，全蝎5 g，蜈蚣2條，甘草5 g，購(gòu)自云南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房，煎劑由醫(yī)院制劑中心提供，濃縮至生藥含量1.2 g/mL，貯存于4℃冰箱備用。鹽酸硫必利（江蘇天士力帝益藥業(yè)有限公司，批號(hào)H32026011），制劑濃度：1.7 mg/mL。

1.3 主要試劑與引物 主要試劑：IDPN（美國(guó)Sigma公司，貨號(hào)317306），使用前以生理鹽水稀釋成10%的溶液。TNF-α（貨號(hào) E-EL-R0019c）、IL-6（貨號(hào) EEL-R0015c）、IL-1β（貨號(hào) E-EL-R0012c）酶聯(lián)免疫試劑盒由Elabscience公司提供。TNF-α抗體（貨號(hào)ab6671）、IL-6抗體（貨號(hào) ab9324）、IL-1β 抗體（貨號(hào)ab9722）抗體，均由英國(guó)Abcam公司提供。RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas，貨號(hào) K1622）；SYBR Green master mix（KAPA，貨號(hào)KK4601）；Trizol試劑盒（Lifetech，貨號(hào) 15596026）。

引物：引物合成由廣州invitrogen公司完成，應(yīng)用beacon designer 7.90設(shè)計(jì)Q-PCR引物。引物序列如下。

TNF-ɑ引物：上游 5'-AACAAGGAGGAGAAGTTC-3'，下游 3'-TTGAGAAGATGATCTGAGT-5'；IL-6引物：上游 5'-GAACAACTTACAAGATAACA-3'，下游 3'-GACTCTAACTTCTCCATTA-5'；IL-1β 引物：上游 5'-AACATAAGCCAACAAGTG-3'，下游3'-ACAGGACAGGTATAGATTC-5'。

1.4 主要儀器 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海森信DGG-9140B）；高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)thermo scientific）；酶標(biāo)儀（美國(guó) Molecular公司 SPECTCA MAX190）；紫外分光光度計(jì)（美國(guó)NanoDrop ND-1000）；定量 PCR 儀（美國(guó) ABI StepOne）；高速冷凍離心機(jī)（塞洛捷克D3024R）；Vortex混合儀（上海啟前XH-D）；酶標(biāo)儀（美國(guó) Molecular公司 SPECTCA MAX190）。

2 方法

2.1 造模及分組 24只Wistar大鼠隨機(jī)分為正常組6只、造模組18只。正常組腹腔注射生理鹽水，造模組腹腔注射 IDPN（150 mg·kg-1·d-1），連續(xù) 1 周，參照Napier等報(bào)道[13]的方法對(duì)大鼠刻板、運(yùn)動(dòng)行為進(jìn)行評(píng)分。用藥后，造模組大鼠評(píng)分均＞2分，造模成功。再將造模組隨機(jī)分為模型組、止抽湯組、鹽酸硫必利組，每組6只。

2.2 給藥 正常組、模型組均予生理鹽水灌胃，止抽湯組予止抽湯水煎液灌胃，鹽酸硫必利組予稀釋后的鹽酸硫必利溶液灌胃，均按2 mL/100g，1次/d；分別于藥物灌胃第7、14天后進(jìn)行運(yùn)動(dòng)行為及刻板行為評(píng)分。

2.3 指標(biāo)檢測(cè)

2.3.1 ELISA法檢測(cè)血清 TNF-α、IL-6、IL-1β的水平大鼠末次給藥和行為觀察后，腹腔注射10%水合氯醛溶液麻醉大鼠。在麻醉狀態(tài)下，抽取3 mL靜脈血并注入離心管。靜置15 min后，離心機(jī)（2 500 r/min）離心5 min，取上清液放入塑料離心管中。用ELISA試劑盒檢測(cè)大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β的濃度，實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2.3.2 熒光實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)TNF-α、IL-6、IL-1β的mRNA表達(dá)水平 用TRIzol試劑提取紋狀體中細(xì)胞總RNA，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以此cDNA為模板。用普通PCR反應(yīng)擴(kuò)增TNF-α、IL-6、IL-1β基因的產(chǎn)物。瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，從凝膠中純化回收相應(yīng)的DNA片段，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度。以10倍梯度稀釋作為熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立定量PCR反應(yīng)體系，對(duì)相應(yīng)基因進(jìn)行定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，用熒光定量分析軟件測(cè)定電泳帶密度，以β-actin為內(nèi)參照，計(jì)算目的基因mRNA相對(duì)水平。結(jié)果以TNF-α、IL-6、IL-1β條帶占βactin條帶密度的百分比（%）表示。

2.3.3 Western-blot法檢測(cè) TNF-α、IL-6、IL-1β 的蛋白表達(dá)水平 組織蛋白樣品用蛋白中性裂解緩沖液提取，然后進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉(zhuǎn)膜，麗春紅染色，3%脫脂牛奶在37℃下密封1 h，封閉液棄去。依次加入每種待測(cè)蛋白對(duì)應(yīng)的一抗、二抗，用化學(xué)熒光試劑盒顯影固定顏色，并適當(dāng)曝光。照片經(jīng)掃描儀掃描后在軟件下分析各條帶光密度，結(jié)果以各蛋白光密度值占其內(nèi)參照（β-actin）光密度的百分比（%）表示。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠運(yùn)動(dòng)行為、刻板行為評(píng)分比較 造模后第7天，模型大鼠的運(yùn)動(dòng)行為和刻板行為評(píng)分均高于正常組（P＜0.01）。給藥7 d后，與模型組相比，止抽湯組和鹽酸硫必利組的刻板行為評(píng)分明顯下降（P＜0.01），而運(yùn)動(dòng)行為評(píng)分無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.59，P=0.29），止抽湯組和鹽酸硫必利組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.59，P=1.00）。給藥14 d后，與模型組相比，止抽湯組和鹽酸硫必利組的運(yùn)動(dòng)行為和刻板行為評(píng)分顯著降低（P＜0.01），而止抽湯組和鹽酸硫必利組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.30，P=0.11）。見(jiàn)表1、表2。

表1 各組大鼠運(yùn)動(dòng)行為評(píng)分比較（±s，n=6）

表1 各組大鼠運(yùn)動(dòng)行為評(píng)分比較（±s，n=6）

注：與正常組比較，#P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.01。

組別 造模后 用藥7 d后 用藥1 4 d后正常組 0.0 0±0.0 0 0.0 0±0.0 0 0.0 0±0.0 0模型組 3.5 0±0.5 5# 3.5 0±0.5 5# 3.6 7±0.5 2#鹽酸硫必利組 3.6 7±0.5 2# 3.3 3±0.5 2#△ 2.6 7±0.5 2#△止抽湯組 3.5 0±0.5 5# 3.1 7±0.7 5#△ 2.3 3±0.8 2#△

表2 各組大鼠刻板行為評(píng)分比較（±s，n=6）

表2 各組大鼠刻板行為評(píng)分比較（±s，n=6）

注：與正常組比較，#P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.01。

組別 造模后 用藥7 d后 用藥1 4 d后正常組 0.6 7±0.5 2 0.1 7±0.4 1 0.1 7±0.4 1模型組 3.5 0±0.8 4# 3.6 7±0.5 2# 3.3 3±0.5 2#鹽酸硫必利組 3.6 7±0.5 2# 2.8 3±0.4 1#△ 2.6 7±0.5 2#△止抽湯組 3.6 7±0.8 2# 2.8 3±0.4 1#△ 2.0 0±1.1 0#△

3.2 血清TNF-α、IL-6、IL-1β的結(jié)果比較 模型組血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平明顯高于正常組（P＜0.01）。與模型組相比，止抽湯組、鹽酸硫必利組明顯下降（P＜0.01）。止抽湯組與鹽酸硫必利組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.46、P=0.32、P=0.07）。見(jiàn)表 3。

表3 大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平比較（x± s，n=6）

3.3 紋狀體 TNF-α、IL-6、IL-1βmRNA表達(dá)水平及蛋白表達(dá)比較 各組大鼠紋狀體TNF-α、IL-6、IL-1βmRNA表達(dá)水平，模型組明顯高于正常組（P＜0.05）。與模型組比較，止抽湯組、鹽酸硫必利組明顯下降（P＜0.01）。止抽湯組與鹽酸硫必利組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.59、P=0.59、P=0.21）。見(jiàn)表 4。

表4 大鼠紋狀體TNF-α、IL-6、IL-1βmRNA表達(dá)水平比較（x± s，n=6）

大鼠紋狀體TNF-α、IL-6、IL-1β的蛋白表達(dá)水平，模型組明顯高于正常組（P＜0.05）。與模型組比較，止抽湯組、鹽酸硫必利組明顯下降（P＜0.01）；止抽湯組與鹽酸硫必利組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.33、P=0.51、P=0.44）。見(jiàn)表 5。

表5 大鼠紋狀體TNF-α、IL-6、IL-1β的蛋白表達(dá)水平比較（x± s，n=6）

4 討論

Diamond等[14]首次提出IDPN造?？沙晒φT發(fā)出大鼠抽動(dòng)行為，以后陸續(xù)為國(guó)內(nèi)外研究者所采用，成為研究本病最常用的造模方法[15]。本實(shí)驗(yàn)中，IDPN也成功誘導(dǎo)出大鼠抽動(dòng)行為，模型大鼠血清、紋狀體TNF-α、IL-6、IL-1β表達(dá)明顯增高，提示腹腔注射IDPN構(gòu)建TD大鼠模型可誘導(dǎo)大鼠免疫功能紊亂，從而介導(dǎo)TD的發(fā)病，與同類研究的報(bào)道一致[16]。

細(xì)胞因子不僅是調(diào)節(jié)免疫炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵分子，在外周免疫系統(tǒng)和大腦之間的雙向信號(hào)傳導(dǎo)中起著至關(guān)重要的中介作用[17]。研究發(fā)現(xiàn)，大量的TNF-α對(duì)神經(jīng)內(nèi)分泌免疫有不良影響，并對(duì)基底神經(jīng)節(jié)造成損害。若基底神經(jīng)節(jié)受損，會(huì)影響多巴胺、乙酰膽堿、γ-氨基丁酸、β-內(nèi)啡肽等神經(jīng)遞質(zhì)的釋放和傳遞，產(chǎn)生一系列不自主的運(yùn)動(dòng)行為障礙，從而影響TD的發(fā)生發(fā)展[7]。IL-6由神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中起神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的作用[18]。它與神經(jīng)遞質(zhì)有關(guān)，能顯著增加海馬和額葉中的5-羥色胺和多巴胺的活性[19]。IL-1β是一種促炎癥細(xì)胞因子，參與組織破壞或水腫，可引起DA神經(jīng)元凋亡和壞死，能激活DA神經(jīng)元退變受體[20]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示TD模型大鼠存在細(xì)胞因子異常，以血清及紋狀體TNF-α、IL-6、IL-1β表達(dá)明顯增高為特點(diǎn)。

藥物干預(yù)后，止抽湯組大鼠抽動(dòng)癥狀減少，血清及紋狀體TNF-α、IL-6、IL-1β水平明顯下降。推測(cè)止抽湯可通過(guò)抑制以上促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，減少炎癥介質(zhì)釋放，減輕TD神經(jīng)炎癥和腦神經(jīng)元損傷，進(jìn)而影響神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺、5-羥色胺、γ-氨基丁酸等的釋放，從而控制抽動(dòng)癥狀。國(guó)內(nèi)張夢(mèng)嬌等[20]報(bào)道玉屏風(fēng)散通過(guò)降低炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β的表達(dá)，減輕大鼠抽動(dòng)癥狀，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。而高漢媛等[21]研究顯示TD模型大鼠腦組織IL-6含量變化不明顯，提示復(fù)方中藥對(duì)TD的神經(jīng)免疫功能有調(diào)控作用，但可能由于復(fù)方組成藥物不同，具有多途徑、多靶點(diǎn)、整體調(diào)節(jié)作用特點(diǎn)，因此研究結(jié)果也有所不同。

綜上，本研究證實(shí)TD模型大鼠存在細(xì)胞因子的異常，神經(jīng)炎癥是本病的重要致病因素。止抽湯改善TD大鼠抽動(dòng)行為與降低血清及紋狀體TNF-α、IL-6、IL-1β的高表達(dá)有關(guān)。但止抽湯調(diào)節(jié)外周和中樞炎癥的具體機(jī)制如何，通過(guò)什么途徑影響相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，仍需進(jìn)一步研究。