劉雙雙，肖桂鳳，洪曉黎，沈 逸

浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 310058

基礎(chǔ)生物醫(yī)學(xué)的研究主要集中在細(xì)胞、組織和模式生物中的復(fù)雜動(dòng)態(tài)過程，這些過程發(fā)生在不同的時(shí)間和空間尺度范圍內(nèi)，其研究方向包括器官的發(fā)育和功能的變化、細(xì)胞內(nèi)離子介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)、囊泡和蛋白質(zhì)運(yùn)輸過程等。激光掃描共聚焦顯微鏡在解決這些問題方面起著舉足輕重的作用[1,2]。通常采用的XY或XYZ掃描方式實(shí)現(xiàn)了高分辨生物結(jié)構(gòu)的可視化，但是高分辨率主要指的是空間分辨率，時(shí)間分辨率仍然落后于許多生物動(dòng)態(tài)過程的速度。

為了實(shí)現(xiàn)快速共聚焦顯微成像，通常采用高速掃描裝置[3](如共振振鏡)或者多光束掃描裝置(Nipkow Spinning disk)[4,5]，然而這些系統(tǒng)的靈敏度和分辨率較低，速度也只能達(dá)到每秒幾百幀，仍然達(dá)不到高分辨快速成像的要求。激光掃描共聚焦顯微鏡的XT線掃描方式是對同一條線段重復(fù)掃描，檢測一段時(shí)間里熒光信號的快速變化，XT線掃描方式能夠達(dá)到每秒上千幀的掃描速度，解決了生命科學(xué)研究中追蹤快速事件的難題。但有些品牌的共聚焦顯微鏡進(jìn)行XT線掃描時(shí)，掃描方向無法識別。掃描方向不確定，則無法判斷熒光信號的具體定位及快速移動(dòng)信號的方向，限制了對諸多現(xiàn)象的深入研究。本研究建立了一套確定XT線掃描方向的實(shí)用方法，詳細(xì)闡述了Zeiss、Nikon 和Olympus 共聚焦顯微鏡XT線掃描模式的具體操作方法及線掃描方向的差異。

1 制作熒光小球樣品

以熒光筆制成熒光小球作為研究對象。利用紅色(或綠色)熒光筆在顯微鏡專用的活細(xì)胞培養(yǎng)皿底部畫1～2條線段，為避免熒光小球發(fā)生重疊，線段不宜過多。加入1 mL純凈水，輕輕搖晃培養(yǎng)皿，將劃線區(qū)域的熒光粉溶解，形成單個(gè)分散的熒光小球溶液，靜止10 min后，熒光小球貼于培養(yǎng)皿底。將培養(yǎng)皿放置到共聚焦顯微鏡載物臺上，利用60XO或者63XO物鏡進(jìn)行顯微成像(圖1)。

圖1 熒光小球樣本制作和熒光小球XY二維圖像(物鏡：60XO)A.熒光小球樣本制作;B.熒光小球XY圖像

2 建立線掃描方向識別技術(shù)

共聚焦顯微鏡線掃描模式通常與T時(shí)間序列結(jié)合使用，稱為XT線掃描。有些品牌的共聚焦顯微鏡沒有標(biāo)注掃描方向，從圖像上也無法直接識別。為了確定線掃描方向，以熒光小球?yàn)檠芯繉ο螅紫炔杉粡垷晒庑∏騒Y二維圖像，然后經(jīng)過熒光球畫出不同方向的掃描線段，分別為水平、垂直、斜向上、斜向下，其中線段的一端靠近熒光球，另一端則遠(yuǎn)離熒光球，最后對上述線段進(jìn)行時(shí)間序列掃描獲得XT線掃描圖像，其中線掃描圖像的X軸為經(jīng)過小球畫出的線段，Y軸為時(shí)間，熒光信號為位于熒光小球內(nèi)的線段部分。

線掃描圖像的左端為掃描起始端，判斷XY二維圖像中掃描線段的掃描方向關(guān)鍵在于確定線掃描圖像左端對應(yīng)的掃描線段的位置。根據(jù)線掃描圖像靠近熒光信號的一邊對應(yīng)XY二維圖像中靠近熒光球的線段端，可以判斷圖2中：掃描線為水平線時(shí)，掃描方向?yàn)閺淖筮叺接疫?；掃描線為垂直線時(shí)，掃描方向?yàn)閺南露说缴隙?；掃描線段為斜向下時(shí)，掃描方向?yàn)閺淖笊隙说接蚁露?；掃描線段為斜向上時(shí)，掃描方向?yàn)閺淖笙碌接疑?圖2)。

圖2 確定共聚焦顯微鏡線掃描方向的示意圖

3 不同品牌共聚焦顯微鏡XT線掃描技術(shù)的建立

3.1 Olympus激光共聚焦顯微鏡XT線掃描技術(shù)

(1)XT線掃描圖像的采集：紅色熒光筆制作熒光小球，利用Olympus 共聚焦顯微鏡FV10-ASW軟件采集圖像。選擇543激光器激發(fā)紅色熒光小球，檢測器接收范圍為560～660。通過Focus x2預(yù)覽圖像，調(diào)節(jié)焦面、激光通過率和光電倍增管電壓值等參數(shù)，采集一張XY二維圖像。選擇【line】掃描方式，掃描速度設(shè)為10 μs/pixel，線掃描時(shí)，【Time】默認(rèn)為選中狀態(tài)，【TimeScan】選擇FreeRrun，【Num】選擇200～2000。經(jīng)過熒光球畫出不同方向的線段，分別為水平線、垂直線、斜向上線、斜向下線，其中線段的一端靠近熒光球，另一端則遠(yuǎn)離熒光球，點(diǎn)擊【capture】獲取XT線掃描圖像。

(2)線掃描方向的確定：Olympus共聚焦顯微鏡在進(jìn)行線掃描時(shí)，軟件沒有標(biāo)注掃描方向，也無法直接識別。對上述線段進(jìn)行XT線掃描，線掃描圖像中靠近熒光線的一端對應(yīng)XY圖像中靠近熒光球的線段末端。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：掃描線段為水平線時(shí)，掃描方向?yàn)閺木€段的左端到右端；掃描線段為垂直線時(shí)，掃描方向?yàn)閺木€段下端到上端；線掃描線段為斜向上時(shí)，掃描方向從左下端到右上端。掃描線段為斜向下時(shí)，掃描方向從右上到左下(圖3)，當(dāng)所畫線段的起點(diǎn)與上述線段起點(diǎn)相反時(shí)，線掃描方向仍然保持不變。

圖3 Olympus共聚焦顯微鏡線掃描方向的確定A1、B1、C1、D1是熒光球的XY二維圖像，A2、B2、C2、D2是掃描線段的XT圖像

3.2 Zeiss激光共聚焦顯微鏡XT線掃描技術(shù)

(1)XT線掃描圖像采集：綠色熒光筆制作熒光小球，利用Zeiss 880共聚焦顯微鏡Zen Black軟件采集XT線掃描圖像。設(shè)置光路，選擇488激光器激發(fā)熒光小球，檢測器接收范圍為500～550，點(diǎn)擊live預(yù)覽圖像，調(diào)節(jié)激光強(qiáng)度和Gain，獲取XY二維圖像。設(shè)置XT線掃描參數(shù)，選中【Time Series】，設(shè)置Interval為0，cycles為200～2000?！維can Mode】選擇line，選擇線段按鈕【Line select】，經(jīng)過小球畫出不同方向的線段，點(diǎn)擊【Start Experiment】獲取線掃描圖像。

(2)掃描方向的確定：Zeiss共聚焦顯微鏡在進(jìn)行線掃描時(shí)，軟件標(biāo)注了掃描方向，可以直接識別。同樣利用熒光小球畫出上述4種線段，對線段進(jìn)行XT線掃描。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：所畫線段的箭頭方向即為掃描方向，即從所畫線段的起始點(diǎn)到終點(diǎn)的方向進(jìn)行掃描(圖4)，所以Zeiss共聚焦顯微鏡線掃描方向與所畫線段的起始點(diǎn)有關(guān)。

圖4 Zeiss共聚焦顯微鏡線掃描方向的確定A1、B1、C1、D1是熒光球的XY二維圖像，A2、B2、C2、D2是掃描線段的XT圖像

3.3 Nikon激光共聚焦顯微鏡線掃描技術(shù)的建立

(1)XT線掃描圖像采集：綠色熒光筆制作熒光小球，利用Nikon A1R共聚焦顯微鏡NIS-Element軟件采集圖像。選擇488激光器激發(fā)綠色熒光小球，檢測器接收范圍為500～550。設(shè)置掃描參數(shù)，采集一張XY二維圖像；【ND Acquisition】窗口選擇Time，【Interval】設(shè)置為No delay，【loop】設(shè)置為200～2000；【Alplus Scan Area】窗口選擇line scan area，經(jīng)過小球分別畫出上述4種線段，點(diǎn)擊run now采集XT圖像。

(2)掃描方向的確定：Nikon A1R共聚焦顯微鏡進(jìn)行線掃描時(shí)，軟件沒有標(biāo)注掃描方向。對上述線段進(jìn)行XT線掃描后，根據(jù)熒光線與兩邊距離的遠(yuǎn)近，識別線掃描圖像X軸兩端對應(yīng)掃描線段的兩端位置。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：掃描線段為水平線時(shí)，掃描方向?yàn)閺木€段的左端到右端；掃描線段為垂直線時(shí)，掃描方向?yàn)閺木€段上端到下端；掃描線段為斜向上時(shí)，掃描方向從左下端到右上端；掃描線段為斜向下時(shí)，掃描方向從左上到右下(圖5)。利用Nikon共聚焦顯微鏡進(jìn)行XT線掃描時(shí)，掃描方向與掃描線段的起始點(diǎn)無關(guān)，與斜線傾斜角度也無關(guān)。

圖5 Nikon共聚焦顯微鏡線掃描方向的確定A1、B1、C1、D1是熒光球的XY二維圖像，A2、B2、C2、D2是掃描線段的XT圖像

4 XT線掃描技術(shù)在腦血管中的應(yīng)用

XT線掃描模式能夠快速捕捉移動(dòng)信號隨時(shí)間的變化情況，如腦內(nèi)紅細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)。小鼠尾靜脈注射熒光染料fluorescein isothiocyanate-dextran (FITC-dextran)，經(jīng)血液循環(huán)到達(dá)全身血管。FITC染料僅能標(biāo)記血漿而不進(jìn)入紅細(xì)胞，血漿被激發(fā)后發(fā)出綠色熒光，紅細(xì)胞呈現(xiàn)黑色暗影。沿著血管管腔中心畫一條掃描線，利用激光掃描共聚焦顯微鏡(或雙光子顯微鏡)對血流進(jìn)行XT線掃描，紅細(xì)胞隨著時(shí)間的變化形成黑色條紋運(yùn)動(dòng)軌跡，其中線掃描圖像中X軸為紅細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)距離，Y軸為掃描時(shí)間(圖6)。每一條黑色條紋代表一個(gè)紅細(xì)胞，根據(jù)紅細(xì)胞單位時(shí)間內(nèi)的運(yùn)動(dòng)距離可計(jì)算血流速度。

圖6 XT線掃描在腦血管中的應(yīng)用A.腦血管二維圖像;B.XT線掃描圖像

5 討論

激光掃描共聚焦顯微鏡通過對細(xì)胞或生物個(gè)體高分辨率可視化檢測其結(jié)構(gòu)和功能的變化，在生命科學(xué)研究中有著重要作用。共聚焦顯微鏡的XT線掃描模式通過對一條線段進(jìn)行重復(fù)掃描，捕捉這條掃描線段上熒光信號的變化，可以達(dá)到1 kHz的掃描速度，為細(xì)胞內(nèi)的快速事件研究開創(chuàng)了新思路。XT線掃描具有以下優(yōu)勢：采集圖像的時(shí)間分辨率高；能夠同時(shí)可視化完整的細(xì)胞個(gè)體和熒光信號的快速動(dòng)態(tài)變化；對共聚焦顯微鏡硬件配置無特殊要求，活細(xì)胞時(shí)間序列掃描模式雖然能夠跟蹤熒光信號的動(dòng)態(tài)變化，但需要配備自動(dòng)聚焦系統(tǒng)和活細(xì)胞培養(yǎng)裝置[6]。

目前，XT線掃描技術(shù)已在腦微循環(huán)[7-9]、離子信號[10,11]研究中得到應(yīng)用。但是很多商業(yè)化的共聚焦顯微鏡沒有指示線掃描方向，也無法直接識別。本研究利用熒光小球建立了識別線掃描方向的方法，用于已具有掃描方向的共聚焦顯微鏡后，發(fā)現(xiàn)本方法得到的結(jié)果與顯微鏡線掃描指示方向一致，如Zeiss共聚焦顯微鏡。對于沒有指示掃描方向的共聚焦顯微鏡，如Olympus和Nikon共聚焦顯微鏡，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Olympus和Nikon共聚焦顯微鏡在水平線和斜線中的掃描方向一致，水平線為從掃描線的左端到右端，斜線都是從斜線的左側(cè)到右側(cè)，垂直線則不同，Olympus為從掃描線下端到上端，Nikon為從掃描線上端到下端。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn),沒有指示掃描方向的共聚焦顯微鏡，線掃描方向與所畫掃面線起始點(diǎn)無關(guān)，這一點(diǎn)與有指示掃描方向的共聚焦顯微鏡不同。

本研究建立的線掃描方向識別方法，簡單易操作，且具有普適性，不僅適用于上述品牌激光掃描共聚焦顯微鏡，還適用于其他品牌，同時(shí)，也適用于雙光子顯微鏡，希望本研究能為顯微成像相關(guān)研究提供一定的參考。