葉合敏,黃 楠,孫廷宇,侯 偉,白 晉,李樺楠

超聲醫(yī)學(xué)工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室//重慶醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院,重慶400016

高強(qiáng)度聚焦超聲(HIFU)腫瘤治療系統(tǒng),是將體外低能量超聲波聚焦于體內(nèi)靶區(qū),在腫瘤內(nèi)產(chǎn)生瞬態(tài)高溫(60 ℃以上)、空化、機(jī)械作用等生物學(xué)效應(yīng),使靶區(qū)內(nèi)的腫瘤組織發(fā)生凝固性壞死［1］。然而,由于超聲傳播過(guò)程中能量的衰減,造成焦域內(nèi)能量沉積不足,導(dǎo)致HIFU治療腫瘤存在消融不全面、不能徹底消除殘留腫瘤細(xì)胞的問(wèn)題［2-5］。

近年來(lái),利用納米粒改變組織聲場(chǎng)用于HIFU增效和聯(lián)合治療成為當(dāng)下研究的熱點(diǎn)［3-4,6］。傳統(tǒng)的HIFU增效劑(SAs)如微泡(MBs),體積較大,僅允許腫瘤微血管內(nèi)循環(huán),不能滲透腫瘤組織內(nèi)部［7］。同時(shí),由于微泡穩(wěn)定性差、體內(nèi)半衰期短,使得空化控制困難、沿聲束路徑組織損傷［8］。為了解決這些問(wèn)題,研究人員通過(guò)引入精心設(shè)計(jì)的有機(jī)/無(wú)機(jī)載藥納米粒(NPs)［9-11］改變腫瘤組織的聲環(huán)境并將藥物攜入腫瘤組織,從而增強(qiáng)HIFU療效。例如,氟碳納米粒作為高強(qiáng)度聚焦超聲(HIFU)增效劑已被廣泛研究［7,12］,但通常需要外部的激發(fā)產(chǎn)生氣泡進(jìn)而對(duì)腫瘤進(jìn)行增效治療,且增效持續(xù)性不如內(nèi)源性產(chǎn)生的氣泡持久［13-14］。其次,脂質(zhì)體、膠束等有機(jī)納米粒的體內(nèi)循環(huán)周期短［15］,無(wú)機(jī)納米粒普遍具有毒副作用且生物降解較差［13］。有研究表明,直接使用化療藥物通過(guò)無(wú)機(jī)和有機(jī)組分間的配位作用構(gòu)建金屬有機(jī)納米粒［16-18］具有尺寸分布可控、骨架可調(diào)節(jié)、高載藥率等［19-22］獨(dú)特優(yōu)勢(shì),并在藥物遞送、光熱療法和醫(yī)學(xué)成像等方面顯示出巨大的潛力［4,7,16-17］。

本研究通過(guò)物理吸附將葡萄糖氧化酶(GOD)、二氧化錳(MnO2)、三價(jià)鐵離子(Fe3+)、化療藥物鹽酸阿霉素(DOX·HCl)制備成金屬有機(jī)納米粒GOD-MnO2-Fe3+-DOX(GMFD NPs)。該納米粒在體內(nèi)循環(huán)中可穩(wěn)定存在,并通過(guò)高通透性和滯留效應(yīng)(EPR)在腫瘤組織大量聚集,受到腫瘤弱酸性微環(huán)境刺激后解離,從而實(shí)現(xiàn)藥物的有效釋放［23］。在HIFU治療過(guò)程中,該納米粒解離釋放的MnO2可在腫瘤弱酸性條件下與原位產(chǎn)生的H2O2反應(yīng),產(chǎn)生O2以增效HIFU治療。同時(shí),GMFD NPs解離釋放的GOD可消耗腫瘤部位的葡萄糖產(chǎn)生的H2O2進(jìn)一步促進(jìn)O2的產(chǎn)生,釋放的DOX可治療HIFU消融后殘余的腫瘤細(xì)胞。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑 聚烯丙胺鹽酸鹽[PAH(15 k Da)]、鹽酸阿霉素(DOX)、葡萄糖氧化酶(GOD)、二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司(Sigma-Aldrich)。磷酸鹽緩沖液(PBS)、透析袋(分子量為3.5 kDA)購(gòu)自重慶奧怡生物科技有限公司。FeCl3·6H2O、KMnO4由重慶醫(yī)科大學(xué)設(shè)備處提供。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 磁力攪拌器(B13-3,上海沉匯儀器有限公司)、萬(wàn)分之一天平、超聲波破碎儀(YCY-500,上海研永超聲設(shè)備有限公司)、超聲波清洗儀、高速離心機(jī)(H3-18K,湖南可成儀器設(shè)備有限公司)和紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(Nanodrop 2000/2000C,美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司)、Milli-Q超純水儀(上海摩速科學(xué)器材有限公司)、溶氧儀YSI 550A(成都銳新儀器儀表有限公司)由超聲醫(yī)學(xué)工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。透射電子顯微鏡(JEM-1400PLUS)由重慶醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)研究院公共平臺(tái)提供的。超高速離心機(jī)(SorvallTMWX+,Thermo Fisher Scientific)和馬爾文激光粒度儀(Zeta SIZER 3000HS,USA)由重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院公共平臺(tái)提供。X射線光電子能譜(XPS)儀(ESCALAB250Xi,Thermo Fisher Scientific)由重慶大學(xué)分析測(cè)試中心提供。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 人HepG2肝癌細(xì)胞購(gòu)自上海富衡生物科技有限公司。將細(xì)胞培養(yǎng)在在10%胎牛血清(FBS)、90%DMEM 培養(yǎng)基、1%青霉素-鏈霉素抗生素中于37 ℃,5%CO2孵箱培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到70%～80%時(shí),對(duì)細(xì)胞以1∶2～3傳代并進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雌性裸鼠,4～6周齡,體質(zhì)量17～23 g,購(gòu)于重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。動(dòng)物飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)均遵循動(dòng)物保護(hù)組織的相關(guān)規(guī)定以及重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心的使用規(guī)范。將HepG2細(xì)胞(0.2 mL,PBS中1.5×107z/mL)注射到裸鼠背部的皮下組織中以建立腫瘤模型。

1.2 方法

1.2.1 MnO2納米粒的合成 通過(guò)直接混合高錳酸鉀(KMnO4)和聚電解質(zhì)(PAH)水溶液制備MnO2納米粒［24］。具體方法如下:4.99×10-3mmolPAH(74.8mg,2mL,37.4 mg/mL)水溶液與0.40 mmol KMnO4水溶液(63 mg,18 mL,3.5 mg/mL)混合,在室溫下攪拌反應(yīng)15 min。然后用超高速離心機(jī)離心1 h(41 k r/min)并用超純水洗滌3次,離心結(jié)束后取出置于50 mL離心管中。用超聲波破碎儀作用1 h(on 9.9 s,off 2 s,30 min/次,2次),然后儲(chǔ)存于4 ℃待用。通過(guò)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(UV-Vis)特征峰分布及X射線光電子能譜儀分析反應(yīng)產(chǎn)物的XPS 能譜證明MnO2納米粒子的合成,用激光粒度儀(DLS)研究MnO2納米粒子的粒徑。為了測(cè)試MnO2生成O2的能力,向MnO2溶液(棕色)中加入H2O、H+和H2O2,觀察各離心管中的現(xiàn)象；在等量MnO2溶液中添加不同濃度的H2O2后,用溶氧儀檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)的O2濃度以評(píng)估氧氣的產(chǎn)生。

1.2.2 GMFD NPs的構(gòu)建 GOD和MnO2通過(guò)物理吸附形成不穩(wěn)定絮狀物,再與Fe3+形成穩(wěn)定的網(wǎng)格狀復(fù)合物(GOD-MnO2-Fe3+),隨后將化療藥物DOX·HCl進(jìn)一步與GOD-MnO2-Fe3+網(wǎng)格狀復(fù)合物反應(yīng),通過(guò)DOX·HCl去質(zhì)子化由親水性轉(zhuǎn)化為疏水性,使反應(yīng)體系不斷壓縮形成致密的球狀納米粒子［23］。具體方法如下:先取1 mL MnO2(10 mg/mL)(0.115 mmol)與1 mL GOD(2 mg/mL)混合于15 mL離心管中,超聲清洗儀作用15 min后離心5 min(10 000 r/min),去上清,沉淀用1 mL水重懸。然后取28.96 mg(0.107 mmol)Fecl3·6H2O溶于1 mL水中,超聲助溶后加入GOD-MnO2混合物中,用超聲清洗儀作用15 min,然后移入小棕瓶中攪拌反應(yīng)45 min。最后稱(chēng)取10 mg DOX ·HCl超聲作用下溶于1 mL 水中,劇烈攪拌(700 r/min 以上)下加入GODMnO2-Fe3+混合液中,攪拌反應(yīng)2 h,靜置過(guò)夜。次日取出反應(yīng)產(chǎn)物,用去離子水透析(3500 MW)30 min,每15 min換一次水,然后放4 ℃冰箱保存?；?qū)a(chǎn)物取出,真空冷凍干燥36 h,然后放4 ℃冰箱保存。

1.2.3 GMFD NPs的表征以及體外藥物釋放行為的研究

1.2.3.1 GMFD NPs 的基本理化性質(zhì) 用透射電鏡(TEM)和激光粒度儀(DLS)研究GMFD NPs的形態(tài)、粒徑。

1.2.3.2 GMFD NPs中的DOX的載藥量和包封率 分別取0.2 mLGMFD NPs原液+0.2 mL稀HCL溶液+0.8 mL DMSO,放至恒溫?fù)u床,37 ℃,100 r/min 搖晃至少2 h,然后用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(UV-Vis)檢測(cè)485 nm處的吸光度A485nm,并通過(guò)以下公式求出包封率、載藥率［25］。

W1代 表GMFD NPs 內(nèi)DOX 的 含 量,W2代 表GMFD NPs的總量,W3代表制備GMFD NPs所投入的DOX的總量。

1.2.3.3 GMFD NPs 體外藥物釋放實(shí)驗(yàn) 配置pH=2、pH=7.4的去離子水溶液,每組3個(gè)平行樣。分別取1 mL GMFD NPs放入透析袋(3.5 k DA)中,用透析夾封口,將25 mL pH=2、pH=7.4 的水溶液倒入100 mL燒杯中,每個(gè)燒杯加入2 mL DMSO,再將裝有GMFD NPs的透析袋放入燒杯中,將燒杯放至恒溫?fù)u床,37 ℃,100 r/min搖晃。分別于0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、5、6、8、24、48 h時(shí)間點(diǎn)從燒杯中取樣5 μL,每個(gè)樣本取6次,并補(bǔ)充等量對(duì)應(yīng)的溶液。采用紫外分光光度計(jì)測(cè)量在485 nm處的吸光值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組的濃度和藥物累積釋放量,分別計(jì)算各組在不同時(shí)間點(diǎn)的DOX 累積釋放率(%),繪制時(shí)間-藥物累積釋放率曲線。

1.2.4 GMFD NPs體外與腫瘤細(xì)胞相互作用的研究

1.2.4.1 GMFD NPs 體外細(xì)胞毒性的測(cè)定 首先將HepG2細(xì)胞以104/孔接種到96孔板中,然后37 ℃,5%CO2孵箱培養(yǎng)24 h。然后配置含不同濃度(100、10、1、0.1、0.01、0 μg/mL)的DOX·HCl、GMFD NPs的DMEM培養(yǎng)基,加入孔中并共培養(yǎng)24 h。最后除去舊培養(yǎng)基,每孔加入0.1 mL 含CCK-8(5 mg/mL)的培養(yǎng)基,培養(yǎng)3 h后每孔用0.1 mL DMEM 培養(yǎng)基替換舊培養(yǎng)基,并通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)吸光度值A(chǔ)450nm,通過(guò)以下公式求出細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率(%)=[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100%

As:實(shí)驗(yàn)孔(含有細(xì)胞的培養(yǎng)基、CCK-8、藥物)

Ac:對(duì)照孔(含有細(xì)胞的培養(yǎng)基、CCK-8、沒(méi)有藥物)

Ab:空白孔(不含細(xì)胞的藥物的培養(yǎng)基、CCK-8)。

1.2.4.2 GMFD NPs細(xì)胞攝取的評(píng)估 首先在HepG2細(xì)胞長(zhǎng)到約70%后接種到35 mm×12 mm激光共聚焦細(xì)胞培養(yǎng)皿(Glass Bottom Cell Culture Dish,Φ20 mm)中,在37 ℃,5%CO2孵箱培養(yǎng)24 h。然后將原始培養(yǎng)基替換為含有DOX、GMFD NPs的培養(yǎng)基(濃度為DOX含量等效10 μg/mL)再培養(yǎng)4 h。最后用PBS沖洗2次,加200～400 μL Hoechst33342(Ex/Em=346 nm/460 nm)細(xì)胞核染料染色7 min,染色結(jié)束后,用PBS洗2次,并加1 mL PBS,在激光共聚焦顯微鏡(CLSM)下觀察GMFD NPs進(jìn)入細(xì)胞的情況。

1.2.5 GMFD NPs體內(nèi)安全性研究

1.2.5.1 GMFD NPs體外生物相容性研究 首先將健康雌性BALB/c小鼠眼眶取血,提取紅細(xì)胞后與不同濃度的GMFD NPs共孵育4 h,觀察紅細(xì)胞溶血率,檢測(cè)體內(nèi)生物安全性。

1.2.5.2 GMFD NPs體內(nèi)生物安全性評(píng)估 首先將健康雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分為3組(3只/組):A組(生理鹽水組)、B組(DOX組)、C組(GMFD NPs組)。然后每3 d(1、4、7、10 d)注射1次藥物(DOX等量10 mg/kg)。最后一次打藥后隔天眼眶取血,檢測(cè)血常規(guī)各項(xiàng)指標(biāo):白細(xì)胞(WBC)、紅細(xì)胞(RBC)、紅細(xì)胞平均體積(MCV)、平均血紅蛋白量(MCH)。

1.2.5.3 GMFD NPs體內(nèi)藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究 首先將6只體質(zhì)量為180～220 g SD大鼠進(jìn)行隨機(jī)分為2組,分別為:A組(DOX組)、B組(GMFD NPs組)。大鼠尾靜脈分別注射1 mL各組藥(DOX等量10 mg/kg),分別在給藥后0.5、1、2、4、8、24 h進(jìn)行眼眶取血約0.5 mL。取出的血樣置于1.5 mL 含肝素鈉的抗凝血離心管中,在4 ℃,4000 r/min條件下離心10 min,取上清液0.1 mL加入0.8 mL的乙腈中,再次于4 ℃,4000 r/min條件下離心10 min,采用紫外分光光度法測(cè)得不同時(shí)間點(diǎn)血漿中的藥物濃度,繪制藥代動(dòng)力學(xué)曲線以評(píng)價(jià)循環(huán)半衰期。

1.2.5.4 GMFD NPs增效HIFU治療的實(shí)驗(yàn)研究 將12只HepG2 荷瘤裸鼠(腫瘤直徑約10 mm)隨機(jī)分為2組,每組6 只,分為生理鹽水+HIFU 和GMFD NPs+HIFU 組(注射劑量為0.2 mL,DOX 的標(biāo)準(zhǔn)濃度為10 mg/kg)。經(jīng)尾靜脈注射給藥4 h后以1%戊巴比妥鈉腹腔麻醉裸鼠,對(duì)其腫瘤部位進(jìn)行HIFU 定點(diǎn)消融。HIFU 治療參數(shù):治療聲功率為90 W,治療總時(shí)間為3 s。然后觀察輻照前后腫瘤消融后超聲灰度值變化,并用自帶Gray Val 1.0 軟件計(jì)算靶區(qū)灰度變化值。在HIFU治療結(jié)束后第1天,各組分別處死6只裸鼠,完整分離腫瘤組織,沿超聲聲束方向切開(kāi)腫瘤,浸入37 ℃恒溫水浴的2%TTC溶液中避光染色30 min。采用不規(guī)則體積測(cè)量軟件HifuJupiter F計(jì)算各組凝固性壞死體積(Volume of coagulative necrosis,V),并根據(jù)公式計(jì)算能效因子(EEF),EEF代表HIFU 消融單位體積的腫瘤所需超聲能量。式中η為超聲換能器聚焦系數(shù),本實(shí)驗(yàn)所用儀器η=0.7；P為輻照總聲功率(W)；T 為輻照總時(shí)間(s)；V 為凝固性壞死體積(mm3)。EEF 值越小,代表HIFU 消融效率越高。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所得結(jié)果進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)及單因素方差分析,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,用Origin 8做圖,以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MnO2 NPs的表征

反應(yīng)前KMnO4對(duì)應(yīng)的315 nm、525 nm和545 nm3個(gè)特征峰消失,出現(xiàn)了300 nm附近的MnO2寬平坦峰(圖1)。分析產(chǎn)物的XPS光譜及XPS多重軌道光譜,出現(xiàn)C、N、O、Mn 等元素對(duì)應(yīng)的峰值,在653.1 eV 和641.4 eV處觀察到Mn 2p1/2、Mn 2p3/2兩個(gè)特征峰(圖2)。在將H2O2加入到MnO2溶液中后,產(chǎn)生了明顯的氣泡,而且在繼續(xù)添加H2O2后,離心管中溶液顏色有棕色變?yōu)闊o(wú)色。而添加H+和H2O后的MnO2溶液沒(méi)有明顯的變化(圖3)。在MnO2溶液中添加不同濃度的H2O2后,添加H2O2的MnO2組溶解O2濃度始終高于對(duì)照組,隨著H2O2濃度的升高O2濃度隨之升高,即使在模擬微環(huán)境的50 μmol/L 極低濃度的H2O2中也能產(chǎn)生O2(圖4)。

圖1 KMnO4和MnO2的紫外可見(jiàn)吸收光譜Fig.1 UV-Vis absorption spectrum of KMnO4 and MnO2.

圖2 MnO2 NPs的XPS光譜(A)和XPS多重軌道光譜(B)Fig.2 XPS spectrum(A)and XPS multiorbital spectrum(B)of MnO2 NPs.

圖3 MnO2溶液添加H2O2、H+和H2O前后現(xiàn)象Fig.3 MnO2 solution before(A)and after(B)addition of H2O2,H+and H2O.

圖4 MnO2與不同濃度H2O2作用產(chǎn)氧情況Fig.4 Oxygen production of MnO2 in the presence of 50,100 and 400 μmol/LH2O2.

2.2 GMFD NPs的理化表征及體外藥物釋放行為的研究

通過(guò)激光衍射粒度分析儀(DLS)測(cè)得的水溶液中GMFD NPs 各組成成分分別為:GOD 粒徑約為8.71 nm,電位約為-5.56 mV；MnO2粒徑約為45.75±1.99 nm,電位約為35.99±2.81 mV；GOD-MnO2(GM)粒徑約為179 nm,電位約為-4.69 mV,而合成的GMFD NPs粒徑約為131.23±0.84 nm,表面電位為21.87±1.72 mV,GMFD NPs 大小分散均一,呈圓球形,粒徑大約為150 nm(圖5～6)。用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(UV-Vis)測(cè)得GMFD NPs負(fù)載DOX的載藥率為40.18%。GMFD NPs 在pH=7.4 的溶液中非常穩(wěn)定,在48 h 內(nèi)釋放的DOX僅有23.14%,但是在pH=2的酸溶液中,4 h內(nèi)釋放的藥物便超過(guò)77.2%(圖7)。

圖5 GMFD NPs各組成成分粒徑、電位分布Fig.5 Particle size and potential distribution of GMFD NPs components.A:Particle size of each component;B:Potential distribution of each component.

圖6 GMFD NPs透射電鏡圖Fig.6 Transmission electron microscopy of GMFD NPs.

圖7 GMFD NPs在不同pH溶液中的藥物釋放Fig.7 Drug release of GMFD NPs in solutions with different pH values(n=6).

2.3 GMFD NPs體外與腫瘤細(xì)胞相互作用的研究

cck-8細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,單純DOX和GMFD NPs分別與肝癌細(xì)胞作用24 h后,對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率都呈濃度依賴性,隨著濃度的增加而增加(圖8)。通過(guò)SPSS軟件分析得出單純DOX和GMFD NPs對(duì)細(xì)胞的半抑制濃度(IC50)分別為:5.850±0.274 mg/L 和1.135±0.183 mg/L。在激光共聚焦顯微鏡中可觀察到,將HepG2肝癌細(xì)胞分別與單純DOX、GMFD NPs共同孵育4 h后,各組的熒光強(qiáng)度無(wú)明顯差異,均可被HepG2細(xì)胞內(nèi)化攝取呈現(xiàn)紅色DOX熒光信號(hào)(圖9),流式細(xì)胞熒光檢測(cè)結(jié)果顯示單純藥物組與納米粒組細(xì)胞內(nèi)均檢測(cè)到明顯的DOX熒光,與激光共聚焦結(jié)果一致(圖10)。

圖8 不同濃度的DOX、GMFD NPs與HepG2細(xì)胞作用后的存活率Fig.8 Survival rate of HepG2 cells treated with DOX and GMFD NPs at different concentrations,n=6).

圖9 DOX、GMFD NPs處理后細(xì)胞內(nèi)DOX分布共聚焦圖像Fig.9 Confocal images of intracellular DOX distribution in cells treated with free DOX and GMFD NPs.scale bar=100 μm.

圖10 不同制劑細(xì)胞攝取流式熒光強(qiáng)度分析Fig.10 Fluorescence intensity analysis of cell uptake flow of DOX and GMFD NPs.A:Blank group;B:Free DOX group;C:GMFD NPs group.

2.4 GMFD NPs體內(nèi)生物安全性及藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究

當(dāng)濃度低于100 μg/mL時(shí),隨濃度的增加,各樣本溶血率均低于5%(圖11)。雖然在高濃度100 μg/mL時(shí)的溶血率較高,可達(dá)12%,但在動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中我們所注射藥物最高濃度為10 μg/mL,溶血率僅有1%。經(jīng)BALB/c小鼠尾靜脈注射生理鹽水、單純DOX 以及GMFD NPs10 d 后取血檢測(cè)血常規(guī)各項(xiàng)指標(biāo)(WBC、RBC、MCV、MCH),除單純DOX組的WBC降低外(P=0.008),其余各組均無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖12)。在注射藥物后2 h內(nèi)血液中DOX含量迅速下降,但GMFD NPs顯示比游離DOX 更長(zhǎng)的血液循環(huán)時(shí)間,注射24 h 后,有62.21%DOX 存留在血液里,而游離DOX 組僅有10.59%(圖13)。

圖11 不同濃度GMFD NPs與小鼠紅細(xì)胞共培養(yǎng)的溶血現(xiàn)象觀察Fig.11 Hemolysis of mouse erythrocytes co-cultured with different concentrations of GMFD NPs.

圖12 注射不同試劑10 d后小鼠的的血常規(guī)Fig.12 Blood routine of mice injected with different reagents for 10 days(n=3,**P<0.01).

圖13 DOX、GMFD NPs的藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究Fig.13 Pharmacokinetics of DOX and GMFD NPs.

圖14 HIFU消融前后裸鼠腫瘤區(qū)域的超聲圖像Fig.14 Ultrasonic gray-scale map of the target tumor area before and after HIFU ablation.A,B:Gray changes of ultrasound images before and after only HIFU ablation.C,D:Gray changes of ultrasound images before and after NPs+HIFU ablation.

2.5 GMFD NPs增效HIFU治療的實(shí)驗(yàn)研究

HIFU 輻照后,裸鼠腫瘤組織靶區(qū)均出現(xiàn)不同程度增強(qiáng)的灰度增強(qiáng),其中GMFD NPs 組灰度增強(qiáng)(25.5±4.50)明顯高于生理鹽水組(18.7±3.85),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.04)。HIFU治療后24 h處死瘤鼠,取出腫瘤組織沿HIFU輻照時(shí)的聲束方向切開(kāi)組織,進(jìn)行TTC染色,觀察到消融后的凝固性壞死區(qū)域呈灰白色,而未消融區(qū)腫瘤組織成猩紅色,邊界清楚(圖15)。GMFD NPs組凝固性壞死體積(105.80±1.21)明顯大于生理鹽水組(38.02±0.34)。能效因子(EEF)表示HIFU的消融效率,EEF值越低,HIFU的消融效率越高。通過(guò)計(jì)算可知,GMFD NPs組EEF(t=1.79)明顯低于生理鹽水組(t=4.97),各項(xiàng)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。H＆E染色顯示HIFU消融后的凝固性壞死區(qū)與非消融區(qū)邊界明顯,非消融區(qū)域腫瘤細(xì)胞形態(tài)完整,排列緊密,核大深染。細(xì)胞壞死區(qū)域細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)消失,呈片狀紅染,其中可見(jiàn)不規(guī)則排列的細(xì)胞核且核固縮、裂解。GMFD NPs+HIFU 輻照后壞死區(qū)核固縮、裂解較Saline+HIFU組更明顯,且核結(jié)構(gòu)消失,可見(jiàn)大量散在的細(xì)胞核碎片(圖16)。

圖15 HIFU消融后腫瘤組織靶區(qū)的凝固性壞死圖片F(xiàn)ig.15 Coagulative necrosis in the target area in the tumor tissue after HIFU ablation.A:Saline+HIFU.B:GMFD NPs+HIFU.

圖16 HIFU消融后腫瘤組織HE染色切片觀察Fig.16 HE staining of tumor tissue after HIFU ablation.A:Saline+HIFU.B:GMFD NPs+HIFU.Scale bar=50 μm.

3 討論

本實(shí)驗(yàn)首先合成MnO2納米粒,結(jié)合紫外可見(jiàn)吸收光譜出現(xiàn)300 nm附近的MnO2特征峰［26］及產(chǎn)物的XPS光譜結(jié)果顯示產(chǎn)物中錳的價(jià)態(tài)主要為+4 價(jià)［27］,表明MnO2NPs 的成功制備。圖3、4 結(jié)果表明MnO2可與H2O2和H+反應(yīng),轉(zhuǎn)化為Mn2+并產(chǎn)生O2,具體公式為:MnO2+H2O2+2 H+→Mn2++2 H2O+O2↑。即使在模擬微環(huán)境的50 μmol/L極低濃度的H2O2中也能產(chǎn)生O2,且隨著H2O2濃度的升高O2濃度隨之升高,為后文研究GOD氧化產(chǎn)生H2O2促進(jìn)O2的產(chǎn)生提供理論支撐。然后構(gòu)建了一種金屬有機(jī)納米粒(GMFD NPs),該納米粒平均粒徑為:131.23±0.84 nm,表面電位為21.87±1.72 mV,該NPs在中性環(huán)境下具有良好的穩(wěn)定性,可限制負(fù)載藥物的過(guò)早釋放；而受腫瘤酸性微環(huán)境影響可快速觸發(fā)GMFD NPs 的解離,釋放出負(fù)載的DOX、GOD 和MnO2,并發(fā)揮其各自作用。從而有效地避免了非靶區(qū)藥物釋放引起的副作用。

實(shí)驗(yàn)中依次添加GOD、MnO2、Fe3+通過(guò)物理吸附、金屬配位等方式以形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),加入DOX·HCl后通過(guò)去質(zhì)子化不斷壓縮形成GMFD NPs［23,28］。流式細(xì)胞儀與激光共聚焦結(jié)果分別從定量與定性兩個(gè)方面證明GMFD NPs能被腫瘤細(xì)胞有效攝取并釋放抗癌藥物。藥物對(duì)細(xì)胞的半抑制濃度(IC50)是細(xì)胞抑制率達(dá)50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的藥物濃度,可用來(lái)評(píng)估藥物對(duì)癌細(xì)胞的毒性,其值越小,說(shuō)明藥物對(duì)細(xì)胞的毒性越強(qiáng)。體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明GMFD NPs相比于單純DOX對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞具有更高的毒性。

藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,GMFD NPs能顯著提高藥物在血液中的循環(huán)時(shí)間,并且能減少藥物的提前泄露。在體外生物相容性研究中,使用了不同濃度的GMFD NPs與紅細(xì)胞共同孵育考察其溶血率,結(jié)果顯示該NPs在治療劑量下的紅細(xì)胞溶血率小于5%,表明該納米粒具有良好的生物相容性。我們通過(guò)聯(lián)合HIFU治療瘤鼠腫瘤實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),在相同實(shí)驗(yàn)條件下,GMFD NPs+HIFU組的靶區(qū)灰度值變化及凝固性壞死體積均大于僅HIFU消融組。能效因子(EEF)表示HIFU的消融效率,EEF值越低,HIFU的消融效率越高。通過(guò)計(jì)算可知,GMFD NPs 組EEF 明顯低于生理鹽水組,表明GMFD NPs可以有效提高HIFU的消融效率。H＆E染色結(jié)果顯示GMFD NPs+HIFU組的靶區(qū)壞死明顯,呈大片紅染區(qū)域,細(xì)胞結(jié)構(gòu)消失,壞死區(qū)與周?chē)M織分界清晰,而生理鹽水+HIFU組中仍然可見(jiàn)細(xì)胞碎片分布,部分細(xì)胞有完整形態(tài)結(jié)構(gòu)。原因在于GMFD NPs能夠通過(guò)EPR效應(yīng)高效富集于腫瘤部位,從而改變腫瘤聲學(xué)環(huán)境,增加超聲能量的沉積［14］。同時(shí)在酸性條件下MnO2產(chǎn)生的O2提高了HIFU的空化效應(yīng),而空化效應(yīng)本身所產(chǎn)生的高溫又可以增加超聲能量的沉積［29］,從而使HIFU的熱效應(yīng)與空化效應(yīng)協(xié)同發(fā)揮作用。同時(shí),由于MnO2納米顆粒被分解為無(wú)害的水溶性Mn2+,可經(jīng)代謝排出體外,因此,與許多其他不可生物降解的無(wú)機(jī)納米材料不同,當(dāng)MnO2應(yīng)用于體內(nèi)時(shí),不存在長(zhǎng)期毒性問(wèn)題［30］。此外,由于該納米粒包載抗癌藥物DOX,可通過(guò)化療誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,清除殘余的腫瘤細(xì)胞［31］。

綜上所述,本實(shí)驗(yàn)成功制備了一種金屬有機(jī)納米粒(GMFD NPs)。該NPs具有良好的生物相容性,且低pH響應(yīng)的特點(diǎn)可避免藥物提前泄露,降低藥物全身毒副作用。同時(shí)該NPs有效提高了HIFU消融效果,促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞凋亡。因此GMFD NPs可作為一種極具應(yīng)用前景的HIFU增效劑。