華 慧,董 昕,張雨釗,方 凡,張蓓蓓,李向陽,于 倩,鄭葵陽,顏 超

徐州醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)與免疫學(xué)教研室,江蘇省免疫與代謝重點實驗室,徐州市感染與免疫重點實驗室,江蘇徐州221004

潰瘍性結(jié)腸炎(UC)是炎癥性腸病的一種,在我國已經(jīng)成為一種常見的腸道疾?。?-2］,其病因復(fù)雜,一般認為與遺傳、感染、環(huán)境、免疫平衡失調(diào)等因素有關(guān)［3-5］。近年研究表明蠕蟲感染可有效防治炎癥性腸病［6-7］,因此蠕蟲來源的相關(guān)蛋白引起廣泛關(guān)注［8-9］。

華支睪吸蟲是蠕蟲的一種,華支睪吸蟲來源的分子伴侶CsHscB經(jīng)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)是共-分子伴侶家族成員,與其他來源的同家族成員相比,均含有高度保守的DnaJ和共-分子伴侶HscB結(jié)構(gòu)域,作為共-分子伴侶Hsc20家族成員之一,提示CsHscB可能具有分子伴侶的一般功能［10-11］,但其具體研究目前未見報道。本課題組于體外重組合成rCsHscB,前期研究證實rCsHscB作為熱休克蛋白家族成員之一,能夠顯著上調(diào)IL-10 的含量,誘導(dǎo)宿主負向免疫調(diào)控［12］,但其對慢性潰瘍性結(jié)腸炎作用未知。為此,本研究在成功構(gòu)建DSS誘導(dǎo)的慢性潰瘍性結(jié)腸炎小鼠模型基礎(chǔ)上,進一步研究華支睪吸蟲來源的rCsHscB蛋白對慢性潰瘍性結(jié)腸炎的作用,并探討其可能機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

50只6～8周(約20 g)清潔級雄性C57BL/6小鼠購自北京維通利華公司,飼養(yǎng)于徐州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心SPF級動物房。本研究已獲徐州醫(yī)科大學(xué)實驗動物倫理委員會批準。

1.2 rCsHscB蛋白制備［12］

將PET-28a-CsHscB 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)中,用1 mmol/L異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)進行誘導(dǎo)表達,HisTrap FF 柱純化,使用高效內(nèi)毒素清除劑去除內(nèi)毒素,經(jīng)十二烷基硫酸鈉?聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS?PAGE)電泳鑒定,BCA法測定蛋白濃度后于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 主要試劑及儀器

重組蛋白rCsHscB由本課題組前期重組合成,保存于-80 ℃冰箱。DSS(相對分子質(zhì)量36 000～50 000)(MP Biomedicals)；CD4/CD8 流式抗體(Biolegend)；ELISA試劑盒(eBioscience)；HE染色試劑盒(碧云天)；Masson染色試劑盒(南京建成)。Anti-ERK1/2、Anti-p-ERK1/2 等抗體(CST)。流式細胞儀(FACS Canto II)(BD),全波長酶標儀(Synergy 2)(Bio-Tek)。

1.4 分組及造模

50只小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后,按隨機數(shù)字表法分為4 組:其中NC 組和rCsHscB 組每組10 只、DSS 組和DSS+rCsHscB組每組15只。NC組和rCsHscB組給予正常飲用水,DSS 組以及DSS+rCsHscB 組給予含有2%DSS的飲用水7 d,再給予正常飲水2周,此3周為1個循環(huán),共進行4個循環(huán)；rCsHscB組和DSS+rCsHscB組每只小鼠在給予DSS 同一周的第4、7 天腹腔注射125 μg/mL rCsHscB(25 μg rCsHscB蛋白溶于200 μL無內(nèi)毒素PBS),NC組和DSS組腹腔注射200 μL無內(nèi)毒素PBS。實驗期間密切觀察小鼠體質(zhì)量、精神狀況及大便性狀,于實驗第84天處死全部小鼠。

1.5 樣品采集

眼球采血,取全血行后續(xù)流式細胞實驗；頸椎脫臼處死小鼠,分離全結(jié)腸,縱行切開并清除腸內(nèi)容物,留取標本行組織病理學(xué)及蛋白檢測；取全部小腸以備后續(xù)實驗。

1.6 小腸固有層淋巴細胞(LPL)制備

將小腸浸泡于預(yù)冷的RPMI 1640培養(yǎng)基中,剝離腸系膜,去除派氏集合淋巴結(jié),延縱軸剪開并沖洗干凈,剪成1～1.5 cm 的組織塊,置于含有DTT、DNAseI 和Liberase TL 的消化液中,37 ℃,190 r/min 震蕩消化20 min,不銹鋼濾網(wǎng)過濾,回收殘余組織重復(fù)洗滌3次,用剪刀充分剪碎,置于含有PS,HEPES,Liberase TL和DNAseI的消化液中,37 ℃,190 r/min 震蕩消化30 min,70 μm的細胞濾網(wǎng)收集細胞懸液,離心棄上清,用10 mL 47%的percoll重懸,4 ℃,1500 r/min,離心10 min,收集細胞沉淀,即為LPL,洗滌重懸后調(diào)整細胞濃度備用。

1.7 HE和Masson染色

取1 cm遠端結(jié)腸,通過固定、脫水、透明后、進行石蠟包埋,切5 μm 厚度組織片,分別常規(guī)進行HE 和Masson染色,顯微鏡下觀察。其中HE染色從炎癥程度、隱窩損傷、隱窩膿腫、中性粒細胞和淋巴細胞浸潤、粘膜下層水腫、上皮細胞增生和杯狀細胞丟失6個方面進行評分［13-14］。Masson染色通過計算積分光密度,也就是膠原纖維占整個組織面積的比率即膠原纖維的面積百分比(%)來進行評價。

1.8 流式細胞術(shù)

取外周血細胞(先裂紅)和LPL,分別加入antimouse CD4 FITC 和anti-mouse CD8 PE 抗體各1 μL,4 ℃避光孵育30 min,洗滌,上機檢測,Flowjo軟件分析數(shù)據(jù)。

1.9 ELISA檢測細胞因子

稱取100 mg結(jié)腸組織,加入600 μL細胞裂解液,充分勻漿,4 ℃,12 000 r/min,離心15 min,收集上清液,采用ELISA測定上清液中IL-6,MCP-1和IL-10的含量,具體操作嚴格按照試劑盒說明書進行。剩余上清使用BCA法檢測蛋白濃度,行Western blot實驗。

1.10 Western blot檢測

將結(jié)腸組織勻漿上清加入5×loading buffer,混勻煮沸制成蛋電泳樣品,每組各取30 μg蛋白進行SDSDAGE,常規(guī)轉(zhuǎn)膜,BSA封閉,加入ERK1/2、p-ERK1/2、JNK、p-JNK,P38,p-P38和GAPDH抗體(分別按說明書稀釋),4°C孵育過夜,加入二抗(1∶2000),室溫孵育2 h,洗膜后加入ECL發(fā)光液顯色,凝膠成像儀成像,使用Image J 軟件對條帶進行灰度值分析,計算磷酸化蛋白與總蛋白的比值。

1.11 統(tǒng)計方法

采用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計分析,計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示,資料符合正態(tài)分布,多組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD檢驗；否則采用非參數(shù)檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 rCsHscB對DSS誘導(dǎo)的慢性結(jié)腸炎小鼠一般狀態(tài)及結(jié)腸長度的影響

實驗期間,NC組和rCsHscB組小鼠精神狀態(tài)良好,活動如常,飲食正常,皮毛光滑有光澤,體質(zhì)量增加,兩組小鼠結(jié)腸長度基本一致,差異無統(tǒng)計學(xué)意義；DSS組小鼠精神萎靡,活動欠佳,進食量減少,毛色欠光澤,體質(zhì)量增加不明顯,大多數(shù)小鼠出現(xiàn)腹瀉、黏液膿血便,與NC 組相比,結(jié)腸長度明顯縮短(P<0.001)。DSS+rCsHscB組較DSS組上述癥狀有所緩解,結(jié)腸長度明顯變長,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001,圖1)。

圖1 各組小鼠體質(zhì)量及結(jié)腸變化情況Fig.1 Changes in body weight (A) and colon length (B,C) of the mice in each group.**P<0.01,***P<0.001 vs the NC group,#P<0.05,###P<0.001 vs the DSS group.

2.2 rCsHscB減緩DSS誘導(dǎo)的小鼠慢性結(jié)腸炎病理損傷

rCsHscB組與NC組類似,小鼠結(jié)腸黏膜上皮結(jié)構(gòu)完整,腺體排列規(guī)則,黏膜固有層內(nèi)血管和纖維間質(zhì)正常,無炎性細胞浸潤,肌層無異常,評分無差異。DSS組小鼠結(jié)腸組織大量上皮細胞脫落,腺體隱窩結(jié)構(gòu)破壞嚴重,黏膜及黏膜下層有大量炎性細胞浸潤并伴明顯組織水腫,評分顯著增加(P=0.001)。DSS+rCsHscB組小鼠上皮結(jié)構(gòu)相對較完整,腺體隱窩排列較整齊、炎性細胞浸潤減少,與DSS組相比,評分顯著下降(P=0.001,圖2)。

圖2 結(jié)腸組織HE染色及評分Fig.2 HE staining(A)and scoring(B)of the colon tissue(Original magnification:×10).**P<0.01 vs the NC group,##P<0.01 vs the DSS group.

2.3 rCsHscB改善DSS誘導(dǎo)的小鼠慢性結(jié)腸炎中膠原纖維沉積

與NC組相比,DSS組可見大量藍染的膠原纖維沉積于黏膜層和粘膜下層,膠原纖維所占比例顯著增加(P=0.006)；DSS+rCsHscB組也可見一定量散在的膠原纖維沉積在上述區(qū)域,但相對于DSS組明顯減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.001)；而rCsHscB組小鼠未見上述現(xiàn)象(圖3)。

圖3 結(jié)腸組織Masson染色及結(jié)果分析Fig.3 Masson staining(A)and scoring(B)of the colon tissue(×10).**P<0.01 vs NC group,##P<0.01 vs DSS group.

2.4 rCsHscB 對DSS 誘導(dǎo)的慢性結(jié)腸炎小鼠血清中CD4+T、CD8+T細胞比例影響

與NC組相比,rCsHscB組CD4+T細胞、CD8+T細胞及CD4+T/CD8+T細胞均沒有明顯變化；DSS組CD4+T細胞比例增多(P=0.03),CD4+T/CD8+T細胞比值升高(P=0.03),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；與DSS組相比,DSS+rCsHscB 組CD4+T 細胞比例降低(P=0.02),CD4+T/CD8+T細胞比值降低(P=0.04,圖4)。

圖4 各組小鼠外周血中CD4+T、CD8+T細胞表達水平變化Fig.4 Levels of CD4+T and CD8+T cells in the peripheral blood of the mice in each group.*P<0.05 vs the NC group,#P<0.05 vs the DSS group.

2.5 rCsHscB 對DSS 誘導(dǎo)的慢性結(jié)腸炎小鼠LPL 中CD4+T、CD8+T細胞影響

與NC 組相比,rCsHscB 組LPL 中CD4+T 細胞,CD8+T細胞及CD4+T/CD8+T細胞比值沒有明顯變化,DSS組CD4+T細胞比例增多(P=0.008),CD8+T細胞比例雖有降低,但無顯著性差異(P=0.08),CD4+T/CD8+T細胞比值升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.002)。與DSS 組相比,DSS+rCsHscB 組CD4+T 細胞比例降低(P=0.02),CD8+T細胞比例升高,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.20),CD4+T/CD8+T細胞比值降低(P=0.03,圖5)。

圖5 各組小鼠LPL中CD4+T和CD8+T細胞表達水平變化Fig.5 Levels of CD4+T and CD8+T cells in lamina propria gastric lymphocytes(LPL) of the mice in each group.**P<0.01 vs NC group,#P<0.05 vs DSS group.

2.6 rCsHscB對DSS誘導(dǎo)的慢性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸勻漿上清中細胞因子的影響

ELISA結(jié)果顯示,rCsHscB組與NC組相比,IL-6、MCP-1和IL-10均無明顯變化；DSS組與NC組相比,IL-6(P<0.001)和MCP-1(P=0.002)含量明顯升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義,IL-10變化無顯著性差異(P=0.11)；與DSS組相比,DSS+rCsHscB組IL-6(P<0.001)和MCP-1(P=0.005)含量明顯降低,IL-10 含量明顯上升(P=0.003,圖6)。

圖6 各組小鼠結(jié)腸組織勻漿上清中細胞因子表達變化Fig.6 Levels of cytokines in the colon homogenate of the mice in each group.**P<0.01,***P<0.001 vs NC group,##P<0.01,###P<0.001 vs DSS group.

2.7 rCsHscB對DSS誘導(dǎo)的慢性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織中MAPK信號通路的影響

與NC組相比,rCsHscB組ERK1/2、JNK、P38的磷酸化水平并未升高；而DSS組小鼠ERK1/2(P=0.006)、JNK(P<0.001)、P38(P<0.001)的磷酸化水平顯著升高,與NC 組相比有顯著性差異；與DSS 組相比,DSS+rCsHscB 組ERK1/2(P=0.02)、JNK(P=0.001)、P38(P=0.002)的磷酸化水平顯著降低(圖7)。

圖7 各組小鼠結(jié)腸組織中MAPK信號通路蛋白表達情況Fig.7 Expression of the proteins in the MAPK signal pathway in the colon tissue of the mice in each group.**P<0.01,***P<0.001 vs NC group,#P<0.05,##P<0.01 vs DSS group.

3 討論

DSS誘導(dǎo)的慢性結(jié)腸炎模型持續(xù)時間長,伴有急性向慢性轉(zhuǎn)化的動態(tài)過程,是研究腸道慢性炎癥較為理想的動物模型［15-16］。本實驗為模擬慢性結(jié)腸炎的發(fā)生和發(fā)病過程,采用了4個周期的DSS誘導(dǎo)小鼠的慢性結(jié)腸炎模型,通過小鼠一般狀態(tài)、結(jié)腸組織病理學(xué)(HE染色)及膠原纖維檢測(Masson染色)等指標,表明本研究使用的模型構(gòu)建成功。模型小鼠腹腔注射rCsHscB后,精神狀態(tài)、體質(zhì)量下降、腹瀉便血、結(jié)腸長度、結(jié)腸組織病理學(xué)及腸道纖維化等出現(xiàn)明顯改善,表明華支睪吸蟲rCsHscB對DSS誘導(dǎo)的慢性結(jié)腸炎具有明顯的預(yù)防改善作用；而正常小鼠腹腔注射rCsHscB后,并未出現(xiàn)炎癥性病變及其他相關(guān)癥狀,可認為rCsHscB對小鼠不會造成不良作用。

在人體正常的炎性反應(yīng)中,免疫細胞會選擇性地激活CD8+T細胞,而對于UC患者而言,在整個免疫過程中會選擇性地激活CD4+T細胞,處于活動期的UC患者CD8+T細胞數(shù)量明顯下降,最終導(dǎo)致CD4+T/CD8+T細胞比值升高［17-18］。而T細胞的異?；罨氨壤Ш鈺^度釋放具有多種致病作用的細胞因子和趨化因子,從而造成腸道組織損傷或炎癥持久存在,這也是UC發(fā)病及病情活動的機制之一［19-22］?；诖?本研究分別采用流式細胞術(shù)和ELISA檢測了T細胞的比例和細胞因子及趨化因子的分泌情況,結(jié)果顯示,DSS 組小鼠無論是LPL,還是外周血之中,CD4+T比例升高,CD4+T/CD8+T細胞比值升高,結(jié)腸組織勻漿上清中細胞因子IL-6和MCP-1分泌水平明顯升高,這可能是由于CD4+T細胞功能增強,CD8+T細胞活性受到抑制,大量促炎因子和趨化因子釋放,促進B細胞分泌活躍,產(chǎn)生抗體,體液免疫反應(yīng)亢進,進而激發(fā)補體系統(tǒng),從而引發(fā)炎癥反應(yīng)［23-24］。rCsHscB 治療后,這種比例失衡能夠得到很大改善,CD4+T/CD8+T細胞比值明顯降低,促炎因子IL-6及趨化因子MCP-1分泌明顯減少,說明rCsHscB在一定劑量和療程下能夠調(diào)節(jié)DSS小鼠T細胞亞群的平衡,抑制促炎因子和趨化因子的表達,同時能夠促進抑炎因子IL-10的釋放,從而降低免疫反應(yīng)程度,促進腸道黏膜修復(fù),改善結(jié)腸炎癥。

研究表明,細胞應(yīng)激和大量炎性因子的釋放能夠激活胞內(nèi)的MAPK家族信號通路,引發(fā)一系列的生物學(xué)改變,促使膠原蛋白表達增加,從而導(dǎo)致組織的纖維化［25-26］；同時,MAPK通路可通過磷酸化級聯(lián)反應(yīng)激活下游的轉(zhuǎn)錄因子來調(diào)節(jié)細胞因子的分泌,進而參與炎癥反應(yīng)［27-28］。因此,本研究運用Western blot檢測了ERK、JNK和P38蛋白,發(fā)現(xiàn)與DSS組相比,rCsHscB干預(yù)后ERK1/2、JNK 和P38 的磷酸化水平顯著降低(P<0.05)。提示rCsHscB可能是通過抑制MAPK通路的激活減輕結(jié)腸組織的纖維化,同時下調(diào)促炎細胞因子的生成。有研究表明,山竺提取物(α-mangostin)能夠通過抑制MAPK緩解DSS誘導(dǎo)的腸炎［29］,同樣,綠原酸也可通過MAPK/ERK信號通路抑制炎癥因子產(chǎn)生從而改善DSS 誘導(dǎo)的急性潰瘍性結(jié)腸炎［30-31］。上述研究表明MAPK在機體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)中其重要的調(diào)節(jié)作用,可作為急、慢性結(jié)腸炎潛在治療靶點。

綜上所述,rCsHscB對DSS導(dǎo)致的小鼠慢性潰瘍性結(jié)腸炎具有較好的改善作用,可能通過MAPK抑制促炎因子產(chǎn)生并調(diào)控CD4+T/CD8+T細胞平衡來發(fā)揮作用的,但其作用機制仍需要繼續(xù)深入研究,以期為其進入臨床實驗提供相應(yīng)依據(jù)。