蔣富杰,楊海燕,王 璐,汪瑤臺,唐 瑜,王狄森,王 琦,鄒建中

重慶醫(yī)科大學生物醫(yī)學工程學院//超聲醫(yī)學工程國家重點實驗室//重慶市生物醫(yī)學工程學重點實驗室,重慶400016

高強度聚焦超聲(HIFU)已廣泛應用于實體腫瘤的治療［1-3］。隨著治療深度增加,超聲波能量會衰減,增加治療功率和延長治療時間會帶來嚴重的副作用［4-5］。本課題組前期構建HIFU生物靶向增效劑,通過化學鍵、靜電相互作用、生物特異性結合等方式利用雙歧桿菌靶向遞送HIFU增效物質,提高HIFU的治療效率［6-10］,但是在腫瘤內定植的細菌未結合HIFU增效物質,以及在靶向腫瘤過程中兩者連接的穩(wěn)定性仍需進一步探討。

非致病性大腸桿菌 如DH5α［11］、BL21［12-13］、Nissle1917［14］等具有靶向腫瘤乏氧區(qū)的特性,能遞送效應基因或蛋白用于腫瘤的靶向診療。據文獻報道,氣體囊泡(GVs)是一種氣體填充的蛋白納米結構［15-17］,通過基因工程技術將表達GVs的“聲學信使基因”(ARGs)轉入大腸桿菌BL21(AI),能產生GVs并用于超聲顯像［18］。GVs能在超聲圖像上顯示,就有可能將其用于HIFU消融腫瘤的增效,因GVs內含有氣體,而氣體是超聲治療增效的主要物質［19］,如果能將表達GVs 的大腸桿菌BL21(AI)用作新型HIFU生物靶向增效劑,則不需體外結合增效物質,便能實現增效HIFU消融的目的。但是表達GVs的大腸桿菌BL21(AI)增效HIFU消融的效果及其安全性未知,如經靜脈入血是否引發(fā)機體炎性反應,對正常組織是否造成影響有待進一步探討。因此,本研究欲利用大腸桿菌BL21(AI)“自產”增效物質GVs,探討其增效HIFU消融的效果及其安全性,為深入研究新型HIFU生物靶向增效劑奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 主要實驗試劑 大腸桿菌BL21(AI)感受態(tài)細胞(上海唯地生物有限公司)；pET28a-ARG1質粒(重慶醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院超聲科惠贈)；大腸桿菌BL21(AI)/pET28a-ARG1 菌株(本課題組前期構建保存)；4T1乳腺癌細胞(重慶醫(yī)科大學超聲影像學研究所惠贈)；LB培養(yǎng)基(青島海博)；葡萄糖、L-阿拉伯糖、氨芐青霉素、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)(北京索萊寶),SoluLyse-Tris(L200500 Genlantis)(Sigma),小鼠TNF-α、IL-1β ELISA試劑盒(四正柏生物)。

1.1.2 檢測儀器 透射電鏡(日立7500)；海扶刀?聚焦超聲腫瘤治療系統(重慶海扶醫(yī)療科技股份有限公司)；Olympus-BX51光學顯微鏡(OLYMPUS)；XT-2000i全自動血液分析儀(SYSMEX)；全自動生化分析儀(IDEXX Catalyst DXTM)。

1.2 實驗方法

1.2.1 含GVs的大腸桿菌BL21(AI)制備 復蘇凍存大腸桿菌BL21(AI)-pET28a-ARG1；將復蘇后的菌液接種于含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上,37 ℃孵育。次日挑選長出的菌落接種于含氨芐青霉素、1%葡萄糖LB液體培養(yǎng)基,220 r/min,37 ℃孵育12 h；按1∶20比例擴大培養(yǎng),220 r/min,37 ℃培養(yǎng)至A600nm=0.5,用0.5%L-阿拉伯糖和0.4 mmol/L IPTG誘導,30 ℃下培養(yǎng)22 h,經350 g,4 ℃離心4 h,收集上層懸浮細菌,即得表達GVs的大腸桿菌(測得1A600≈1.07×109CFU/mL)。重懸于8%的SoluLyse-Tris和250 μL/mL的溶菌酶中,4 ℃旋轉孵育1 h,裂解后將液體轉移到2 mL 試管中,8 ℃下400 g離心2 h,得到分離純化的GVs。

1.2.2 動物模型與實驗分組 選取4～6周齡雌性BALB/c小鼠136只,體質量20±2 g,由重慶醫(yī)科大學動物實驗中心提供,許可證號:SCXK(渝)2018-0003,本研究符合重慶醫(yī)科大學實驗動物倫理委員會所制定的倫理學標準。常規(guī)飼養(yǎng)136只BALB/c小鼠,從中隨機選取32只,構建4T1 荷瘤小鼠模型:選取對數生長期的4T1乳腺癌細胞,胰酶消化、離心并重懸調整細胞濃度為1×107/mL,接種100 μL細胞于小鼠右側大腿根部皮下,待腫瘤長到直徑約0.8～1 cm時用于觀察大腸桿菌BL21(AI)在荷瘤小鼠體內的分布及HIFU增效實驗。余下104 只BALB/c 小鼠也隨機分為GVs 組和對照組(n=52),用于一般情況、血培養(yǎng)、血常規(guī)、血生化及炎性因子指標的檢測。GVs組經尾靜脈注射含GVs的大腸桿菌BL21(AI)-pET28a-ARG1 懸液200 μL(濃度為1×108CFU/mL),對照組注射無菌PBS 200 μL。

1.2.3 大腸桿菌BL21(AI)在重要臟器和瘤內的分布 選取24只4T1荷瘤小鼠,隨機分為GVs組和對照組,每組12只,于注射后第1、4、15天,每個時間點選取4只,以無菌操作將荷瘤小鼠心、肝、脾、肺、腎和腫瘤組織取出,置于2 mL無菌PBS中,經組織勻漿器勻漿后,將勻漿液按照10倍比例稀釋。取100 μL終稀釋液接種于含氨芐青霉素LB瓊脂培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)12 h,觀察平板菌落生長情況。

1.2.4 HIFU輻照及評價(1)HIFU輻照選取8只4T1荷瘤小鼠,隨機分為GVs組和對照組,每組4只,于注射后第4 天,在超聲引導下行HIFU 輻照,工作頻率為1MHz,點輻照,治療功率150 W,輻照時間3 s；(2)凝固性壞死體積HIFU輻照后24 h處死荷瘤小鼠,完整剝離腫瘤,沿聲束長軸方向切開腫瘤,37 ℃、2%氯化三苯基四氮唑(TTC)染色40 min,測算凝固性壞死體積:V(mm3)=(π/6)×長度×寬度×深度；(3)腫瘤組織病理觀察經HIFU輻照后的腫瘤組織于4%多聚甲醛溶液中固定,經過脫水、石蠟包埋、切片、HE染色,光學顯微鏡下(×100倍)觀察腫瘤組織損傷。

1.2.5 一般情況 選取16只正常BALB/c小鼠,隨機分為GVs組和對照組,每組8只,注射后15 d內觀察小鼠的精神狀態(tài)、運動情況、進食、進水以及存活情況,每2 d記錄小鼠體質量的變化。

1.2.6 血培養(yǎng) 選取24只正常BALB/c小鼠,隨機分為GVs組和對照組,每組12只,于注射后第12、24和48 h,每個時間點4只,無菌采集小鼠靜脈血液500 μL,稀釋于4.5 mL無菌PBS中,取100 μL稀釋液接種于含氨芐青霉素抗性的LB固體培養(yǎng)基,放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱,連續(xù)觀察5 d,計數平板菌落數。

1.2.7 血常規(guī)檢測 選取32只正常BALB/c小鼠,隨機分為GVs組和對照組,每組16只,于注射前、注射后第1、4、15天,每個時間點4只,經小鼠眼眶取血500 μL,進行血常規(guī)檢測,記錄白細胞、紅細胞、血小板、血紅蛋白計數。

1.2.8 肝、腎功生化指標檢測 選取32只正常BALB/c小鼠,隨機分為GVs組和對照組,每組16只,于注射前、注射后第1、4、15天,每個時間點4只,經小鼠眼眶取血1.5 mL,促凝后低溫離心3000 r/min,10 min,收集上層血清,測定肝功生化指標谷丙轉移酶(ALT)、谷草轉移酶(AST)和腎功生化指標肌酐(CREA)、尿素氮(BUN)。

1.2.9 炎性因子檢測 按照試劑盒的說明,采用ELISA試劑盒測定GVs 組和對照組血清中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細胞介素-1β(IL-1β)的水平。

1.2.10 肝、脾組織病理學檢查 實驗結束后,收集小鼠的肝、脾組織,用4%多聚甲醛溶液固定、脫水、石蠟包埋、切片,HE染色,在光學顯微鏡下觀察肝、脾組織結構和細胞形態(tài)并拍照(×200倍)。

1.3 統計學分析

使用SPSS 25.0對實驗數據進行統計分析,計量資料以均數±標準差表示,滿足正態(tài)分布的數據采用t檢驗,不滿足正態(tài)分布的數據采用非參數秩和檢驗。P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 表達GVs的大腸桿菌BL21(AI)表征

成功制備表達GVs的大腸桿菌BL21(AI),肉眼觀呈乳白色,因內部GVs的浮力作用使菌液漂浮在培養(yǎng)基上層(圖1A)；透射電鏡(TEM)可見大腸桿菌BL21(AI)內部含有中空、兩端呈雙錐狀的圓柱體狀GVs,直徑50～150 nm,長度100～400 nm,如箭頭所示(圖1B)；在4 ℃條件下,經多次離心、裂解以及重懸得到分離純化后GVs,TEM可觀察其形態(tài),如箭頭所示(圖1C)。

圖1 表達GVs的大腸桿菌BL21(AI)表征Fig.1 Characterization of E.coli BL21 (AI) expressing GVs.A: E.coli after induction showing the presence of buoyant GVs;B:TEM of E.coli BL21 (AI) expressing GVs(Original magnification:×60 000).The black arrow indicates GVs.C:TEM of GVs(black arrows,×120 000).

2.2 大腸桿菌BL21(AI)在重要臟器和瘤內的分布

GVs組心、肝、脾、肺和腎等重要臟器平板上的細菌隨著時間延長逐漸被清除,而腫瘤組織平板一直有細菌生長(圖2A)。通過計數平板上的菌落發(fā)現,從第1天至15天,心、肝、脾、肺和腎組織上的菌落數逐漸減少,至15 d時檢測不到；而腫瘤組織內的細菌數在第4天時達到最大值(圖2B)。

圖2 大腸桿菌BL21(AI)在體內的分布Fig.2 In vivo biodistribution of E.coli BL21 (AI).A:Homogenates of solid LB agar plates of bacterial colonization in various organs at different time points after injection of E.coli BL21(AI).B:Quantification of bacterial colonization in various organs of 4T1-bearing mice.

2.3 HIFU消融效果

2.3.1 凝固性壞死體積 HIFU輻照后,GVs組和對照組腫瘤組織經TTC染色,可見灰白色區(qū)域為凝固性壞死,而紅色區(qū)域為未壞死區(qū)(圖3)。對照組凝固性壞死體積均值為24.80±2.23,GVs組為76.06±6.51,差異有統計學意義(P<0.001)。

2.3.2 腫瘤組織病理學變化 在光學顯微鏡下觀察到對照組未消融區(qū)域與消融區(qū)分界不明顯,消融區(qū)存在較多散在的細胞碎片,而GVs組分界明顯,消融區(qū)域內細胞變形和細胞核固縮、裂解,大量細胞質被染成紅色(圖4)。

圖4 HIFU輻照后腫瘤組織病理切片Fig.4 Cross sections of tumor tissue after HIFU ablation (HE staining,×100).A:Control group.B:GVs group.

2.4 體質量變化

在15 d內未發(fā)現對照組和GVs組小鼠死亡,GVs組小鼠的體質量在注射第2天與對照組相比略有下降(P=0.037),但是之后開始呈上升趨勢,至第4天時生長速度與對照組保持一致(圖5)。

圖5 體質量變化Fig.5 Body weight changes in the control group and GVs group.*P<0.05 vs control group.

2.5 血液培養(yǎng)檢測

通過平板菌落計數發(fā)現,在注射后12、24、48 h血液中均未檢測出細菌,說明血液中表達GVs的大腸桿菌BL21(AI)在12 h 之內已經被清除掉,表明大腸桿菌BL21(AI)不能在血液中繁殖,對照組均無細菌檢出。

2.6 血常規(guī)變化

注射后第1天,GVs組白細胞下降,與對照組相比有明顯差異(P=0.003),第4天GVs組白細胞回升,與對照組相比無明顯差異(P=0.72),第15天與對照組相比無明顯差異(P=0.59)；第1、4、15天GVs組紅細胞與對照組相比無明顯差異(P=0.94,P=0.69,P=0.27)；第1、4、15 天GVs 組血紅蛋白與對照組相比無明顯差異(P=0.63,P=0.41,P=0.76)；第1、4、15天GVs組血小板與對照組相比無明顯差異(P=0.51,P=0.86,P=0.81,圖6)。

圖6 GVs組和對照組血常規(guī)變化Fig.6 Blood routine changes in the control group and GVs group.A:White cell counts;B:Red blood cell;C:Hemoglobin counts;D:Platelet counts.**P<0.01 vs control group.

2.7 肝、腎功生化指標變化

第1、4、15天GVs組ALT與對照組相比無明顯差異(P=0.71,P=0.35,P=0.12)；第1、4、15天GVs組AST與對照組相比無明顯差異(P=0.59,P=0.77,P=0.46)；第1、4、15 天GVs 組CREA 與對照組相比無明顯差異(P=0.51,P=0.47,P=0.62)；第1、4、15天GVs組BUN與對照組相比無明顯差異(P=0.90,P=0.97,P=0.86,圖7)。

圖7 肝、腎功生化指標變化Fig.7 Blood biochemical indexes of liver and kidney functions in the control group and GVs group.A:ALT.B:AST.C:CREA.D:BUN.

2.8 血清細胞因子變化

注射后第1天實驗組TNF-α水平增加,明顯高于對照組(P=0.003),第4、15天TNF-α的水平與對照組相近(P=0.16,P=0.48)；實驗組IL-1β水平在第1天增加,明顯高于對照組(P=0.019),第4、15天IL-1β水平與對照組相近(P=0.57,P=0.56,圖8)。

圖8 血清細胞因子變化Fig.8 Changes in serum levels of TNF-α(A)and IL-1β(B)in the control group and GVs group.*P<0.05,**P<0.01 vs control group.

2.9 肝、脾組織病理學變化

注射后15 d,對照組與GVs組肝臟組織病理切片可見肝索條帶清晰,肝細胞飽滿,細胞核呈藍紫色,細胞質呈紅色,未見明顯病理改變；對照組與GVs組脾臟組織病理切片髓質結構清晰,未見明顯病理改變(圖9)。

圖9 肝、脾組織病理切片Fig.9 Pathological examination of the liver and spleen tissues in the control group and GVs group (HE staining,×200).A:Liver of control group.B:Liver of GVs group.C:Spleen of control group.D:Spleen of GVs group.

3 討論

近年來,關于非致病性活菌通過靜脈注射用于靶向腫瘤的治療已有大量報道［20-22］。在動物腫瘤模型中的研究發(fā)現減毒鼠傷寒沙門氏菌VNP20009［23］、雙歧桿菌［24］等經靜脈進入機體后在治療劑量內不會對宿主造成不利影響,而且還具有一定的抗腫瘤活性,但為了更有效的遞送抗腫瘤藥物或者抑癌分子用于腫瘤治療,通常需要對細菌進行改造。本研究利用非致病性大腸桿菌BL21 系列菌株［25］,通過基因工程改造使其體內表達GVs,這種體內自帶增效物質的生物材料可作為增效HIFU消融的物質,結果表明在一定劑量下通過靜脈進入血液不會對血液學和重要臟器組織產生明顯損傷,并能有效增強HIFU的消融效果。

研究結果表明經靜脈注射濃度為1×108CFU/mL表達GVs的大腸桿菌BL21(AI)在血液內12 h便會被全部清除不會在血液中大量繁殖和生存,不會引起菌血癥,而且隨著時間延長,分布于正常組織中的細菌也會被清除,可能的原因是肝竇和脾網狀鞘內的巨噬細胞吞噬并消滅進入血液的非致病性細菌,因此血液中的非致病性細菌濃度能快速降低,分布于正常組織中的細菌也會被逐漸清除［26］。通過對血液生理、生化指標及細胞因子的檢測發(fā)現,雖然在注射之初引起白細胞數量下降,TNF-α和IL-1β升高,但是都能恢復至正常水平。革蘭氏陰性菌表面含有脂多糖［27］,而一定量的脂多糖可以激活單核巨噬細胞系統,導致白細胞數量發(fā)生變化［28-29］,非致病性大腸桿菌脂多糖大多是血清敏感型,隨著自身免疫功能的調節(jié),能較快使血液生理指標恢復正常［30］,非致病性大腸桿菌還可以降低體內的炎癥反應,并在免疫反應中產生適度水平的細胞因子［31］,而對血小板、紅細胞、血紅蛋白以及肝、腎功血生化指標未造成明顯影響。肝、脾的組織病理學檢查也表明其組織相容性較好,Zhang等［32］發(fā)現靜脈注射的非致病性大腸桿菌能快速地從血液中清除,而且對小鼠的體質量以及肝、脾臟器的重質量無明顯影響。本研究也觀察到經靜脈注射后小鼠的體重、精神狀態(tài)、飲食及活動度未見異常,表明經靜脈注射表達GVs的大腸桿菌BL21(AI)的安全性較好。

HIFU消融結果表明,表達GVs的大腸桿菌BL21(AI)與PBS相比能夠增強HIFU的消融效果,可能的原因為GVs是氣體填充的蛋白質納米結構,這種含氣的納米結構在接受超過195 kPa的聲脈沖波壓力時,會裂解并釋放出內部氣體［33-34］,而HIFU消融時聲場焦域處的聲強很高,焦點處的聲壓幅值可達MPa量級［35］,足以引起GVs的崩解并釋放氣體。因此,GVs具有如超聲造影劑等含氣結構能增強超聲空化效應和熱效應的作用［36］。基因工程修飾后的大腸桿菌BL21(AI)仍具有靶向腫瘤乏氧區(qū)的能力,表達GVs的大腸桿菌BL21(AI)能靶向定植于腫瘤組織,并且大腸桿菌BL21(AI)體內表達的GVs在HIFU消融時可增強空化效應和熱效應,達到增強HIFU消融腫瘤的效果。

綜上所述,本研究利用體內穩(wěn)定表達GVs的大腸桿菌BL21(1×108CFU/mL),可以安全且有效地增強HIFU消融腫瘤組織的效果,為自帶增效物質的細菌用于增效HIFU奠定了基礎。但本研究為初步探討,具體增效機制和安全性仍需要更加深入、全面的研究。