朱晨露,杜家如,姚言雪,武丹丹,苑 敏,干 露,童旭輝

蚌埠醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,安徽 蚌埠233030

睪丸癌是一種發(fā)病機(jī)制復(fù)雜的惡性腫瘤,好發(fā)于生育高峰期的年輕男性［1］。順鉑是抗癌療效強且抗癌譜廣的化療藥物［2］,且基于順鉑的化學(xué)療法(CBCT)已被納入睪丸癌,肺癌,膀胱癌等多種癌癥的標(biāo)準(zhǔn)治療中［3］?；熤械哪退幮詮?fù)發(fā)是睪丸癌治療的一大挑戰(zhàn),因此,探究睪丸癌耐鉑類藥物的發(fā)生機(jī)制對于提高睪丸癌的治療效果具有重要意義。

近年來,化療中自噬的增強被認(rèn)為是腫瘤耐藥的主要機(jī)制［4］。自噬是一個復(fù)雜的生理過程,包括吞噬泡的形成,自噬體的形成,自噬溶酶體的形成及自噬溶酶體的降解,可消除錯誤折疊的蛋白及受損的細(xì)胞器以維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)［4］。哺乳動物細(xì)胞中自噬體由兩個類泛素化的修飾過程組成,涉及自噬相關(guān)蛋白ATG5、ATG7和微管相關(guān)蛋白LC3［5］。饑餓、疾病、放射、化療等應(yīng)激條件會誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬［6-9］?；熯^程中觸發(fā)自噬后,能夠為逆境中的腫瘤細(xì)胞提供能量和原料,促進(jìn)腫瘤生存,從而導(dǎo)致耐藥性［10］。自噬已被證實在實體瘤,神經(jīng)膠質(zhì)瘤,骨肉瘤等多種細(xì)胞的耐藥過程扮演著著重要的角色［11-13］。然而,自噬是否參與睪丸癌細(xì)胞對順鉑的耐藥目前尚未明確。課題組前期已經(jīng)成功建立了耐順鉑睪丸癌細(xì)胞I-10/DDP［14］,為了探究順鉑是否誘導(dǎo)睪丸癌細(xì)胞自噬以及調(diào)控自噬對睪丸癌細(xì)胞的影響,本研究將觀察順鉑處理后,耐藥株I-10/DDP中自噬水平的變化及通過分子生物學(xué)方法沉默ATG基因后,觀察對順鉑作用后的自噬水平及細(xì)胞增殖的影響。該研究將為解決睪丸癌耐藥問題提供重要的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株與細(xì)胞培養(yǎng)

小鼠睪丸癌細(xì)胞株I-10購于美國ATCC細(xì)胞庫。課題組前期采用濃度遞增法成功構(gòu)建了耐順鉑睪丸癌細(xì)胞株I-10/DDP［14］。細(xì)胞培養(yǎng)于加入2.5%(V/V)胎牛血清,15%(V/V)馬血清,100 U/mL青霉素,100 U/mL鏈霉素的F12高糖培養(yǎng)基中。細(xì)胞貼壁生長在25 cm2的透氣培養(yǎng)瓶中,并培養(yǎng)于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2以及飽和濕度的培養(yǎng)箱中。0.25%胰酶細(xì)胞消化液(含0.02%EDTA)消化傳代,每周傳代2～3次。

1.2 主要試劑

F12 高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、馬血清、opti-MEM(Gibco)；ATG5、ATG7 干擾質(zhì)粒(吉瑪基因)、lipfectaminTM2000、預(yù)染蛋白(Marker)；胰酶消化液、細(xì)胞裂解液、苯甲基磺酰氟、BCA蛋白濃度測定盒、結(jié)晶紫染色液、SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液(×5)、順鉑(DDP)、二甲基亞砜(DMSO)、四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)；p62、LC3B、ATG5、ATG7 一抗(CST)；羊抗兔二抗、GAPDH、羊抗小鼠二抗。

1.3 shRNA轉(zhuǎn)染—干擾ATG5和ATG7基因

需要干擾的自噬相關(guān)基因為ATG5和ATG7,并由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計合成。

干擾ATG5 基因的序列為:5'-GCTTCGAGATG TGTGGTTTGG-3'

干擾ATG7 基因的序列為:5'-GAGGCTGGTAA GAACAGTAGC-3'

取對數(shù)生長期的I-10/DDP細(xì)胞,以1×105cells/mL的密度接種于6孔板中,密度達(dá)到60%左右,避光條件下,將5 μL lipfectaminTM2000和5 μL shRNA片段溶液分別與250 μL opti-MEM混合,室溫放置5 min后,將兩種溶液充分混合并室溫放置20 min。用opti-MEM補足至每孔溶液2 mL。8 h后更換為新鮮的含血清培養(yǎng)基,48 h 后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至一次性細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,細(xì)胞貼壁后更換含有G418的選擇培養(yǎng)基(G418的濃度為0.1 mg/mL)篩選細(xì)胞。干擾試驗分為以下4組:mock組:只加入lipfectaminTM2000轉(zhuǎn)染組；NC組:未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒對照組；shRNA-ATG5 組:轉(zhuǎn)染了shRNA-ATG5 質(zhì)粒；shRNA-ATG7組:轉(zhuǎn)染了shRNA-ATG7質(zhì)粒。

1.4 MTT法檢測細(xì)胞存活率

取對數(shù)生長期細(xì)胞株(或穩(wěn)轉(zhuǎn)株)以5×104/mL的密度接種于96孔板中,每組5個復(fù)孔,待細(xì)胞生長至60%左右用含15 μmol/L DDP新鮮培養(yǎng)基處理24 h后,加入15 μL MTT(5 mg/mL)孵育4 h,棄去培養(yǎng)基,每孔加入150 μL DMSO,37 ℃孵育30 min 后,酶標(biāo)儀檢測吸光度值(A490nm),重復(fù)3次。

1.5 透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)自噬體的形成情況

取對數(shù)生長期細(xì)胞株(或穩(wěn)轉(zhuǎn)株)以1×105/mL的密度接種于6孔板中,15 μmol/L DDP處理12 h后收集細(xì)胞,4 ℃,12 000 r/min離心5 min,PBS重懸后再離心,最后收集細(xì)胞至1.5 mL的離心管中。加入1 mL的固定液(2.5%戊二醛),4 ℃冰箱保存,將樣品送至中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床病理科處理。

1.6 mCherry-GFP-LC3B 轉(zhuǎn)染檢測自噬體和自噬溶酶體

mCherry-GFP-LC3B質(zhì)粒轉(zhuǎn)染可在靶細(xì)胞中有效表達(dá)紅色熒光蛋白mCherry,綠色熒光蛋白GFP和LC3的融合蛋白,通常用于檢測自噬流量的變化［15］。紅色熒光可指示自噬溶酶體形成的順利程度,紅色熒光越多,綠色熒光越少,從自噬體到自噬溶酶體階段流通的越順暢。將細(xì)胞(5×104cells/mL)接種到6孔板中,當(dāng)細(xì)胞生長至50%左右,根據(jù)mCherry-GFP-LC3B質(zhì)粒(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)轉(zhuǎn)染。8 h后更換新鮮培養(yǎng)基,48 h后,加入15 μmol/L DDP(Sigma-Aldrich)處理12 h,在共聚焦顯微鏡下觀察到GFP-LC3熒光。

1.8 集落克隆實驗

將細(xì)胞株(或穩(wěn)轉(zhuǎn)株)以5×104cells/mL的密度分別接種3 mL于直徑為35 mm的一次性細(xì)胞培養(yǎng)皿中,細(xì)胞貼壁后,用15 μmol/L DDP處理,觀察形成集落后(集落為顯微鏡下技術(shù)大于50個細(xì)胞克隆數(shù)),棄培養(yǎng)液,用PBS清洗2遍,多聚甲醛固定后,結(jié)晶紫染色,實驗重復(fù)3次,并拍照。

1.9 Western blot

分別收集給藥組及轉(zhuǎn)染組細(xì)胞,加入適量細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞后,收集蛋白并定量。制備12%SDS-PAGE凝膠；將蛋白樣品上樣,電泳,轉(zhuǎn)膜,封閉,孵抗體,一抗(LC3B、p62、ATG5、ATG7)4 ℃孵育過夜,二抗于室溫孵育2 h,TPBS 洗膜；ECT 發(fā)光試劑盒暗室發(fā)光,顯影；Bio-Rad 凝膠成像系統(tǒng)采集圖像,Bio Imaging system(Gene Genius)掃描灰度值定量分析。

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計分析,數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差,兩組之間均數(shù)比較采用兩樣本t檢驗,兩組以上均數(shù)比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗。統(tǒng)計圖表采用Graphpad Prism 5.0 繪制,P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 順鉑處理后I-10/DDP細(xì)胞內(nèi)自噬水平升高

Western blotting法檢測出I-10/DDP細(xì)胞在使用順鉑(15 μmol/L)處理后,LC3-Ⅱ的表達(dá)水平明顯增加(P=0.001),p62的表達(dá)水平降低(P=0.01,圖1A)。使用透射電子顯微鏡觀察順鉑處理后,I-10/DDP細(xì)胞中自噬體數(shù)量明顯增加(圖1B)。使用激光共聚焦顯微鏡觀察到順鉑處理后I-10/DDP內(nèi)紅色和綠色熒光亮點增加,合成的圖像中紅色熒光亮點(自噬溶酶體)和黃色熒光亮點(自噬體)均增加(圖1C)。

圖1 順鉑對I-10/DDP細(xì)胞中自噬水平的影響Fig.1 Effect of cisplatin on autophagy in I-10/DDP cells(n=3).A:Expressions of LC3 and p62 in I-10/DDP cells treated with cisplatin.B:Autophagosomes analyzed by transmission electron microscopy(Original magnification:×15 000).C:Autophagosomes and autolysosomes observed with confocal fluorescent microscopy(×400).*P=0.01,***P=0.001 vs control.

2.2 shRNA-ATG5和shRNA-ATG7抑制I-10/DDP細(xì)胞中ATG5和ATG7的表達(dá)

將shRNA-ATG5 和shRNA-ATG7 干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)入I-10/DDP 細(xì)胞后,Western blotting 法檢測出ATG5 和ATG7的表達(dá)量明顯降低(P=0.005,P<0.001,圖2)。

圖2 shRNA-ATG5和shRNA-ATG7對I-10/DDP細(xì)胞中ATG5和ATG7表達(dá)的影響Fig.2 Effect of shRNA-ATG5 and shRNA-ATG7 on expressions of ATG5 and ATG7 in I-10/DDP cells(n=3).A:ATG5.B:ATG7.Mock:Lipofectamine 2000.NC:Nonspecific control.**P<0.01,***P<0.001 vs NC group.

2.3 沉默ATG5、ATG7后抑制順鉑介導(dǎo)的自噬

順鉑(15 μmo/L)處理轉(zhuǎn)染組細(xì)胞后,Western blotting 法檢測出shRNA-ATG5+DDP 組和shRNAATG7+DDP組細(xì)胞中LC3Ⅱ的表達(dá)水平與NC+DDP組相比明顯降低,p62的表達(dá)水平明顯增加(圖3A)。透射電子顯微鏡觀察到shRNA-ATG5+DDP組和shRNAATG7+DDP組細(xì)胞中自噬體的數(shù)量明顯少于NC+DDP組(圖3B),激光共聚焦顯微鏡觀察到shRNA-ATG5+DDP組和shRNA-ATG7+DDP組細(xì)胞內(nèi)紅色和綠色熒光亮點與NC+DDP組相比減少,在合成的圖像中紅色熒光亮點(自噬溶酶體)和黃色熒光亮點(自噬體)數(shù)量均減少(圖3C)。

圖3 沉默ATG5、ATG7對順鉑介導(dǎo)的I-10/DDP細(xì)胞自噬水平的影響Fig.3 Effect of silencing ATG5 and ATG7 on cisplatin-mediated autophagy in I-10/DDP cells(P=3).A:Expressions of LC3 and p62 in I-10/DDP cells.B:Autophagosomes analyzed by transmission electron microscopy (×15 000).C:Autophagosomes and autolysosomes observed with confocal fluorescent microscopy(×400).***P<0.05.

2.4 沉默ATG5和ATG7抑制順鉑作用后的細(xì)胞增殖

順鉑(15 μmol/L)處理轉(zhuǎn)染組細(xì)胞后,MTT法檢測發(fā)現(xiàn)shRNA-ATG5+DDP組和shRNA-ATG7+DDP組的細(xì)胞存活率明顯低于NC+DDP組(P<0.001,圖4A)。集落克隆實驗檢測發(fā)現(xiàn)shRNA-ATG5+DDP 組和shRNA-ATG7+DDP 組的克隆形成率明顯低于NC+DDP組(圖4B)。

圖4 沉默ATG5和ATG7對I-10/DDP細(xì)胞增殖的影響Fig.4 Effect of Silencing ATG5 and ATG7 on proliferation in I-10/DDP cells (n=3).A:Cell viability measured by MTT assay.B:Cloning efficiency assessed by colony-forming assay.***P<0.001 vs NC+DDP group.

3 討論

鉑類金屬化合物是目前最常用于治療睪丸癌的一線化療藥物,通過抑制DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄,導(dǎo)致DNA斷裂和編碼錯誤進(jìn)而殺死癌細(xì)胞［16-17］。然而化療產(chǎn)生的耐藥問題是目前控制與治愈癌癥的重要挑戰(zhàn),這也是許多癌癥患者化療失敗的原因。

化療藥物刺激可誘導(dǎo)癌細(xì)胞自噬,進(jìn)而維持線粒體功能,減少DNA損傷,并為癌細(xì)胞提供氨基酸和ATP等營養(yǎng)物質(zhì),導(dǎo)致癌細(xì)胞存活期延長,繼而產(chǎn)生耐藥性［10］。已有研究表明在乳腺癌、宮頸癌、肝癌、胃癌等多種癌癥的化療中會激活自噬,進(jìn)一步導(dǎo)致化療耐藥性的產(chǎn)生［18-21］。本研究發(fā)現(xiàn),耐順鉑睪丸癌細(xì)胞I-10/DDP在使用順鉑處理后,LC3-Π的表達(dá)水平明顯增加,p62的表達(dá)水平降低,細(xì)胞中自噬溶酶體和自噬體的數(shù)量均增加。以上結(jié)果表明順鉑刺激下,睪丸癌耐藥株I-10/DDP細(xì)胞中自噬水平升高。這提示我們睪丸癌細(xì)胞I-10/DDP耐藥性的產(chǎn)生可能與順鉑刺激下自噬水平的異常增多有關(guān)。

有學(xué)者提出,通過藥理學(xué)或遺傳學(xué)方法抑制自噬可增強許多靶向療法的抗腫瘤作用,為臨床用藥提供理論依據(jù)［22-23］。在哺乳動物細(xì)胞中,自噬依賴于核心自噬蛋白(ATG)的功能在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成自噬小體,并進(jìn)一步調(diào)節(jié)和控制自噬形成的各個階段［24］。先前的研究表明［25-26］,ATG5 水平的波動在很大程度上影響自噬和凋亡,ATG5直接參與凋亡小體或自噬小體的形成,從而導(dǎo)致癌細(xì)胞對藥物的敏感性發(fā)生變化。巨噬細(xì)胞和肝癌細(xì)胞的共培養(yǎng)可以誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞中的自噬,而敲除ATG5可以抑制巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)的自噬,從而提高奧沙利鉑的療效［27］。另有研究報道［28］,下調(diào)ATG7 可以增加依賴caspase-9和caspase-3的細(xì)胞凋亡,并增強表柔比星的細(xì)胞毒性。因此猜測,通過調(diào)控ATG相關(guān)基因影響自噬水平,在治療睪丸癌細(xì)胞耐藥問題上具有一定的研究價值。本研究中使用shRNA質(zhì)粒沉默自噬相關(guān)基因ATG5、ATG7,并用順鉑處理沉默組細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn)沉默ATG5、ATG7 抑制順鉑介導(dǎo)的自噬作用。我們使用MTT 法和集落形成實驗檢測抑制自噬后,是否影響細(xì)胞對順鉑的敏感性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)沉默ATG5、ATG7的細(xì)胞在使用順鉑處理后,其細(xì)胞存活率更低,克隆形成率更低。這些結(jié)果表明,抑制I-10/DDP細(xì)胞自噬,可增強順鉑抑制細(xì)胞增殖,提高耐順鉑睪丸癌細(xì)胞對順鉑的敏感性。

綜上所訴,睪丸癌細(xì)胞I-10/DDP耐藥性的產(chǎn)生與自噬水平的升高有關(guān),通過沉默ATG5、ATG7可抑制順鉑介導(dǎo)的自噬并抑制睪丸癌細(xì)胞增殖。然而,順鉑誘導(dǎo)睪丸癌細(xì)胞自噬的機(jī)制目前尚未明確。有研究表明,化療藥物調(diào)控自噬的機(jī)制可能與PI3K/AKT/mTOR［29］、ERK/MAPK［30］、p53［31］等通路有關(guān),以上通路在增強腫瘤細(xì)胞的化療敏感性和避免耐藥性方面起著重要作用。課題組后期將對自噬與腫瘤耐藥的機(jī)制進(jìn)行深入研究,從而為睪丸癌的臨床治療提供理論依據(jù)。