李 莉 ,彭 莉 ,朱 進(jìn) ,巫靜嫻 ,趙 涌

重慶醫(yī)科大學(xué)1病理學(xué)教研室,2神經(jīng)科學(xué)研究中心//重慶醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,重慶400016

腦缺血再灌注損傷的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的病理生理過程,其中,氧化應(yīng)激反應(yīng)與腦缺血再灌注損傷繼發(fā)性神經(jīng)細(xì)胞死亡密切相關(guān)［1-2］。機(jī)體內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)的激活對腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)細(xì)胞的存活有至關(guān)重要的作用［3-4］。DJ-1(又稱PARK7,或者park7),是通過進(jìn)化選擇的多功能蛋白之一,在抗氧化應(yīng)激、抗凋亡以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因轉(zhuǎn)錄、分子伴侶等多方面發(fā)揮重要的作用,具高度保守性,在原核細(xì)胞和真核細(xì)胞中均有表達(dá)。DJ-1蛋白以同源二聚體的形式存在,單體呈螺旋片層螺旋的三明治結(jié)構(gòu),屬于Thij/PfpI家族［5-6］。近年來,人們發(fā)現(xiàn)DJ-1依靠其良好的抗氧化作用在保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞方面發(fā)揮重要功能［7-8］。DJ-1與帕金森疾病的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān),DJ-1 在帕金森疾病中能夠保護(hù)神經(jīng)元免受氧化應(yīng)激損傷［9-10］。最近,DJ-1在缺血性腦卒中的保護(hù)作用受到了廣泛的研究,但具體的機(jī)制仍不清楚。轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2(Nrf2)是轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一,它通過與抗氧化反應(yīng)元件(ARE)結(jié)合作為機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)的主調(diào)節(jié)器［11-13］。

我們之前的研究也已經(jīng)證實(shí),Nrf2/ARE作為體內(nèi)重要的抗氧化信號(hào)通路,上調(diào)Nrf2可以一定程度保護(hù)缺血后神經(jīng)損傷。DJ-1作為抗氧化蛋白,在Nrf2活性調(diào)控中發(fā)揮重要作用［14-15］。然而,DJ-1是通過上調(diào)Nrf2發(fā)揮抗氧化保護(hù)作用還是通過調(diào)節(jié)Nrf2的亞細(xì)胞定位,促進(jìn)Nrf2核轉(zhuǎn)移,激活其抗氧化功能,目前尚未有研究報(bào)道。本研究旨在探討DJ-1在腦缺血再灌注氧化應(yīng)激損傷中的作用及其相關(guān)調(diào)控機(jī)制,為進(jìn)一步防治腦缺血再灌注氧化應(yīng)激損傷提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試劑

DJ-1干擾片段及其亂序片段均合成于上海吉瑪公司。兔抗DJ-1單克隆抗體(1∶2000,Abcam)、兔抗Nrf2多克隆抗體(1∶200,Santa Cruz)、兔抗Nrf2單克隆抗體(1∶50,Abcam)、兔抗HO-1 單克隆抗體(1∶500,Cell Signaling Technology)、兔抗NQO1單克隆抗體(1∶500,Abcam)、β-actin 抗體(Proteintech)、二抗山羊抗兔IgG和二抗山羊抗鼠IgG(碧云天)。PVDF 膜和化學(xué)發(fā)光液ECL(Millpore)、RIPA 裂解液(強(qiáng))和1%PMSF(碧云天)、SOD和MD檢測試劑盒(南京建成)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

成年雄性SPF 級(jí)Sprague-Dawley 大鼠108 只,由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,體質(zhì)量250～280 g。將所有大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham 組,18只)、腦缺血再灌注模型組(MCAO 組,30 只)、亂序siRNA+MCAO組(Scramble組,18只)、DJ-1 siRNA+MCAO組(DJ-1 siRNA組,18只)、對照AAV+MCAO組(NC組,12 只)、DJ-1 AAV+MCAO 組(Overexpression 組,12只)。其中Sham 組僅做手術(shù)切口,不插入線栓；MCAO組進(jìn)行手術(shù)造模；Scramble組和DJ-1 siRNA組分別側(cè)腦室注射10 μL的亂序siRNA 和DJ-1 siRNA 再手術(shù)建模；NC組和Overexpression組分別側(cè)腦室注射2 μL的對照AVV 和DJ-1AVV 再手術(shù)建模。

所有實(shí)驗(yàn)均重慶醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)研究動(dòng)物倫理委員會(huì)授權(quán),并按照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的護(hù)理和使用指南》進(jìn)行操作。所選擇的動(dòng)物品種、等級(jí)、數(shù)量、規(guī)格合適。實(shí)驗(yàn)中善待動(dòng)物,給予麻醉和鎮(zhèn)痛處理,實(shí)驗(yàn)后給予安樂死,死后動(dòng)物無害化處理,沒有對環(huán)境帶來危害,實(shí)驗(yàn)符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究倫理標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 中腦動(dòng)脈栓塞(MCAO)模型的建立

將SD大鼠麻醉后按既往文獻(xiàn)報(bào)道［9］的方法進(jìn)行中腦動(dòng)脈栓塞(MCAO)模型構(gòu)建。用3.5%水合氯醛腹腔注射麻醉(350 mg/kg)大鼠。將大鼠仰臥位固定,消毒,頸部正中切口,按照解剖結(jié)構(gòu)依次分離出頸總動(dòng)脈(CCA)、頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)及頸外動(dòng)脈(ECA)。結(jié)扎頸總動(dòng)脈近心端和頸外動(dòng)脈,動(dòng)脈夾暫時(shí)夾閉頸內(nèi)動(dòng)脈。在頸內(nèi)動(dòng)脈遠(yuǎn)心端剪一小口,插入尼龍線栓,當(dāng)線栓越過頸總動(dòng)脈分叉處,繼續(xù)進(jìn)線約18～20 mm,可明顯感到阻力時(shí),說明線栓已經(jīng)到位。1 h后,緩慢拔出線栓,恢復(fù)血流灌注。Sham 組僅做手術(shù)切口并不插入線栓。

1.4 大鼠側(cè)腦室注射干擾片段

MCAO模型前24進(jìn)行左側(cè)側(cè)腦室注射siRNA片段,其干擾DJ-1 的siRNA 片段堿基序列sense:5-CCCAUUGGCUAAGGACAAATT-3；antisense:5-UU UGUCCUUAGCCAAUGGGTT-3,亂序的siRNA片段堿基序列:sense:5-UUCUCCGAACGUGUCACGUT T-3；antisense:5-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3,大鼠腹腔麻醉后用腦立體定位儀固定,以其大腦前囟縫為基準(zhǔn),向后1 mm、向左2 mm 定位左側(cè)側(cè)腦室。鉆孔,微量針吸取10 μL片段,進(jìn)針,進(jìn)針深度為3.5 mm,緩慢注射后再留針10 min。Sham組和MCAO組均只定位及顱骨鉆孔,不注射片段。

1.5 大鼠左側(cè)腦皮質(zhì)注射DJ-1 過表達(dá)腺相關(guān)病毒載體

MCAO模型前1月進(jìn)行左側(cè)側(cè)腦室注射DJ-1過表達(dá)的腺相關(guān)病毒(AAV)載體和不包含序列的腺相關(guān)病毒(對照)載體。CDS 序列(NM001277249)被用于在大鼠體內(nèi)過表達(dá)DJ-1 基因。大鼠腹腔麻醉后用腦立體定位儀固定,以其大腦前囟縫為基準(zhǔn),向前1.0 mm、向左2.0 mm 和向后3.0 mm、向左1.5 mm 兩處定位左側(cè)腦皮質(zhì)。鉆孔,微量針吸取2 μL腺相關(guān)病毒,進(jìn)針,進(jìn)針深度為1.2 mm,緩慢注射后再留針10 min。

1.6 神經(jīng)功能評分

再灌注24 h后,參照Longa［9］的5級(jí)4分為評分標(biāo)準(zhǔn):0 分:無明顯的神經(jīng)功能缺損；1分:大鼠不能完全伸長右側(cè)前肢；2 分 行走時(shí)向?qū)?cè)打圈；3 分:行走時(shí)向?qū)?cè)傾倒；4 分:不能自發(fā)行走,意識(shí)喪失。

1.7 腦含水量測定

再灌注24 h后,將大鼠處死后斷頭取腦,去掉小腦和腦干,分離出整個(gè)大腦,稱質(zhì)量得濕重。120 ℃恒溫干燥箱烘干至重量恒定,稱重得干重。腦含水量=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.8 石蠟切片制備

再灌注24 h后,將大鼠麻醉后用4%多聚甲醛進(jìn)行心腦灌注,四肢和軀干僵直后,快速斷頭取腦,將大腦置于4%甲醛中固定。腦組織做冠狀切塊,將帶有腦皮質(zhì)梗死區(qū)的腦塊常規(guī)脫水后包埋。制作厚度為5 μm的石蠟切片。

1.9 HE 染色和Nissl 染色

HE 染色:脫蠟,進(jìn)入蘇木精染室溫下染色10 min,自來水沖洗,鹽酸酒精分化10 s,飽和碳酸鋰返藍(lán)3 min,反復(fù)洗滌。伊紅復(fù)染,水洗,脫水,透明,封片。Nissl 染色:脫蠟,進(jìn)入10%亞甲藍(lán)溶液室溫下染色20 min,蒸餾水洗滌,95%酒精分化,脫水,透明,封片。置于普通光學(xué)顯微鏡觀察拍片,計(jì)數(shù)完整神經(jīng)元數(shù)。

1.10 MDA和SOD測定

再灌注24 h后,生理鹽水灌注后斷頭取腦,分離出大腦皮質(zhì)缺血區(qū)域,稱重后放入玻璃勻漿器中,加入9倍量預(yù)冷的生理鹽水,勻漿充分后2000 r/min 低溫離心15 min,取上清液。按試劑盒說明書操作并計(jì)算。組織中的MDA含量計(jì)算公式:組織中的MDA含量(nmol/mg prot)=(測定管吸光度-測定空白管吸光度)/(標(biāo)準(zhǔn)管吸光度-標(biāo)準(zhǔn)測定管吸光度)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度(10 nmol/mL)÷待測樣本蛋白濃度(mg prot/mL)。組織勻漿中SOD活力計(jì)算公式:組織勻漿中SOD活力(U/mgprot)=(對照管吸光度-測定管吸光度)/對照管吸光度÷50%×反應(yīng)液總體積/取樣量(mL)÷組織蛋白含量(mg prot/mL)。

1.11 Western blot檢測

再灌注24 h后,快速斷頭取腦,提取組織總蛋白,采用BCA 法測定蛋白濃度。根據(jù)所測蛋白濃度計(jì)算上樣量。配膠SDS 凝膠、上樣、電泳、切膠、轉(zhuǎn)膜、封閉后,加入稀釋好的目的蛋白一抗4 ℃孵育過夜,TBST洗膜后,加入稀釋好的目的蛋白的二抗,室溫孵育2 h,TBST 洗膜后,ECL 化學(xué)發(fā)光檢測。運(yùn)用ImageJ軟件分析,目的蛋白的相對表達(dá)量=目的蛋白條帶吸光度值/內(nèi)參β-actin 條帶吸光度值。

1.12 免疫熒光染色

再灌注24 h后,快速斷頭取腦,將大腦脫水后制作成冰凍切片。將冰凍切片用預(yù)冷4%多聚甲醛固定20 min,PBS漂洗3次,每次5 min。滴加封閉血清(5%FBS+0.01%Triton X-100 溶于PBS),37 ℃孵育60 min。封閉完成后,加入稀釋好的Nrf2(1∶50,Abcam),4 ℃濕盒過夜,PBS漂洗3次,每次5 min。避光加入紅色熒光二抗(1∶200),37 ℃孵育30 minPBS漂洗3次,每次5 min。含DAPI 的防熒光淬滅封片劑封片,熒光顯微鏡下觀察。

1.13 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用Prism軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。組間比較用單因素方差分析,并結(jié)合Tukey's檢驗(yàn)分析,P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 干擾DJ-1加重腦缺血再灌注后神經(jīng)功能缺損和腦水腫

大鼠腦MCAO 模型后進(jìn)行神經(jīng)功能學(xué)評分。Sham組無神經(jīng)功能缺損,評分為0 分。與Sham 組相比,MCAO 組大鼠神經(jīng)功能學(xué)評分增加(P<0.001),干擾DJ-1后,大鼠神經(jīng)功能學(xué)評分進(jìn)一步增加(P<0.001)。同樣,與Sham組相比,MCAO組大鼠腦含水量增加(P<0.001),與MCAO組相比,DJ-1 siRNA組的腦含水量顯著加重(P<0.001,圖1)。

圖1 干擾DJ-1基因?qū)ι窠?jīng)功能缺損和腦水腫的影響Fig.1 Effect of DJ-1 interference on neurological deficit scores and brain water content(n=6).A:Neurological deficit scores.B:Brain water content.*P<0.05 vs Sham group;#P<0.05 vs MCAO group.

2.2 干擾DJ-1加重腦I/R 后神經(jīng)細(xì)胞損傷

HE染色結(jié)果顯示,Sham 組中大鼠腦組織結(jié)構(gòu)完整,排列規(guī)則緊密。與Sham 組比較,MCAO 組和Scramble組腦組織水腫疏松、細(xì)胞排列紊亂,神經(jīng)元出現(xiàn)壞死、核固縮(P<0.001)。而DJ-1 siRNA 組腦組織水腫更加嚴(yán)重,大量空泡形成,大多數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)核碎裂、核固縮,核溶解,完整細(xì)胞數(shù)量明顯減少(P<0.001)。Nissl 染色結(jié)果顯示,sham 組神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰,在胞質(zhì)中尼氏小體均勻分布,呈藍(lán)色顆粒狀；MCAO 組和Scramble組腦組織水腫疏松,神經(jīng)元胞漿濃縮,核固縮,尼氏體染色不清,完整神經(jīng)元數(shù)量減少(P<0.001)；干擾DJ-1后,腦組織結(jié)構(gòu)更加疏松,神經(jīng)元萎縮,核固縮、碎裂,完整神經(jīng)元數(shù)量極少,尼氏體也幾乎消失殆盡(P<0.001)。

2.3 干擾DJ-1加重腦I/R 后腦組織氧化應(yīng)激水平

MDA和SOD用于評價(jià)腦I/R 后腦組織氧化應(yīng)激水平,如圖2所示,與Sham組相比,MCAO 組MDA含量明顯增加,而SOD 活性顯著降低(P<0.001)。Scramble組和MCAO 組的SOD 和MDA 無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與MCAO 組比,DJ-1 siRNA組的MDA 含量進(jìn)一步增加,而SOD 活性進(jìn)一步降低(P<0.001)。

圖2 干擾DJ-1基因?qū)δX組織形態(tài)學(xué)的影響Fig.2 Histological assessment of the effect of DJ-1 interference using HE staining and Nissl staining(Original magnification:×400).*P<0.001 vs Sham group(n=6);#P<0.001 vs MCAO group(n=6).

2.4 DJ-1促進(jìn)腦I/R 后Nrf2的表達(dá)

與Sham 組相比,MCAO 組的DJ-1 表達(dá)明顯增加,干擾DJ-1 后,DJ-1 蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(P=0.003,圖3A,C)。與Sham組相比,MCAO組的Nrf2蛋白水平明顯增加,與MCAO組相比,DJ-1siRNA組的Nrf2蛋白水平明顯降低(P<0.001)。與MCAO組相比,Overexpression組的DJ-1表達(dá)明顯增加(P=0.006,圖3B、E)。同樣,過表達(dá)DJ-1后,Nrf2蛋白水平明顯增加(P=0.006)。

圖3 干擾DJ-1基因?qū)DA含量和SOD活性的影響Fig.3 Effects of DJ-1 interference on MDA content (A) and SOD activity (B).*P<0.001 vs Sham group(n=6);#P<0.001 vs MCAO group(n=6).

2.5 DJ-1明顯降低腦I/R 后Nrf2入核

與Sham組相比,MCAO組的Nrf2表達(dá)明顯增加,與MCAO組相比,DJ-1 siRNA組的Nrf2表達(dá)明顯降低(P<0.001,圖4)。與Sham組相比,MCAO組的Nrf2表達(dá)以及入核明顯增加,與MCAO組相比,Overexpression組的Nrf2表達(dá)以及入核明顯增加(P<0.001,圖4C)。

2.6 DJ-1促進(jìn)腦I/R 后HO-1和NQOI的表達(dá)

與Sham組相比,腦I/R損傷后HO-1和NQOI的蛋白水平明顯上調(diào)(P<0.001)。干擾DJ-1可以抑制HO-1和NQOI的蛋白水平。用DJ-1過表達(dá)腺相關(guān)病毒過表達(dá)DJ-1后,與MCAO組相比,Overexpression組的HO-1(P<0.004)和NQOI(P=0.014)的蛋白水平明顯增加(圖4)。

圖4 DJ-1對Nrf2表達(dá)的影響Fig.4 Effects of DJ-1 overexpression on expression of Nrf2.A,B:Western blotting of DJ-1 and Nrf2.C,E:Relative expression level of DJ-1 protein.D,F:Relative expression level of Nrf2 protein.*P<0.001 vs Sham group;#P<0.001 vs MCAO group;*#P<0.001 vs MCAO group.

3 討論

腦缺血再灌注損傷觸發(fā)的氧化應(yīng)激反應(yīng)可損害神經(jīng)元,導(dǎo)致其死亡或凋亡［16-17］。氧化應(yīng)激通過對神經(jīng)元死亡-生存機(jī)制的調(diào)節(jié),成為腦缺血再灌注損傷關(guān)鍵病理生理環(huán)節(jié)［1-2］。在本研究中,我們通過構(gòu)建大鼠腦MCAO模型模擬大鼠腦缺血再灌注損傷,發(fā)現(xiàn)缺血再灌注損傷后,出現(xiàn)大鼠神經(jīng)功能缺失,以及腦水腫和神經(jīng)元死亡。同時(shí),MDA含量增加,SOD活性降低。這些結(jié)果表明腦缺血再灌注損傷觸發(fā)的氧化應(yīng)激反應(yīng)是神經(jīng)元損傷或死亡的關(guān)鍵原因。因此,尋找抵抗腦缺血再灌注氧化應(yīng)激損傷的關(guān)鍵分子是本研究的目的。DJ-1是具有神經(jīng)保護(hù)作用的重要抗氧化蛋白之一,既往對其的功能及機(jī)制的研究多集中在帕金森等慢性神經(jīng)退行性疾病上。雖然,DJ-1在腦缺血再灌注氧化應(yīng)激損傷方面的功能及機(jī)制尚不清楚。但我們有理由推測DJ-1 可能是抵抗腦缺血再灌注氧化應(yīng)激損傷的關(guān)鍵分子。有研究表明,DJ-1在缺血刺激下會(huì)誘導(dǎo)其表達(dá)水平增高［18］。預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果及相關(guān)文獻(xiàn)［19］顯示腦缺血再灌注損傷后24 h時(shí)DJ-1蛋白表達(dá)最高,因此本研究選取這一時(shí)間點(diǎn)來研究DJ-1在腦缺血再灌注損傷中的功能及相關(guān)機(jī)制。

圖5 DJ-1對Nrf2入核的影響Fig.5 Effect of DJ-1 expression on Nrf2 transfer into the nucleus.A:Western blotting of Nrf2 in the nucleus.B:Relative expression level of Nrf2 in the nucleus.C:Immunocytochemistry(Original magnification:×400).*P<0.001 vs Sham group(n=6);#P<0.001 vs MCAO group(n=6).

為了探討DJ-1在腦缺血再灌注損傷中的神經(jīng)保護(hù)功能。本研究應(yīng)用小分子干擾RNA(siRNA)技術(shù)干擾DJ-1的表達(dá)。siRNA因其特異性、高效性在科學(xué)研究中廣泛使用［20-21］。在我們的研究中,DJ-1 siRNA處理后,腦缺血再灌注損傷所引起的神經(jīng)行為學(xué)損傷加重,證實(shí)了DJ-1在缺血性腦卒中的神經(jīng)保護(hù)作用。腦缺血再灌注損傷后會(huì)觸發(fā)機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)發(fā)生。SOD 和MDA的含量是衡量腦組織氧化應(yīng)激的重要指標(biāo),SOD能清除機(jī)體內(nèi)自由基,體內(nèi)MDA 含量不但直接反映脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的水平和程度,而且間接反映機(jī)體清除自由基的能力。腦缺血再灌注損傷后,腦組織SOD 含量降低,MDA 含量增加,且干擾DJ-1后兩者改變增加更顯著。這些結(jié)果表明DJ-1能夠減輕腦缺血再灌注氧化應(yīng)激損傷。

Nrf2 是轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一,是調(diào)控機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)的一個(gè)關(guān)鍵核轉(zhuǎn)錄因子［22-23］。在我們之前的研究中,均證實(shí)在腦缺血再灌注損傷中Nrf2發(fā)揮了重要的神經(jīng)保護(hù)作用。DJ-1和Nrf2同抗氧化應(yīng)激的關(guān)鍵分子,兩者之間的關(guān)系需要進(jìn)一步去研究。Clements等發(fā)現(xiàn),DJ-1能夠影響Nrf2的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄功能［24］。DJ-1通過抑制Nrf2 泛素化,阻止其與Keap1 的結(jié)合,促進(jìn)Nrf2向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)運(yùn)［25-26］。因此,DJ-1可能作為Nrf2的上游信號(hào)分子,在Nrf2活性調(diào)控扮演著重要的角色［14］。并且,DJ-1將通過怎樣的方式來調(diào)控Nrf2還有待進(jìn)一步明確。

圖6 DJ-1對HO-1和NQO1表達(dá)的影響Fig.6 Effect of DJ-1 expression on expression of HO-1 and NQO1.A,B:Western blotting of HO-1 and NQO1.C,E:Relative expression level of HO-1 protein;D,F:Relative expression level of NQO1 protein.*P<0.001 vs Sham group;#P<0.001 vs MCAO group;*#P<0.001 vs MCAO group(n=6).

我們觀察到干擾DJ-1能夠降低腦組織Nrf2的表達(dá)并阻止了Nrf2的核積累。同樣,免疫熒光染色結(jié)果提示過表達(dá)DJ-1促進(jìn)了Nrf2的表達(dá)和核累計(jì)。這些結(jié)果表明,DJ-1可能是通過上調(diào)Nrf2的表達(dá)并促進(jìn)Nrf2向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)運(yùn),來調(diào)控機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)。

正常情況下,Nrf2 與細(xì)胞漿中的Keap1 蛋白相結(jié)合,使Nrf2 的活性受到抑制。當(dāng)受到氧化應(yīng)激反應(yīng)刺激時(shí),Nrf2轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)與抗氧化反應(yīng)元件(ARE)結(jié)合,介導(dǎo)抗氧化酶基因的轉(zhuǎn)錄激活,如:血紅素加氧酶-1(HO-1)、醌氧化還原酶1(NQO1)谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)家族等［27-28］。Nrf2通常是通過Nrf2/ARE途徑調(diào)節(jié)phaseII解毒酶和抗氧化酶(如HO-1、NQO1等)表達(dá)的中樞信號(hào)開關(guān)［29-30］。那么,DJ-1誘導(dǎo)的核轉(zhuǎn)運(yùn)的Nrf2可能與ARE結(jié)合,并通過轉(zhuǎn)錄激活下游的抗氧化酶來對抗氧化應(yīng)激引起的損傷。因此,我們檢測了HO-1、NQO1的表達(dá)。我們發(fā)現(xiàn)干擾DJ-1后,HO-1和NQO1蛋白水平降低。過表達(dá)DJ-1明顯上調(diào)HO-1和NQO1蛋白水平。表明DJ-1能夠通過正向調(diào)控Nrf2信號(hào)通路調(diào)節(jié)抗氧化酶HO-1和NQO1的表達(dá)。

綜上所述,DJ-1 作為體內(nèi)重要的神經(jīng)保護(hù)因子,可以減少M(fèi)CAO后大鼠氧化應(yīng)激損傷,并且這種保護(hù)功能可能與其對細(xì)胞重要的核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2及下游信號(hào)通路的激活密切相關(guān)。