陳 龍,于愛(ài)華,王冬梅,李 波

(黑龍江省北大荒綠色健康食品有限責(zé)任公司,黑龍江佳木斯 154000)

大豆富含豐富的營(yíng)養(yǎng)成分,含有大量的蛋白質(zhì)、脂肪和碳水化合物,此外還含有豐富的維生素,含有人體所必需的8種氨基酸。而豆乳是大豆食品中的一種,含有多種功能性成分如大豆低聚糖、異黃酮和軟磷脂等,一直受到消費(fèi)者的青睞,行業(yè)發(fā)展迅速,其產(chǎn)量和產(chǎn)品品種也在不斷增加。但在傳統(tǒng)工藝制備豆乳的過(guò)程中,蛋白質(zhì)容易凝集沉淀,嚴(yán)重時(shí)出現(xiàn)分層現(xiàn)象,嚴(yán)重影響其感官質(zhì)量和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。針對(duì)豆乳穩(wěn)定性的提高,大量的研究主要集中在傳統(tǒng)工藝參數(shù)的優(yōu)化,尚不能解決長(zhǎng)期存儲(chǔ)過(guò)程中豆乳穩(wěn)定性的問(wèn)題。

生物解離技術(shù)是一種新型的生物技術(shù),廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域。眾多研究學(xué)者主要研究采用生物解離技術(shù)提取植物油脂和蛋白質(zhì)。張根生等[1]在研究水酶法提取南瓜籽油過(guò)程中,聯(lián)合化學(xué)法進(jìn)行破乳。吳海波等[2]對(duì)大豆油工藝乳狀液的破乳開(kāi)展了相關(guān)研究,發(fā)現(xiàn)解離條件在pH8.0,解離時(shí)間為3 h,破乳效果最好。同時(shí),研究學(xué)者采用生物解離技術(shù)成功的從核桃中提取植物油脂[3]。王歡等[4]采用生物解離技術(shù)研究富肽豆粉蛋白質(zhì)亞基及功能性的變化。鐘明明等[5]將生物解離大豆膳食纖維作為一種改性膳食纖維應(yīng)用于餅干中,開(kāi)發(fā)新型大豆膳食纖維烘焙食品。生物解離技術(shù)結(jié)合傳統(tǒng)豆乳的制備工藝,對(duì)豆乳穩(wěn)定性的分析未見(jiàn)報(bào)道。

因此,本實(shí)驗(yàn)采用生物解離技術(shù)結(jié)合傳統(tǒng)豆乳的生產(chǎn)工藝,測(cè)定粒徑分布、Zeta電位、流變學(xué)特性、乳化活性和乳化穩(wěn)定性,并結(jié)合多重光散射分析,探究生物解離時(shí)間對(duì)豆乳穩(wěn)定性的影響,從而為生物解離豆乳的增值利用提供新思路,為開(kāi)發(fā)新型豆乳產(chǎn)品提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

東農(nóng)42大豆 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆研究中心;Alcalase 2.4 L堿性蛋白酶10萬(wàn)酶活力 諾維信(中國(guó))生物技術(shù)有限公司;磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鹽酸 天津市耀華化工廠;氫氧化鈉 天津市天大化學(xué)試劑廠;十二烷基硫酸鈉(SDS) 博士德生物有限公司;麥芽糖漿 山東西王糖業(yè)有限公司;消泡劑 美博食品科技有限公司;其它試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

JE-502電子天平 上海浦春計(jì)量?jī)x器有限公司;FA2004電子分析天平 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司;HH-4電熱恒溫水浴鍋 余姚市東方電工儀器廠;Mastersize2000激光粒度分析儀 英國(guó)伍斯特郡馬爾文儀器有限公司;多重光散射儀 德國(guó)Dataphysics公司;Turbiscan Lab Expert穩(wěn)定性分析儀 法國(guó)Formulaction公司;DHG-9240A型電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;PHS-25C數(shù)字酸度計(jì) 上海大普儀器有限公司;ZetaPALS-Zeta電位儀 美國(guó)布魯克海文儀器公司;722型可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 生物解離豆乳的制備 大豆生物解離豆乳制備流程參考江連洲的方法[6],過(guò)程如下:

大豆→清理→浸泡(6 h)→磨漿(干豆∶水=1∶6)→過(guò)濾(過(guò)200目篩布)→豆乳→生物解離(2.0‰Alcalase 2.4 L堿性蛋白酶v/v,50 ℃,pH=8,0、10、20、30 min)→滅酶(沸水浴10 min)→冷卻→調(diào)配濃縮(pH=7.0～7.2)→均質(zhì)(10 MPa,5 min)→生物解離豆乳。

1.2.2 多重光散射穩(wěn)定性的測(cè)定 參考姚盛宇[7]的測(cè)定方法。利用多重光散射穩(wěn)定性分析儀測(cè)量生物解離作用時(shí)間下的豆乳穩(wěn)定性,并測(cè)定動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定指數(shù)(TSI)。將準(zhǔn)備好的樣品加入到多重光散射穩(wěn)定性分析儀的樣品分裝瓶中(樣品含量約20 mL),將分裝好的樣品瓶平穩(wěn)的置于樣品槽內(nèi),波長(zhǎng)880、55 mm長(zhǎng)度上每40 μm掃描一次,每個(gè)樣品掃描時(shí)間為4 h,每2 min掃描一次,得到原始光學(xué)數(shù)據(jù)。

1.2.3 流體動(dòng)力學(xué)半徑及其分布測(cè)定 參考Shao[8]的測(cè)定方法。采用動(dòng)態(tài)光散射技術(shù),利用激光粒度分析儀測(cè)定生物解離豆乳的粒度分布。參數(shù)設(shè)置為:樣品折射率1.520,顆粒吸收率0.001,分散劑為水,分散劑折射率1.330。試驗(yàn)采用D4,3,即體積平均直徑表征液滴粒度的大小,生物解離豆乳樣品制備出后立即測(cè)定,每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.2.4 Zeta電位測(cè)定 采用ZetaPALS-Zeta電位儀測(cè)定樣品的Zeta電位,通過(guò)pH7.0 0.05 mol/L的磷酸鹽緩沖液來(lái)稀釋生物解離豆乳中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度到2 mg/mL,上樣體積為1 mL,測(cè)定溫度為25 ℃,溫度平衡2 min。計(jì)算3次重復(fù)得到的平均值為測(cè)定值。

1.2.5 流變學(xué)特性的測(cè)定 參考Wang等[9]的方法。利用DHR-1流變儀測(cè)定生物解離豆乳的穩(wěn)態(tài)流變性質(zhì),在試驗(yàn)臺(tái)上取1.00 mL的豆乳加在樣品測(cè)試臺(tái)上,溫度設(shè)置為25 ℃,采用40.00 mm平行板夾具,狹縫距離設(shè)置為0.50 mm,剪切速率為0～100 s-1,檢測(cè)樣品流變特性。

1.2.6 乳化活性與乳化穩(wěn)定性測(cè)定 參照Shao等[10]的方法,乳化活性(emulsion activity index,EAI)與乳化穩(wěn)定性(emulsion stability index,ESI):取30 mL不同生物解離作用時(shí)間下的豆乳,分別加入10 mL大豆油均質(zhì)使其混合均勻,取50 μL上述溶液加入5 mL 0.1%(m/V)SDS溶液,渦漩振蕩混勻后在500 nm波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度A0。靜置30 min后再次測(cè)定吸光度A30。乳化活性EAI(m2/g)和乳化穩(wěn)定性ESI(min)計(jì)算公式如下所示:

式中:N為稀釋倍數(shù)(250);C生物解離作用下豆乳溶液中蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度(g/mL);Φ為豆乳中油相體積分?jǐn)?shù);A0、A30分別為0、30 min時(shí)的吸光度值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 多重光散射穩(wěn)定性的測(cè)定

圖1為生物解離條件下的豆乳溶液的多重光散射分析,當(dāng)樣品經(jīng)過(guò)掃描后,其透射光曲線和背散射光曲線均為一條線時(shí),表明溶液均一,樣品粒徑大小一致性較高。由圖1可知,在生物解離作用下,豆乳樣品均一性較好,較穩(wěn)定。在生物解離作用時(shí)間為30 min時(shí),樣品的均一性和穩(wěn)定性最好。TSI穩(wěn)定性指數(shù)代表了整體分散體系的穩(wěn)定性,數(shù)值越大,表明體系越不穩(wěn)定[11]。由TSI曲線可知,隨著時(shí)間的增加,TSI數(shù)值不斷升高,穩(wěn)定性越來(lái)越差。在相同掃描時(shí)間,生物解離作用30 min時(shí),TSI數(shù)值最小,表面體系的穩(wěn)定性最好。

圖1 生物解離作用時(shí)間對(duì)豆乳穩(wěn)定性的影響Fig.1 Effect of biological dissociation time on the stability of soymilk注:TSI圖中橫坐標(biāo)為時(shí)間，m表示min,如2 h:20 m為2 h，20 min,其它同。

2.2 流體動(dòng)力學(xué)半徑及其分布測(cè)定

本文利用動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)研究分析不同生物解離作用時(shí)間下,豆乳的粒徑分布及平均粒徑的大小,其粒徑變化主要由樣品中蛋白質(zhì)分子內(nèi)的交聯(lián)和聚集引起。由圖2和圖3可知,隨著生物解離作用時(shí)間的延長(zhǎng),平均粒徑變小,粒徑主要分布在100～1000 nm，經(jīng)生物解離作用20 min時(shí),豆乳體系的平均粒徑為456 nm。說(shuō)明在生物解離作用下,堿性蛋白酶破壞了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu),蛋白質(zhì)顆粒發(fā)生了解聚作用,使得蛋白質(zhì)顆粒不斷變小,平均粒徑不斷降低,因在本試驗(yàn)中生物解離作用對(duì)象為濃度較低的豆乳溶液,粘度較低,分子碰撞機(jī)率降低,未引起蛋白質(zhì)分子的聚集,因此,平均粒徑不斷降低。張興等[12]研究了生物解離條件下,大豆乳狀液粒徑分布情況,發(fā)現(xiàn)隨著生物解離作用時(shí)間的延長(zhǎng),平均粒徑先減少后增加,其粒徑增大是因生物解離作用改變了乳液油滴表面的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),引起油滴表面的靜電作用發(fā)生變化,同時(shí)增加了乳液中分子碰撞的機(jī)率,使乳油滴分子間趨于聚集。王立敏等[13]研究pH對(duì)蛋白質(zhì)粒徑分布情況發(fā)現(xiàn),在接近蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時(shí),表面凈電荷最少,靜電斥力最小,蛋白質(zhì)發(fā)生解聚,充分伸展,活性殘基充分暴露,蛋白質(zhì)之間作用力最強(qiáng),聚集速度最快,此時(shí)粒徑最大。在偏離等電點(diǎn)時(shí),靜電斥力增大,蛋白質(zhì)之間結(jié)合能力減弱,不易發(fā)生聚集,此時(shí)粒徑最小。

圖2 生物解離作用時(shí)間對(duì)豆乳的粒徑分布的影響Fig.2 Effect of biological dissociation time on particle size distribution of soymilk

圖3 生物解離作用時(shí)間對(duì)豆乳平均粒徑的影響Fig.3 Effect of biological dissociation time on the average particle size of soymilk注:不同字母代表差異顯著(P<0.05),圖4、圖6同。

2.3 Zeta電位測(cè)定分析

界面電勢(shì)即Zeta電位用以表示對(duì)溶液中顆粒聚結(jié)造成的動(dòng)力學(xué)障礙能力,促使溶液具有較好的穩(wěn)定性[14]。生物解離作用時(shí)間對(duì)豆乳體系Zeta電位的影響如圖4所示,經(jīng)生物解離作用20 min時(shí),Zeta電位值為28.9 mV,在生物解離作用時(shí)間為30 min時(shí),電位絕對(duì)值最大為30.3 mV,此條件下的溶液中顆粒間的斥力較大,體系處于相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)。隨著生物解離作用時(shí)間的增加,電位絕對(duì)值不斷增大,說(shuō)明生物解離作用有效增加了豆乳溶液體系界面電荷密度,增加了液滴間斥力,提高了豆乳體系的穩(wěn)定性。在生物解離作用時(shí)間20和30 min時(shí),電位絕對(duì)值均較大,變化不顯著,說(shuō)明在長(zhǎng)時(shí)間的生物解離作用下,豆乳溶液體系界面電荷密度較大,電位絕對(duì)值差異不顯著。陳林等[15]研究界面吸附蛋白電荷的靜電斥力會(huì)影響油滴表面分子間的相互作用,而乳液的穩(wěn)定性與界面吸附蛋白有密切關(guān)系,因此推測(cè)乳液的穩(wěn)定性有可能與表面分子間的相互作用有關(guān)。

圖4 生物解離作用時(shí)間對(duì)豆乳 Zeta 電位的影響Fig.4 Effect of biological dissociation time on Zeta potential of soymilk

2.4 流變學(xué)特性的測(cè)定分析

生物解離作用時(shí)間對(duì)豆乳黏度的影響如圖5所示,在不同的生物解離作用時(shí)間條件下,豆乳的黏度隨頻率的變化趨勢(shì)基本相同,隨著頻率的不斷增加,豆乳的粘度呈現(xiàn)遞減趨勢(shì),表明經(jīng)過(guò)不同生物解離作用時(shí)間處理后,豆乳具有典型的假塑性流體的特征,且豆乳粘度的初始值和曲線形狀具有一定的差異,這主要是由于豆乳本身的性質(zhì)、顆粒間的相互作用、粒徑分布和形變對(duì)流變學(xué)性質(zhì)具有一定影響[16]。試驗(yàn)結(jié)果表明,生物解離作用后的豆乳界面成分發(fā)生變化,這可能是由于界面蛋白的水解使豆乳體系中蛋白大分子與水之間相互作用力減弱,導(dǎo)致粘度隨之降低。另外,也可能是由于生物解離處理使得豆乳界面蛋白表面的負(fù)電性增強(qiáng),導(dǎo)致界面蛋白與水的相互作用增強(qiáng),引起粘度的降低[17]。

圖5 生物解離作用時(shí)間對(duì)豆乳粘度的影響Fig.5 Effect of biological dissociation time on viscosity of soymilk

2.5 乳化穩(wěn)定性測(cè)定

EAI表示的是溶液中蛋白/肽能夠強(qiáng)烈吸附在油-水界面形成乳化層的能力;ESI代表溶液中乳滴的穩(wěn)定能力。所以,EAI及ESI為表征溶液中蛋白質(zhì)/肽乳化特性及穩(wěn)定特性的重要指標(biāo)之一[18]。Zhao等[19]及Lam等[20]研究發(fā)現(xiàn)生物解離不利于蛋白質(zhì)的乳化特性,蛋白質(zhì)的乳化特性和肽的尺寸之間存在明確聯(lián)系,即酶解產(chǎn)生的小分子量肽會(huì)使蛋白質(zhì)溶解性增加,降低蛋白質(zhì)的乳化特性;同時(shí),小分子量肽會(huì)降低界面張力不足以穩(wěn)定乳液,也會(huì)削弱其乳化特性。不同生物解離作用時(shí)間下豆乳的EAI和ESI的變化如圖6所示,隨著生物解離作用時(shí)間的增加,EAI和ESI均呈現(xiàn)遞減的變化趨勢(shì),且變化顯著,這主要由于隨著生物解離過(guò)程的進(jìn)行,吸附在油滴表面的蛋白被酶解成小分子量的肽,導(dǎo)致其從油滴表面脫落,再重新與油滴吸附時(shí),就不能迅速的吸附在油滴表面,界面膜就會(huì)遭受破壞,無(wú)法保持完整性,其EAI和ESI就會(huì)大幅度降低[21-23]。另外,蛋白酶的過(guò)度酶解也會(huì)使維持界面蛋白內(nèi)部結(jié)構(gòu)的力(例如氫鍵、范德華力、離子鍵等)慢慢被破裂,使包裹油滴的保護(hù)膜越來(lái)越薄,導(dǎo)致EAI和ESI的降低[24-25]。

圖6 生物解離作用時(shí)間對(duì)豆乳蛋白EAI及ESI的影響Fig.6 Effect of biological dissociation time on activity index and stability index of soymilk

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究可知,生物解離技術(shù)結(jié)合傳統(tǒng)豆乳制備工藝,可有效提高豆乳的穩(wěn)定性,生物解離時(shí)間不同對(duì)豆乳穩(wěn)定性的影響不同。經(jīng)生物解離30 min后,豆乳溶液體系的Zeta電位絕對(duì)值最大為30.3 mV,平均粒徑變小。以上結(jié)果表明,生物解離對(duì)豆乳穩(wěn)定性的提高效果顯著,可作為一種改變豆乳穩(wěn)定性的手段,對(duì)豆乳穩(wěn)定性進(jìn)一步研究提供理論依據(jù),但經(jīng)過(guò)生物解離后,豆乳體系的乳化性能降低,適口性變差。因此,開(kāi)發(fā)長(zhǎng)期貯存穩(wěn)定性與感官特性良好的豆乳具有重要意義。