李巖，郭曉茹，馮文凱，劉明亮，王丹，夏桂民

·論著·

HPLC法測定吉西他濱氨基甲酸酯脂質(zhì)體中主藥的含量

李巖，郭曉茹，馮文凱，劉明亮，王丹，夏桂民

100050 北京，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所制劑室

建立吉西他濱氨基甲酸酯脂質(zhì)體中主藥的含量測定方法。采用 HPLC 法檢測吉西他濱氨基甲酸酯的含量。色譜條件：Inertsil ODS-SP 色譜柱（5 μm，150 mm × 4.6 mm），以磷酸鹽緩沖液:甲醇（20:80）為流動相等度洗脫，流速1.0 ml/min，檢測波長 243 nm，柱溫 30℃，進樣量 20 μl。色譜分離度= 3.363，陰性對照無干擾；吉西他濱氨基甲酸酯在5.81 ～ 150.00 μg/ml 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（= 0.9999）；低、中、高 3 種濃度的平均回收率分別為98.3%（RSD = 1.77%，n = 3）、100.0%（RSD = 0.24%，n = 3）、97.8%（RSD = 0.92%，n = 3）；日內(nèi)精密度 RSD = 0.09%（n = 6），日間精密度 RSD = 1.36%（n = 18）；流速在 0.99 ～ 1.01 ml/min 范圍內(nèi)變化時 RSD = 1.02%（n = 9），柱溫在28 ～ 32 ℃之間變化時 RSD = 0.27%（n = 9）。本文建立的方法簡便易行、專屬性強、重復(fù)性好、準(zhǔn)確度高、耐用性好；可定量檢測吉西他濱氨基甲酸酯脂質(zhì)體中主藥的含量。

高效液相色譜； 含量測定； 吉西他濱氨基甲酸酯； 脂質(zhì)體

吉西他濱是周期特異性抗代謝嘧啶核苷類似物，通過抑制 DNA 鏈的延長抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡[1-4]。吉西他濱是治療胰腺癌的一線用藥[5]，也常聯(lián)合其他抗癌藥物用于轉(zhuǎn)移性乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌、卵巢癌等[6]。自 1996 年美國 FDA 批準(zhǔn)吉西他濱應(yīng)用于臨床以來[7]，目前僅有注射用凍干粉針劑一種劑型[8]。因吉西他濱易被脫氨酶降解失活，導(dǎo)致半衰期短（8 ～ 17 min），迫使吉西他濱的臨床劑量較大（1000 mg/m2），由此常常帶來諸多不良反應(yīng)[3, 9]。

為了改善吉西他濱上述不足，經(jīng)對其結(jié)構(gòu)修飾，合成了新化合物吉西他濱氨基甲酸酯，并將其構(gòu)建成納米脂質(zhì)體，以規(guī)避體內(nèi)相關(guān)酶對其的酶解失活，延長藥物半衰期，實現(xiàn)增效減毒。在此研究過程中，建立了吉西他濱氨基甲酸酯脂質(zhì)體中主藥的含量測定方法。

1 材料與方法

1.1 材料

LC - 20A 高效液相色譜儀、色譜柱（C18：十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，5 μm，150 mm ×4.6 mm）均購自日本島津公司；R-300 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀購自瑞士 Buchi 公司；XSE105 型分析天平購自瑞士梅特勒公司；KQ-250DB 型數(shù)控超聲波清洗器購自昆山市超聲儀器有限公司；低溫光照儀購自藥物制劑國家研究中心。

吉西他濱氨基甲酸酯脂質(zhì)體（以下簡稱“吉西氨脂”），自制（外觀呈淡藍(lán)色乳光，粒徑約 90 nm，批號 200920、201101 ～ 05 共6 批）；工作對照品，批號 201908，99.0%，本所合成室提供；甲醇為色譜純，購自美國 Fisher Scientific 公司；其他試劑均為市售色譜純或分析純。

1.2 方法

1.2.1 對照溶液 精密稱取主藥 2.50 mg，置于 50 ml 量瓶中，加甲醇少許，超聲使其完全溶解，再用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

1.2.2 供試品溶液及空白對照溶液 精密量取0.1 ml 吉西氨脂懸液，置于 2 ml 量瓶中，用甲醇定容至刻度，充分振蕩、搖勻，4 ℃、12 000 ×條件下離心 10 min，上清液即為供試品溶液。另精密量取 0.1 ml 空白脂質(zhì)體懸液，同法操作，得空白對照溶液。

1.2.3 檢測法 以 Inertsil ODS-SP（5 μm，150 mm × 4.6 mm；十八烷基硅烷鍵合硅膠）為色譜柱；以pH（2.5 ± 0.1）磷酸鹽緩沖液:甲醇（20:80）為流動相等度洗脫；檢測波長為 243 nm；柱溫為 30 ℃；進樣體積為 20 μl。

1.2.4 系統(tǒng)適用性試驗 分別取“1.2.1”和“1.2.2”項下對照溶液、供試品溶液及空白對照溶液適量，照“1.2.3”項下色譜條件操作，記錄色譜圖。

1.2.5 破壞性試驗 分別取吉西氨脂懸液、空白脂質(zhì)體懸液、對照溶液各 5 份，進行以下破壞性試驗。

1.2.5.1 酸破壞 精密量取 2 ml 吉西氨脂懸液，加入 1 mol/L鹽酸溶液 0.5 ml，室溫下避光放置 12 h，按“1.2.2”項下方法操作，得酸破壞供試品溶液。同法操作，得酸破壞空白對照溶液及酸破壞對照溶液。

1.2.5.2 堿破壞 精密量取 2 ml 吉西氨脂懸液，向其中加入 1 mol/L氫氧化鈉溶液 0.5 ml，余下同“1.2.5.1”，得堿破壞供試品溶液、堿破壞空白對照溶液及堿破壞對照溶液。

1.2.5.3 氧破壞 精密量取 2 ml 吉西氨脂懸液，向其中加入 3% 過氧化氫溶液 0.5 ml，室溫下避光放置 3 h。按“1.2.2”項下方法操作，得氧破壞供試品溶液。同法操作，得氧破壞空白對照溶液及氧破壞對照溶液。

1.2.5.4 光破壞 精密量取 2 ml 吉西氨脂懸液，向其中加入 5% 葡萄糖溶液 0.5 ml，在低溫光照儀［（4500 ± 500）lx］中照射 4 h。按“1.2.2”項下方法操作，得光破壞供試品溶液。同法操作，得光破壞空白對照溶液及光破壞對照溶液。

1.2.5.5 高溫破壞 精密量取 2 ml 吉西氨脂懸液，向其中加入 5% 葡萄糖溶液 0.5 ml，在 65 ℃水浴中避光加熱 8 h。按“1.2.2”項下方法操作，得高溫破壞供試品溶液。同法操作，得高溫破壞空白對照溶液及高溫破壞對照溶液。

1.2.6 線性與范圍 精密稱取對照品適量，置于 50 ml 量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，再用甲醇依次遞倍稀釋，得 8 種不同濃度的主藥溶液（濃度范圍為 5.81 ～ 150.00 μg/ml）。照“1.2.3”操作，記錄峰面積。

1.2.7 檢測限與定量限 精密量取吉西氨脂懸液適量，用 5% 葡萄糖溶液遞倍稀釋，照“1.2.2”處理樣品，照“1.2.3”操作，記錄色譜圖，分別以信噪比為 3:1 和 10:1 時相應(yīng)的主藥的量為檢測限和定量限。

1.2.8 重復(fù)性試驗 取同一供試品 6 份，照“1.2.3”操作，記錄峰面積。

1.2.9 精密度試驗 取同一供試品，照“1.2.3”操作，同一天內(nèi)連續(xù)進樣 6 次，記錄峰面積。另取同一份供試品，連續(xù) 6 天，每天同法操作，記錄峰面積。

1.2.10 回收率試驗 精密稱取主藥 5.50、5.00、4.50 mg 各3 份，分別置于 50 ml 量瓶中，加甲醇適量并超聲使其完全溶解，再加空白脂質(zhì)體懸液 5 ml，用甲醇定容至刻度，搖勻，4 ℃、12 000 ×條件下離心 10 min，得低、中、高3 種不同濃度的供試品溶液。照“1.2.3”項下條件，分別進樣，記錄色譜圖，按外標(biāo)法計算得主藥濃度，再與理論值對比，每個濃度平行測定 3 次，得平均回收率。

1.2.11 耐用性試驗

1.2.11.1 流速變化的影響 將流速分別設(shè)置為 0.99、1.00、1.01 ml/min，取同一供試品溶液，照“1.2.3”項下條件，記錄峰面積。

1：吉西他濱氨基甲酸酯；a：吉西氨脂；b：溶媒；c：空白脂質(zhì)體；d：對照溶液

1: Carbamate-gemcitabine; a: Gemcitabine carbamate-loaded liposomes; b: Solvent; c: Blank liposomes; d: Carbamate-gemcitabine reference substance

圖1 系統(tǒng)適用性色譜圖

Figure 1 Chromatograms of system suitability

1.2.11.2 柱溫對系統(tǒng)的影響 將柱溫分別設(shè)置為 28、30、32 ℃，取同一供試品溶液，照“1.2.3”項下條件，記錄峰面積。

1.2.12 含量測定 取連續(xù)5 批吉西氨脂，分別按“1.2.2”及“1.2.3”操作，記錄色譜圖，照外標(biāo)法計算各批次供試品中主藥的濃度。

2 結(jié)果

2.1 系統(tǒng)適用性

在對照溶液及供試品溶液中，主藥的保留時間均約為 11.323 min，分離度均為 3.363?？瞻字|(zhì)體色譜圖中相應(yīng)保留時間處未見吸收峰（圖 1）。上述結(jié)果表明在已建立的色譜條件下，吉西氨脂的輔料對主藥的分析檢測無干擾。

A B C D E F

1：吉西他濱氨基甲酸酯；a：空白脂質(zhì)體；b：吉西氨脂；c：對照溶液

1: Carbamate-gemcitabine; a: Blank liposomes; b: Gemcitabine carbamate-loaded liposomes; c: Carbamate-gemcitabine reference substance

圖2 破壞性試驗色譜圖（A：酸破壞；B：堿破壞；C：氧破壞；D：光破壞；E：高溫破壞；F：未破壞）

Figure 2 Typical chromatograms of destructive test [Destruction by acid (A); by base (B); by oxidation (C); by illumination (D); by high temperature (E); nondestruction (F)]

2.2 專屬性

分別取各待測破壞溶液，照“1.2.3”項下條件進樣，記錄色譜圖（圖 2）。結(jié)果表明，吉西他濱氨基甲酸酯色譜峰與酸、堿、光、高溫破壞產(chǎn)生的降解產(chǎn)物色譜峰均能有效分離，說明本方法專屬性良好。氧破壞試驗組均未檢測出吉西他濱氨基甲酸酯色譜峰，表明其對氧不穩(wěn)定。

2.3 線性與范圍

以主藥峰面積 A 為縱坐標(biāo)、濃度 C 為橫坐標(biāo)進行線性回歸，得回歸方程：A = 34569 C + 22727，= 0.9999。說明在 5.81 ～ 150.00 μg/ml 范圍內(nèi)主藥濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.4 檢測限與定量限

經(jīng)檢測，主藥的檢測限為 5.2 ng（S/N = 3），定量限為 16.8 ng（S/N = 10）。

2.5 重復(fù)性

取同一供試品 6 份，照“1.2.3”操作，經(jīng)統(tǒng)計，重復(fù)性實驗的 RSD = 1.39%（n = 6）（表1）。

2.6 精密度

經(jīng)統(tǒng)計日內(nèi)精密度 RSD 為 0.09%（n = 6），日間精密度 RSD 為1.36%（n = 18）（表2 和表3）。

表1 重復(fù)性試驗結(jié)果

表2 日內(nèi)精密度

2.7 回收率

統(tǒng)計求得低、中、高 3 個加樣平均回收率為98.3%（RSD = 1.77%，n = 3）、100.0%（RSD = 0.24%，n = 3）和 97.8%（RSD = 0.92%，n = 3）（表4）。

2.8 耐用性

流速在 0.99 ～ 1.01 ml/min范圍內(nèi)變化時，RSD 為 1.02%（n = 9），說明該方法的耐用性良好（表5）。柱溫在 28 ～ 32 ℃之間變化時，RSD 為0.27%（n = 9），說明此條件下對主藥含量測定結(jié)果影響較小。

表3 日間精密度

表4 回收率試驗結(jié)果

表5 耐用性試驗結(jié)果

表6 5 批吉西氨脂含量測定結(jié)果

2.9 含量測定

5 批供試品含量測定結(jié)果見表6。

3 討論

建立了 HPLC 法用于吉西氨脂中主藥含量的測定，通過系統(tǒng)的方法學(xué)研究與驗證，認(rèn)為本法操作簡便、專屬性好、準(zhǔn)確度高，適合于吉西氨脂中主藥的含量測定。

3.1 藥物穩(wěn)定性的影響因素

破壞性試驗結(jié)果提示，吉西他濱氨基甲酸酯在酸（pH 1鹽酸溶液，12 h）、堿（pH 13氫氧化鈉溶液，12 h）、光照（4500 ± 500 lx，4 h）、高溫（65 ℃，8 h）條件下，未檢測出主藥色譜峰，說明主藥被完全破壞。但吉西氨脂在上述酸、堿、光照、高溫條件下，均能檢測出主藥色譜峰，并且能夠與所產(chǎn)生的降解產(chǎn)物色譜峰有效分離，表明脂質(zhì)體能提高吉西他濱氨基甲酸酯在酸、堿、光照、高溫條件下的穩(wěn)定性。同時，在已建立的色譜條件下，本方法專屬性良好。

3.2 色譜條件的選擇

本課題組制備了一系列吉西他濱衍生物，參照前期確定的梯度洗脫色譜條件，發(fā)現(xiàn)主藥峰與雜質(zhì)峰不能完全分離，分離度僅為 1.12（< 1.5），為了實現(xiàn)雜質(zhì)與主藥的有效分離，本研究嘗試改變流動相比例，最終發(fā)現(xiàn)磷酸緩沖鹽:甲醇（pH 2.4 ～ 2.5）= 20:80 等度洗脫時，主藥峰與雜質(zhì)峰能夠有效分離，峰形對稱，分離度為 3.363，保留時間適宜（11.323 min）。本研究在現(xiàn)有方法的基礎(chǔ)上，改進并建立了更加簡便、準(zhǔn)確的色譜分析條件。

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Determination of the principal agent in gemcitabine carbamate-loaded liposomes by HPLC

LI Yan, GUO Xiao-ru, FENG Wen-kai, LIU Ming-liang, WANG Dan, XIA Gui-min

Author Affiliation: Pharmaceutics Department, Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100050, China

To establish an HPLC method for the quantification of the principal agent in gemcitabine carbamate-loaded liposomes.The separation was performed on an Inertsil ODS-SP column (5 μm, 150 mm × 4.6 mm) at 243 nm. The mobile phase consisted of sodium dihydrogen phosphate solution–methanol (20:80) at the flow rate of 1.0 ml/min. The column temperature was30 ℃ and the injection volume was 20 μl.The method was validated with a resolution of 3.363, linear in the range of 5.81 - 150.00 μg/ml (= 0.9999) and accurate. The average recovery rate was 98.3% (RSD = 1.77%, n = 3), 100.0% (RSD = 0.24%, n = 3) and 97.8% (RSD = 0.92%, n = 3) at low, medium and high concentrations, respectively. The precision, intra-day and inter-day precision reflected by the relative standard deviation (RSD) values was 0.09% (n = 6) and 1.36% (n = 18), respectively. The method is robust under slight changes of flow rate (0.99 - 1.01 ml/min) and column temperature (28 - 32 ℃) with RSD of 1.02% (n = 9) and 0.27% (n = 9), respectively.A simple, robust, accurate HPLC method is established for the determination of the principal agent in gemcitabine carbamate-loaded liposomes.

HPLC; determination; gemcitabine carbamate; liposome

XIA Gui-min, Email: xiaguimin@126.com

國家重點研發(fā)計劃（2016YFA0201504）；國家自然科學(xué)基金（81673383、81803479）

夏桂民，Email：xiaguimin@126.com

2020-12-21

10.3969/j.issn.1673-713X.2021.03.003