侯麗霞，龐麗娜，龔 帥，何 煒

(鄭州大學第一附屬醫(yī)院腫瘤科，河南 鄭州450052)

膽管癌(cholangiocarcinoma，CCA)作為僅次于肝細胞癌的第二大常見肝臟惡性腫瘤，包括多種膽管上皮性腫瘤，其中，肝內膽管癌占10%～20%，肝門部膽管癌占50%，遠端膽管癌占30%～40%[1]。CCA占所有原發(fā)性肝癌病例的10%～15%，占所有惡性腫瘤的比例不到1%，但在過去的40 a里，全球CCA的發(fā)病率逐年增加[2-3]。

膽管癌患者的預后差，5 a總生存率不到5%，主要是由于該腫瘤發(fā)病隱匿、診斷晚并且缺乏有效的非手術治療手段[4]。因此，對于膽管癌的治療迫切需要更多更有效的治療藥物，特別是分子靶向治療藥物。

血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF),又稱血管通透因子，是上皮細胞產(chǎn)生的一種信號蛋白[5]。其是多種腫瘤新生血管形成和細胞增殖的關鍵因素，如胃癌、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、結腸癌和肝細胞癌(包括CCA)[6]。臨床資料顯示VEGF在CCA中顯著升高[7-8]，阻斷VEGF/血管內皮生長因子受體(vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)通路可有效抑制多種腫瘤的增殖、遷移、侵襲和黏附能力，如肝細胞癌、胃癌和肺癌[9-10]。最近的研究證實自分泌VEGF在促進腫瘤細胞增殖和抑制其凋亡中有重要作用[11-13]。

阿帕替尼(YN968D1)是最新的口服型VEGFR2酪氨酸激酶高選擇性抑制劑之一，在治療多種實體瘤方面有著令人鼓舞的臨床前和臨床資料[14-15]。VEGFR-2是VEGF介導的一種重要的抗凋亡因子，通過VEGFR-2/PI3K/Akt/mTOR途徑抑制凋亡。經(jīng)Ⅲ期臨床試驗證實，阿帕替尼是治療無化療指征的晚期胃癌的唯一有效藥物[16]。因此，阿帕替尼于2014年被國家食品藥品監(jiān)督管理局批準并認定為晚期或轉移性難治性胃癌的后續(xù)治療藥物[17]。在我國的Ⅱ～Ⅲ期臨床試驗中，阿帕替尼對多種腫瘤均顯示出良好的治療效果，如肝細胞癌[18]、非小細胞肺癌[19]、乳腺癌[20-22]和結直腸癌[23]。然而，阿帕替尼是否對人類CCA具有抗腫瘤作用尚不清楚。在本研究中，我們觀察了阿帕替尼對體內外CCA細胞的增殖和凋亡的影響，并探討其作用機制。

1 資料與方法

1.1 細胞系和試劑阿帕替尼(YN968D1)由江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司提供；抗Bcl-2(目錄號sc-7382)抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology公司；抗cleaved caspases-3(目錄號9661)抗體購自美國Cell Signaling Biotechnology公司；抗Ki-67(目錄號MA5-14520)抗體購自美國Thermo Scientific公司。

人CCA細胞系HCCC9810和HuCCT1購自美國ATCC細胞庫。細胞培養(yǎng)在含高糖的DMEM培養(yǎng)基中，并在37 ℃、體積分數(shù)5%CO2條件下添加胎牛血清(美國Gibco公司)、100 u/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素。細胞培養(yǎng)按照ATCC要求的培養(yǎng)條件。

1.2 細胞增殖實驗細胞(每孔1×103個)接種于96孔板中，隔夜培養(yǎng)后，用不同濃度的阿帕替尼(0、2.5、5、10和20 μmol/L)處理細胞，并培養(yǎng)24、48和72 h，然后添加20 μL Cell Titer 96 Aqueous One Solution試劑(美國Promega公司)，將細胞再培養(yǎng)1 h，最后在492 nm處讀取光密度(optical density,OD)值。

1.3 錨定非依賴性細胞生長實驗下層為質量分數(shù)0.6%瓊脂和含不同濃度阿帕替尼的完全培養(yǎng)基，上層為質量分數(shù)0.3%瓊脂和含相同濃度阿帕替尼的完全培養(yǎng)基，細胞(每孔8×103個)懸浮于上層的完全生長培養(yǎng)基中，然后在37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d，最后使用Image-Pro Plus v.6.0程序(美國Media Cybernetics公司)在倒置顯微鏡下對集落進行計數(shù)。

1.4 Annexin V/PI染色法用凋亡檢測試劑盒進行Annexin V/PI染色。將細胞(每孔3×105個細胞)接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h，并用不同濃度(0、2.5、5、10和20 μmol/L)的阿帕替尼處理24 h，然后洗滌細胞兩次，用磷酸鹽緩沖液再懸浮并在室溫下用Annexin V-異硫氰酸熒光素(FITC)和碘化丙啶孵育10 min。用BD Acuri C6進行細胞凋亡分析。

1.5 裸鼠中抗腫瘤作用的測定BALB/c裸鼠，雌性，6～8周齡，購自自鄭州大學實驗動物中心，小鼠飼養(yǎng)在無菌動物室中，提供標準鼠料及蒸餾水，讓其自由采食及飲水。把懸浮于磷酸鹽緩沖液的HuCCT1細胞與基質膠(美國BD Biosciences公司)11混合，抽取0.25 mL混合物(HuCCT1細胞量約3×106)接種于小鼠右側皮下，每3天測量一次腫瘤體積和體質量，腫瘤體積公式：腫瘤體積(mm3)=1/2×長×寬2。當腫瘤體積大小達到50～100 mm3時，將小鼠隨機分為3組(n=6～8，對照組，阿帕替尼50 mg/(kg·d)組，阿帕替尼100 mg/(kg·d)組)。小鼠被處死后移除腫瘤，將腫瘤組織用福爾馬林固定，石蠟包埋并切片，進行免疫組化分析。

1.6 免疫組織化學法從每個石蠟塊中獲取一系列4 nm的切片，組織切片經(jīng)二甲苯脫石蠟后，用10 mmol/L枸櫞酸鈉緩沖液(pH=6.0)進行抗原修復，接著用體積分數(shù)0.03%過氧化氫孵育15 min以阻斷內源性過氧化物酶的活性，然后將切片在正常血清中封閉30 min，并在4 ℃下與一抗一起孵育過夜，最后在室溫下用二抗孵育60 min。所有切片均使用Vectastain ABC 試劑盒(美國Vector實驗室)和蘇木精在顯微鏡下(200×)進行復染。使用Image Pro Plusv.6.0程序(美國Media Cybernetics公司)進行IHC染色定量分析。

2 結果

2.1 阿帕替尼抑制CCA細胞增殖和集落形成對CCA細胞的細胞增殖和集落形成能力的評估顯示，阿帕替尼以時間和劑量依賴的方式抑制HCCC9810和HuCCT1細胞系的增殖，其中，對HuCCT1細胞系的增殖抑制作用更為明顯(圖1)。在2株細胞系中，阿帕替尼處理24 h的抑制作用弱于處理48 h和72 h。經(jīng)阿帕替尼處理72 h，不同濃度(2.5、5、10和20 μmol/L)阿帕替尼組與對照組之間的療效比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

軟瓊脂中的細胞集落形成也被阿帕替尼以劑量依賴的方式抑制，在HuCCT1細胞中最為顯著(圖1)，這表明阿帕替尼可以抑制CCA細胞增殖，值得進一步研究。

圖1 阿帕替尼(μmol/L)抑制CCA細胞增殖及集落形成

2.2 阿帕替尼促進CCA細胞凋亡采用Annexin V/PI雙染色法和流式細胞術探討阿帕替尼對CCA細胞的抗增殖作用是否與誘導細胞凋亡有關。用2.5、5、10和20 μmol/L的阿帕替尼處理CCA細胞24 h，結果顯示，與對照組相比，經(jīng)阿帕替尼處理后早期凋亡和晚期凋亡細胞均有所增加，而且經(jīng)阿帕替尼處理后細胞凋亡率也顯著增加(P<0.05)(圖2)。

圖2 阿帕替尼促進CCA細胞系凋亡

2.3 裸鼠移植瘤模型中阿帕替尼抗CCA作用的研究阿帕替尼50 mg/(kg·d)治療組與對照組治療期間體質量比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，然而，阿帕替尼100 mg/(kg·d)治療組與對照組的體質量減輕比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖3)。阿帕替尼100 mg/(kg·d)治療組和阿帕替尼50 mg/(kg·d)治療組的腫瘤體積明顯減小，與對照組相比差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)(圖3)。

為了解釋上述現(xiàn)象，我們采用免疫組織化法檢測Ki-67、Bcl-2和cleaved-caspase 3的表達水平，進而對阿帕替尼的分子作用機制進行研究。研究發(fā)現(xiàn)，相比于對照組，阿帕替尼治療組ki-67和Bcl-2的表達明顯降低，而cleaved-caspase 3的表達顯著升高(P<0.05)(圖3)。這表明阿帕替尼可以通過調節(jié)Ki-67、Bcl-2和cleaved-caspase 3的表達水平發(fā)揮抗腫瘤作用。

圖3 阿帕替尼能抑制裸鼠中HuCC1腫瘤情況

3 討論

本研究旨在探討阿帕替尼對體內外CCA細胞的抗腫瘤作用及其作用機制，因此我們進行了細胞增殖實驗、凋亡實驗，并建立了裸鼠移植瘤模型。細胞增殖實驗顯示，阿帕替尼以時間和劑量依賴的方式直接抑制HCCC9810和HuCCT1細胞系的細胞增殖和集落形成。在既往的研究中，阿帕替尼能抑制肝癌、膽管癌和其他類型腫瘤的腫瘤細胞增殖[24-25]。Annexin V/PI染色顯示，阿帕替尼誘導CCA細胞凋亡，這與細胞增殖實驗的結果一致。

裸鼠移植瘤實驗結果表明，在整個過程中，阿帕替尼50 mg/(kg·d)治療組的小鼠體質量并未明顯減輕，但仍需對其長期應用進一步研究，阿帕替尼100 mg/(kg·d)治療組的小鼠體質量明顯減輕(P<0.05)。在臨床中，我們也發(fā)現(xiàn)一部分患者在經(jīng)阿帕替尼治療后體質量減輕。然而阿帕替尼50 mg/(kg·d)治療組與100 mg/(kg·d)治療組的小鼠腫瘤體積均有明顯減小(P<0.05)。另外，阿帕替尼能降低Ki-67和Bcl-2表達同時增加cleaved-caspase 3的表達。這些均表明阿帕替尼能抑制體內CCA細胞增殖并促進細胞凋亡，與體外實驗的結果一致。

膽管癌起源于膽管上皮細胞，其中90%以上為腺癌。到目前為止，根治性手術切除是其可能治愈的唯一治療方法。然而，只有20%到40%的患者可以進行手術切除，因為大多數(shù)患者在診斷時腫瘤已經(jīng)發(fā)生轉移或者局部晚期，放化療是近幾十年來的主要治療手段。局部晚期或轉移性膽管癌的標準一線治療是吉西他濱加氟尿嘧啶或鉑，替吉奧已被研究作為吉西他濱難治的晚期膽管癌患者的二線治療[26]。在一項標準的、實用的臨床調查(ABC-2研究)中，410例晚期膽管癌患者被隨機分配接受吉西他濱聯(lián)合順鉑或單獨使用吉西他濱，聯(lián)合治療組患者的中位總生存期為11.7個月，單用吉西他濱組患者的中位總生存期為8.1個月，然而，與其他臨床試驗相比，聯(lián)合治療獲益很小，而且研究的患者數(shù)量也很少[27]。

因此，迫切需要新的藥物或化療方案作為膽管癌患者的治療選擇。我們先前報道了一例肝內膽管癌患者，在經(jīng)吉西他濱和順鉑聯(lián)合化療進展后，接受了阿帕替尼靶向治療，達到了6個月的無進展生存期[28]。此次實驗研究結果表明，阿帕替尼通過影響CCA腫瘤細胞的增殖和凋亡，對CCA有很強的抗腫瘤作用，阿帕替尼可能是治療CCA的新選擇。