李宏婭，楊軍成，汪艷霞，姚新轉(zhuǎn),2，呂立堂,2※

[1.貴州大學(xué)茶學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學(xué)農(nóng)業(yè)生物工程研究院，山地植物資源保護(hù)與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（教育部），貴州 貴陽 550025]

多穗石柯[Lithocarpus polystachyus（Wall.）Rehd.]為殼斗科石柯屬常綠植物，又稱甜茶、多穗柯、野金柴或甘茶。多穗石柯茶是我國應(yīng)用歷史悠久、藥食同源的植物之一[1],主要分布于我國的西南、華南各省，分布廣，資源儲藏量大[2]。多穗石柯含有多種類型的化學(xué)成分，主要有黃酮類、三萜類及多酚類等，其中以黃酮類為主[3-10]。多穗石柯中的黃酮類有根皮苷（phlorizin）、根皮素（phloretin）、三葉苷（trilobatin）、槲皮苷（quercitrin）和槲皮素（quercetin）等物質(zhì)[11]。根皮苷是根皮素和葡萄糖結(jié)合形成的苷，為微黃色或白色針狀結(jié)晶物質(zhì)，味先甜后苦[12]，是根皮素的葡萄糖苷，屬于黃酮類中的二氫查爾酮類物質(zhì)[13]。根皮苷具有降低血糖、改善記憶力、抗氧化和抗癌等多種重要的生物活性[14,15]，在新型藥物和天然保健食品開發(fā)中具有廣泛的應(yīng)用前景[16]。根皮素有抗氧化、抗自由基、抗炎、免疫抑制、抗癌及抗腫瘤作用[17]，有極強(qiáng)的抗氧化性，可清除皮膚內(nèi)的自由基[18]，具有抑制黑色素細(xì)胞活性，對各種皮膚色斑有淡化作用[19]，能夠抑制高濃度膽堿引起的血管內(nèi)皮功能失調(diào)和損傷及肝損傷的發(fā)生[20]。槲皮苷具有較強(qiáng)的抗氧化自由基清除的能力[21]，Jeong Ah Kim等[22]研究表明槲皮苷能顯著減少谷胱甘肽合成酶抑制劑（BSO）產(chǎn)生自由基，從而誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。還有文獻(xiàn)報(bào)道，槲皮苷具有保護(hù)肝臟的作用[23]，且具有一定的抗炎活性，主要表現(xiàn)為對致炎性因子的抑制作用[24]。槲皮素具有多種生物學(xué)活性及很高的藥用價(jià)值，具有較好的祛痰、止咳作用，并有一定的平喘作用[25]；具有抗腫瘤、抗病毒抗炎、擴(kuò)張冠脈和抗血小板聚集等作用[26]；具有一定抗炎活性，其抗炎作用與其強(qiáng)氧化作用有關(guān)[27]；槲皮素還具有抑制胃癌、抑制淋巴結(jié)核轉(zhuǎn)移[28]、抑制乳腺細(xì)胞增生[29,30]、抑制肝癌細(xì)胞增生[31]和影響結(jié)腸癌細(xì)胞生長[32,33]等藥理作用。三葉苷能抑制炎癥因子的分泌[34]，具有較強(qiáng)的抗氧化活性且清除DPPH自由基能力強(qiáng)于蘆丁[35]，是一種有一定應(yīng)用潛力的抗糖尿病活性物質(zhì)[36]。另外，不同的加工方式往往對茶葉內(nèi)含物有著不同程度的影響，有研究表明，不同加工工藝對紫娟茶品質(zhì)優(yōu)劣有較大影響[37]。不同工藝處理下茶樹花茶茶葉浸出物含量不同，從而影響茶葉品質(zhì)[38]。本實(shí)驗(yàn)探究不同加工方式對甜茶有效成分影響研究，為根據(jù)有效成分利用需求選擇合適的加工方式奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

甜茶樹鮮葉（2019年6月采自貴州省東南部農(nóng)作物農(nóng)場）由兩片葉子和少量芽組成。槲皮苷標(biāo)準(zhǔn)品和槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品購自上海源葉生物有限公司（中國上海），三葉苷標(biāo)準(zhǔn)品購自上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司（中國上海）。乙醇（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、乙腈（ASC）。

1.2 儀器設(shè)備

茶葉制作：簸箕若干、滾筒殺青機(jī)、蒸鍋、炒鍋、微波爐、發(fā)酵機(jī)、烘干機(jī)等制茶機(jī)器。

成分測定：電子天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）、舜宇恒平（FA-1004）、離心機(jī)（Thermo BR4I）、液相色譜儀（Agilent 1260）、Agilent C18色譜柱（250 mm4.6 mm，5m）

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 甜茶試制綠茶的工藝參數(shù) 參考常規(guī)綠茶的加工方法：攤晾→殺青→揉捻→干燥4個(gè)步驟[39]。鮮葉于28℃室溫環(huán)境下攤晾3 h，每隔30 min翻動1次，直至鮮葉含水量降至70%左右。下一步殺青分為滾筒殺青、微波殺青、蒸汽殺青和鍋炒殺青4種方式，分別在滾筒殺青機(jī)器、微波爐、蒸汽鍋和炒鍋中以不同溫度條件進(jìn)行，殺青完成后，趁熱揉捻20 min。揉捻好的甜茶葉放入烘干機(jī)中，在80℃溫度下分別烘30 min、30 min、40 min和30 min，得到4種不同殺青工藝的甜茶綠茶試制品，具體殺青參數(shù)將表1。

表1 甜茶試制綠茶不同加工方式的相關(guān)參數(shù)Table 1 Parameters of different fixation ways of trying to make green tea with the sweet tea

1.3.2 甜茶試制紅茶的工藝參數(shù) 參考傳統(tǒng)紅碎茶加工工藝為萎凋→揉切→發(fā)酵→干燥4個(gè)步驟[40]，鮮葉于28℃室溫環(huán)境下萎凋8 h，萎凋葉含水量掌握在61%～64%[41]，揉切后于60℃發(fā)酵3h，于80℃烘干60min，得到甜茶紅碎茶試制品，具體加工參數(shù)見表2。

表2 甜茶試制紅茶加工方式的相關(guān)參數(shù)Table 2 Parameters of processing ways to make black tea with the sweet tea

1.3.3 感官審評方法 參照GB/T 23776-2018茶葉感官評價(jià)方法，采用五因素法從外形和內(nèi)在品質(zhì)對5種甜茶的湯色、香氣、滋味及葉底進(jìn)行感官審評。按照百分制，由5位專家審評。

1.3.4 高效液相色譜法測定槲皮苷和槲皮素的含量將要測定的不同加工方法的甜茶葉粉碎，精確稱取1.000 g粉碎的均勻樣品，然后倒入25 mL容量瓶中，加入50 mL甲醇（75%，v/v），超聲處理1 h，超聲萃取進(jìn)行30 min（功率40 kHz，30℃）。重復(fù)提取3次，抽濾，于60℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，然后將提取液用甲醇（75%，v/v）稀釋至25 mL，搖勻，用0.45m微孔濾膜過濾，使用Agilent 1260 HPLC分析儀進(jìn)行高效液相色譜檢測，使用Agilent C18色譜柱（250 mm 4.6 mm，5m）進(jìn)行分離，該色譜柱和檢測器在30℃下操作。流動相由乙腈和0.1%（v/v）的磷酸水溶液組成，流速為0.8 mL/min。流動相比率設(shè)定為乙腈和0.1%的磷酸水溶液至1：1（v/v）。進(jìn)樣量為10L，并在365 nm處監(jiān)測HPLC色譜圖。根據(jù)槲皮苷標(biāo)準(zhǔn)品和槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間，測定樣品中的槲皮苷和槲皮素，然后根據(jù)峰面積計(jì)算出槲皮苷含量和槲皮素含量。使用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

1.3.5 高效液相色譜法測定根皮素、根皮苷和三葉苷的含量 將要測定的不同加工方法的甜茶葉粉碎，精確稱取0.500 g粉碎的均勻樣品，然后倒入25 mL容量瓶中，加入20%甲醇（70%，v/v），超聲處理1 h。超聲萃取30 min（功率40 kHz，30℃），重復(fù)提取3次，抽濾，于60℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，再將乙醇（70%，v/v）稀釋至25 mL并搖勻，用0.45m微孔濾膜過濾。使用Agilent 1260 HPLC分析儀進(jìn)行高效液相色譜，使用Agilent C18色譜柱（250 mm 4.6 mm，5m）進(jìn)行分離，該色譜柱和檢測器在40℃下操作。流動相由乙腈和0.04%（v/v）甲酸水溶液組成。在0～14 min時(shí)，流動相比率為28%乙腈和72%甲酸水溶液，流速為0.8 mL/min。在14 min～30 min時(shí)，流動相比率為40%乙腈和60%甲酸水溶液，流速為0.8 mL/min。在30 min～40 min時(shí)，流動相比率為28%乙腈和72%甲酸水溶液，流速為0.8 mL/min。進(jìn)樣量為10L，并在285 nm處監(jiān)測HPLC色譜圖。根據(jù)根皮素、根皮苷和三葉苷標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間，測定樣品中的根皮素、根皮苷和三葉苷，然后根據(jù)峰面積計(jì)算根皮素、根皮苷和三葉苷的含量。使用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同加工方式對甜茶葉茶感官品質(zhì)的影響

5種加工方式下，甜茶葉樣品經(jīng)感官審評，結(jié)果見表3和表4。不同的加工方式制成的甜茶其外形、湯色、香氣、滋味和葉底均有一定程度的差異，其中，鍋炒殺青方式下的甜茶葉外形和色澤相比其他幾種加工方式較弱，而湯色碧綠且香氣鮮濃，滋味和葉底持平，綜合得分較高；微波殺青方式下的甜茶因其在加工過程中受力較少，外形勻整、葉底完整且色澤保留較好，但香氣較弱；蒸汽殺青和滾筒殺青方式下的甜茶葉色澤綠潤，且綜合得分較低；而紅碎茶加工方式下湯色較暗、香氣較弱且滋味濃澀。從綜合評分可以看出，鍋炒殺青87.85%＞微波殺青87.20%＞蒸汽殺青86.95%＞滾筒殺青86.80%＞紅碎茶85.60%，表明從感官審評的角度來看，可以采用鍋炒殺青的加工工藝制作綠茶，以得到湯色、香氣等因子綜合評分較高的甜茶葉，而不推薦采用紅碎茶的加工工藝制作甜茶。

表3 甜茶試制綠茶感官特征審評結(jié)果Table 3 Results of sensory quality on making green tea with the sweet tea 單位：%

表4 甜茶試制紅茶感官特征審評結(jié)果Table 4 Results of sensory quality on making black tea with the sweet tea 單位：%

續(xù)表3

2.2 不同加工方式對甜茶葉茶功能成分的影響

從圖1-5和表3中可以看出，5種加工方式中，根皮苷在微波殺青方式下的含量最高（26 876.3 mg/kg），其次是蒸汽殺青、滾筒殺青和鍋炒殺青，在紅碎茶中含量較低。根皮素在鍋炒殺青方式下的含量最高（157.6 mg/kg），其次是滾筒殺青、微波殺青和蒸汽殺青，在紅碎茶中不含根皮素。槲皮苷在紅碎茶加工方式中含量較高（476.89 mg/kg），其次是蒸汽殺青、微波殺青和滾筒殺青，鍋炒殺青方式下槲皮苷含量較低。槲皮素在鍋炒殺青方式中的含量較高（18.9 mg/kg），其次是蒸汽殺青、紅碎茶和滾筒殺青，微波殺青的加工方式槲皮素含量較低。三葉苷在滾筒殺青中的含量最高（164 981.2 mg/kg），其次是微波殺青和鍋炒殺青，蒸汽殺青中三葉苷含量相對較低，紅碎茶中三葉苷含量是幾種茶中最低的。由此看出，5種甜茶中的功能成分在不同加工方式下含量大不相同。

表3 不同加工方式下甜茶中五種功能成分的含量Table 3 Contents of five functional components in sweet tea under different processing methods 單位：mg/kg

圖1 滾筒殺青茶葉HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of the roller-fixation tea

圖2 微波殺青茶葉HPLC色譜圖Fig.2 HPLC Chromatograms of the microwave-fixation tea

圖3 蒸汽殺青茶葉HPLC色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of the steam-fixation tea

圖4 鍋炒殺青茶葉HPLC色譜圖Fig.4 HPLC chromatograms of the fry-fixation tea

圖5 紅碎茶HPLC色譜圖Fig.5 HPLC chromatograms of the black-crushed tea

3 討論

從感官審評的結(jié)果來看，鍋炒殺青在湯色、香氣和滋味上優(yōu)于其他幾種加工方式，由于其受熱溫度高且受人為因素影響較大，稍有操作不當(dāng)則易出現(xiàn)焦邊和葉底不均等現(xiàn)象。蒸汽殺青是使葉片直接與蒸汽接觸，具有穿透力強(qiáng)、葉溫度升高快的特點(diǎn)[42]，使得甜茶葉避免了傳統(tǒng)綠茶制法所造成的煙焦味，且消除了一定的苦澀。微波殺青的加工方式由于熱量是從葉片內(nèi)部產(chǎn)生，內(nèi)外不存在溫度梯度，沒有一般加熱的熱量傳遞過程，使得茶葉具有葉綠色變化少、色澤翠綠和干燥均勻的特點(diǎn)[43]，滾筒殺青和蒸汽殺青在殺青過程中常因操作不當(dāng)而使茶葉產(chǎn)生紅梗紅葉、黃悶現(xiàn)象，存在殺青時(shí)間長、殺青不均勻等弊端[44]，導(dǎo)致此加工方式下的甜茶葉底欠勻。而紅碎茶加工方式下的甜茶湯色、葉底和滋味上的表現(xiàn)都欠佳。

由表3可知，4種殺青工藝中，微波殺青綠茶中根皮苷含量最高，達(dá)到26 876.3 mg/kg，在甜茶葉感官審評中表現(xiàn)為滋味醇和，好于其他加工方式下的口感。而此加工方式下根皮苷含量高主要是因?yàn)槲⒉⑶嗄苎杆偬岣邭⑶嗵鸩枞~的溫度，加快殺青速度，縮短殺青時(shí)間，使根皮苷水解酶瞬間失活，終止了根皮苷水解為根皮素[17]，同時(shí)由于冷卻及時(shí)，降低了濕熱作用帶來的差異，在一定程度上防止根皮苷轉(zhuǎn)化為根皮素。鍋炒殺青綠茶根皮苷含量最低，是因?yàn)殄伋礆⑶鄷r(shí)，甜茶葉是由外而內(nèi)逐漸升溫的過程，甜茶耗時(shí)長且酶不能瞬間失活，根皮苷會發(fā)生部分氧化和水解生成根皮素，從而降低了根皮苷的含量；在紅碎茶加工過程中根皮苷含量很低，可能是由于根皮苷具有抗氧化性[45]，參與了紅茶發(fā)酵過程的氧化反應(yīng)，由此根皮苷顯示出含量急劇下降的現(xiàn)象。4種殺青工藝中，鍋炒殺青綠茶中根皮素含量最高，達(dá)到157.6 mg/kg，這主要是因?yàn)殄伋磿r(shí)的甜茶葉是由外而內(nèi)逐漸升溫的過程，降低了根皮苷水解酶失活的速度，有助于根皮苷發(fā)生部分水解生成根皮素[17]。蒸汽殺青綠茶根皮素含量最低，主要是因?yàn)檎羝麣⑶嗄苎杆偬岣邭⑶嗵鸩枞~的溫度，加快根皮苷水解酶失活速度，終止了根皮苷水解為根皮素，從而降低了根皮素的積累；在紅碎茶加工過程中根皮素的含量幾乎為0，可能是由于在紅茶發(fā)酵的漫長氧化過程中，具有抗氧化性的根皮素積極地參與氧化反應(yīng)[45]，由此大量消耗，呈現(xiàn)出較低含量。4種殺青工藝中，蒸汽殺青綠茶中槲皮苷含量最高（達(dá)到202.7 mg/kg），鍋炒殺青綠茶槲皮苷含量最低，蒸汽殺青綠茶中槲皮苷含量高是因?yàn)檎羝麣⑶嗄苎杆偬岣邭⑶嗵鸩枞~的溫度，加快槲皮苷水解酶失活速度，有助于防止槲皮苷水解為槲皮素，槲皮苷能夠更好地保留于甜茶葉中；鍋炒殺青時(shí)，甜茶葉是由外而內(nèi)逐漸升溫的過程，甜茶耗時(shí)長且槲皮苷水解酶不能瞬間失活，槲皮苷會發(fā)生部分氧化和水解生成槲皮素，從而減少了槲皮苷的含量；而紅碎茶槲皮苷含量最高，可能是因?yàn)樵诩t碎茶整個(gè)加工工藝（萎凋、切碎、發(fā)酵和干燥），溫度、水分及受力等影響因素相對較小，較大程度地保留了甜茶葉中槲皮苷的含量。4種殺青工藝中，鍋炒殺青綠茶中槲皮素含量最高（18.85 mg/kg），微波殺青綠茶槲皮素含量最低，這主要是因?yàn)殄伋磿r(shí)的甜茶葉是由外而內(nèi)逐漸升溫的過程，降低了槲皮苷水解酶失活的速度，有助于槲皮苷發(fā)生部分水解，生成槲皮素；而微波殺青綠茶槲皮苷含量較低，主要是因?yàn)槲⒉⑶嗄苎杆偬岣邭⑶嗵鸩枞~的溫度，加快殺青速度，縮短殺青時(shí)間，使槲皮苷水解酶瞬間失活，終止了槲皮苷水解為槲皮素，同時(shí)由于冷卻及時(shí)，降低了濕熱作用帶來的差異，在一定程度上防止槲皮苷轉(zhuǎn)化為槲皮素，由此，槲皮素含量較低；而紅碎茶槲皮素含量較高，可能是因?yàn)樵诩t碎茶整個(gè)加工工藝（萎凋、切碎、發(fā)酵和干燥）過程中溫度、水分及受力等影響因素相對較小，較大程度地保留了甜茶葉中槲皮素的含量。4種不同殺青工藝對甜茶葉三葉苷含量的影響存在差異。滾筒殺青綠茶中三葉苷含量相對較高，微波殺青綠茶和鍋炒殺青綠茶次之，蒸汽殺青綠茶中三葉苷含量較低，其原因可能是三葉苷極易溶于熱水，在蒸汽殺青過程中與水直接接觸，造成三葉苷一定量地?fù)p失；而在紅碎茶加工過程中三葉苷含量很低，可能是由于在紅茶發(fā)酵的漫長氧化過程中，具有抗氧化性的三葉苷參與氧化反應(yīng)，由此大量消耗，呈現(xiàn)出較低含量。

4 結(jié)論

通過本研究，我們了解了甜茶葉的有效成分在不同加工方式下的差異。根皮苷和槲皮苷在微波殺青和在紅碎茶加工的方式中保留較多，根皮素和槲皮素在鍋炒殺青中含量較高，三葉苷在滾筒殺青方式下含量較高，得到甜茶重要有效物質(zhì)在不同加工方式下的含量排序：

①根皮素在不同加工方式甜茶中的含量：鍋炒綠茶＞滾筒綠茶＞微波綠茶＞蒸汽綠茶，紅碎茶中不含根皮素。

②根皮苷在不同加工方式甜茶中的含量：微波綠茶＞蒸汽綠茶＞滾筒綠茶＞鍋炒綠茶＞紅碎茶。

③三葉苷在不同加工方式甜茶中的含量：滾筒綠茶＞微波綠茶＞鍋炒綠茶＞蒸汽綠茶＞紅碎茶。

④槲皮素在不同加工方式甜茶中的含量：鍋炒綠茶＞蒸汽綠茶＞紅碎茶＞滾筒綠茶＞微波綠茶。

⑤槲皮苷在不同加工方式甜茶中的含量：紅碎茶＞蒸汽綠茶＞微波綠茶＞滾筒綠茶＞鍋炒綠茶。

此研究可為后續(xù)根據(jù)甜茶有效成分的需求選擇最佳加工方式提供科技支撐。