劉 亮，劉洪濤，李醫(yī)明

北部戰(zhàn)區(qū)總院普通肝膽外科，遼寧 沈陽 110016

胃癌是臨床常見的一種惡性腫瘤，近年來，胃癌發(fā)病率逐年上升，其主要類型為腺癌，胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者死亡率增加的重要原因[1-3]。目前胃癌細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制尚未完全闡明，lncRNA在胃癌組織或細(xì)胞中表達(dá)異常而調(diào)控細(xì)胞增殖、遷移等生物學(xué)過程從而參與胃癌發(fā)生及發(fā)展過程[4]。lncRNA CBR3-AS1在膽管癌中表達(dá)上調(diào)，其表達(dá)量與患者臨床病理特征密切相關(guān)[5]。通過生物信息學(xué)分析顯示miR-5195-3p可能是CBR3-AS1的靶基因，miR-5195-3p在骨肉瘤細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，上調(diào)其表達(dá)可抑制細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[6]。但CBR3-AS1是否通過調(diào)控miR-5195-3p的表達(dá)從而參與胃癌發(fā)生及發(fā)展過程尚未知。因此，本研究主要探討CBR3-AS1對胃癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響，探究其對miR-5195-3p的靶向調(diào)控作用，旨在為進(jìn)一步揭示胃癌細(xì)胞遷移及侵襲的分子機(jī)制奠定實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑正常胃上皮細(xì)胞GES-1與胃癌細(xì)胞系HGC-27、NCI-N87、AGS(美國ATCC細(xì)胞庫)。杜氏改良培養(yǎng)基(DMEM)、胎牛血清、胰蛋白酶(美國Gibco公司)；Lipofectamine 2000(美國Invitrogen公司)；Trizol試劑(北京全式金生物技術(shù)有限公司)；反轉(zhuǎn)錄與qRT-PCR試劑盒(北京天根生化科技有限公司)；CBR3-AS1小分子干擾RNA(si-CBR3-AS1)、亂序無意義陰性序列(si-NC)、miR-5195-3p寡核苷酸模擬物(miR-5195-3p mimics)及陰性對照mimic NC序列(miR-NC)、miR-5195-3p特異性寡核苷酸抑制劑(anti-miR-5195-3p)及其陰性對照(anti-miR-NC)(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)；MTT、細(xì)胞凋亡試劑盒(美國Sigma公司)；Transwell小室(美國Corning公司)；Matrigel基質(zhì)膠(美國BD公司)；兔抗人E-cadherin、N-cadherin抗體(美國Santa Cruz公司)；HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗(美國Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組：GES-1、HGC-27、NCI-N87、AGS細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于DMEM完全培養(yǎng)基，選取對數(shù)生長期胃癌細(xì)胞AGS(1×108個/ml)接種于96孔板(100 μl/孔)，參照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書分別將si-NC、si-CBR3-AS1、si-CBR3-AS1與anti-miR-NC、si-CBR3-AS1與anti-miR-5195-3p轉(zhuǎn)染至AGS細(xì)胞，分別記作si-NC組、si-CBR3-AS1組、si-CBR3-AS1+anti-miR-NC組、si-CBR3-AS1+anti-miR-5195-3p組，轉(zhuǎn)染6 h后將培養(yǎng)基更換為含有血清的培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞。

1.2.2 qRT-PCR檢測細(xì)胞中CBR3-AS1、miR-5195-3p的表達(dá)水平：收集GES-1、HGC-27、NCI-N87、AGS細(xì)胞及轉(zhuǎn)染后的AGS細(xì)胞，采用Trizol法提取細(xì)胞中的總RNA。應(yīng)用Nanodrop 2000c超微量分光光度計檢測RNA濃度。將總RNA合成cDNA。CBR3-AS1正向引物:5′-CAGTGGGGAACTCTGACTCG-3′，反向引物:5′-GTGCCTGGTGCTCTCTTACC-3′；miR-5195-3p正向引物:5′-CAGAGAACAACATGGGAGCG-3′，反向引物:5′-ACTACGATCGATCTGACTGCA-3′；U6正向引物:5′-GCTTCGGCAGCACATATACT-3′，反向引物5′-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3′；GAPDH正向引物:5′-AACGGATTTGGTCGTATTG-3′，反向引物:5′-GGAAGATGGTGATGGGATT-3′，引物由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計合成。qRT-PCR反應(yīng)體系：cDNA 2 μl，Real-Time Master Mix 10 μl，正反向引物各1 μl，RNase-Free ddH2O補(bǔ)足體系至20 μl；反應(yīng)條件：95 ℃ 2 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。CBR3-AS1以GAPDH為內(nèi)參，miR-5195-3p以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算CBR3-AS1、miR-5195-3p的表達(dá)水平。

1.2.3 MTT檢測細(xì)胞增殖：收集各組對數(shù)生長期AGS細(xì)胞接種于96孔板(5×104個/孔)，每孔加入20 μl MTT溶液(質(zhì)量濃度為5 mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，加入150 μl DMSO，室溫振蕩孵育5 min，應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測各孔吸光度值(OD值)，細(xì)胞活力(%)=(實驗組OD值/對照組OD值)×100%。

1.2.4 Transwell小室實驗檢測細(xì)胞遷移和侵襲：細(xì)胞遷移實驗：收集各組AGS細(xì)胞(5×104個/ml)接種于Transwell小室的上室(200 μl/孔)，Transwell小室的下室加入600 μl含質(zhì)量濃度為100 g/L胎牛血清的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，PBS洗滌，依次分別進(jìn)行多聚甲醛固定(20 min)與結(jié)晶紫染液染色(10 min)，PBS洗滌后觀察遷移細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞侵襲實驗：稀釋Matrigel基質(zhì)膠(預(yù)冷培養(yǎng)基)，將Matrigel基質(zhì)膠稀釋液分別加入Transwell小室的上室(40 μl/孔)，室溫孵育5 h，后續(xù)實驗步驟同細(xì)胞遷移實驗，觀察侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.2.5 雙熒光素酶報告基因檢測CBR3-AS1的靶基因：starBase預(yù)測顯示CBR3-AS1與miR-5195-3p存在結(jié)合位點，分別構(gòu)建野生型載體WT-CBR3-AS1、突變型載體MUT-CBR3-AS1，將miR-NC、miR-5195-3p mimics分別與WT-CBR3-AS1、MUT-CBR3-AS1共轉(zhuǎn)染至AGS細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h后收集細(xì)胞，檢測各組熒光素酶活性。

1.2.6 蛋白免疫印跡法(Western blotting)檢測E-cadherin、N-cadherin蛋白表達(dá)：收集各組AGS細(xì)胞，加入400 μl RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白。參照BCA檢測試劑盒測定蛋白濃度。采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，將分離的蛋白凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜，質(zhì)量濃度為50 g/L的脫脂奶粉封閉2 h，分別加入E-cadherin(1∶1 000)、N-cadherin(1∶1 000)與內(nèi)參GAPDH(1∶1 000)一抗稀釋液，次日進(jìn)行TBST洗滌，加入二抗稀釋液(1∶2 000)，室溫孵育1 h，TBST洗滌，顯影，應(yīng)用Image J軟件分析各條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 胃癌細(xì)胞中CBR3-AS1、miR-5195-3p的表達(dá)量比較與GES-1比較，胃癌細(xì)胞系HGC-27、NCI-N87、AGS中CBR3-AS1的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，miR-5195-3p的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，其中CBR3-AS1在胃癌細(xì)胞AGS中的表達(dá)水平相對較高，因而選用胃癌細(xì)胞AGS進(jìn)行后續(xù)實驗(見表1)。

表1 胃癌細(xì)胞中CBR3-AS1、miR-5195-3p的表達(dá)量比較Tab 1 Comparison of expression levels of CBR3-AS1 and miR-5195-3p in gastric cancer cells

2.2 干擾CBR3-AS1表達(dá)對胃癌細(xì)胞AGS增殖、遷移及侵襲的影響與si-NC組比較，si-CBR3-AS1組細(xì)胞活力顯著降低(P<0.05)，遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)顯著減少(P<0.05)，E-cadherin蛋白水平顯著升高(P<0.05)，N-cadherin蛋白水平顯著降低(P<0.05)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(見圖1、表2)。

圖1 Western blotting檢測E-cadherin、N-cadherin蛋白表達(dá)Fig 1 Western blotting was used to detect the expression of E-cadherin and N-cadherin protein

表2 干擾CBR3-AS1表達(dá)對胃癌細(xì)胞AGS增殖、遷移及侵襲的影響Tab 2 Effects of interference with CBR3-AS1 expression on the proliferation,migration and invasion of gastric

2.3 CBR3-AS1靶向調(diào)控miR-5195-3pstarBase預(yù)測顯示CBR3-AS1與miR-5195-3p存在結(jié)合位點(見圖2)。雙熒光素酶報告實驗結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染野生型載體WT-CBR3-AS1的細(xì)胞實驗中，與miR-NC組比較，miR-5195-3p組熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)；共轉(zhuǎn)染突變型載體MUT-CBR3-AS1的細(xì)胞實驗中，miR-5195-3p組熒光素酶活性與miR-NC組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見表3)。與si-NC組比較，si-CBR3-AS1組miR-5195-3p的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)(見表4)。

圖2 CBR3-AS1的序列中含有與miR-5195-3p互補(bǔ)的核苷酸序列Fig 2 The sequence of CBR3-AS1 contained a nucleotide sequence complementary to miR-5195-3p

表3 雙熒光素酶報告實驗Tab 3 Double luciferase report experiment

表4 CBR3-AS1靶向調(diào)控miR-5195-3p的表達(dá)Tab 4 CBR3-AS1 targeted and regulated the expression of

2.4 干擾miR-5195-3p表達(dá)可降低干擾CBR3-AS1表達(dá)對胃癌細(xì)胞AGS增殖、遷移及侵襲的抑制作用與si-CBR3-AS1+anti-miR-NC組比較，si-CBR3-AS1+anti-miR-5195-3p組細(xì)胞活力顯著升高(P<0.05)，遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)顯著增多(P<0.05)，E-cadherin蛋白水平顯著降低(P<0.05)，N-cadherin蛋白水平顯著升高(P<0.05)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(見圖3、表5)。

圖3 Western blotting檢測E-cadherin、N-cadherin蛋白表達(dá)Fig 3 Western blotting was used to detect the expression of E-cadherin and N-cadherin protein

表5 干擾miR-5195-3p表達(dá)可降低干擾CBR3-AS1表達(dá)對胃癌細(xì)胞AGS增殖、遷移及侵襲的抑制作用Tab 5 Interference with miR-5195-3p expression could reduce the inhibitory effect of interference with CBR3-AS1 expression on the proliferation,migration and invasion of gastric cancer cell AGS

3 討論

胃癌發(fā)生及轉(zhuǎn)移過程涉及多基因、多信號通路異常等，lncRNA表達(dá)異?？蓞⑴c腫瘤發(fā)生及發(fā)展過程，還可調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡等多種生物信息學(xué)過程，其表達(dá)量異常還與胃癌患者臨床病理學(xué)參數(shù)密切相關(guān)[7-11]。但仍有部分lncRNA在胃癌發(fā)生及發(fā)展過程中的作用機(jī)制尚未闡明，因而本研究積極探尋新型lncRNA并探究其可能調(diào)控機(jī)制，為胃癌的靶向治療提供潛在靶點。

CBR3-AS1在骨肉瘤組織或細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，并可促進(jìn)骨肉瘤發(fā)生及發(fā)展[12]。本研究結(jié)果顯示，胃癌細(xì)胞系中CBR3-AS1的表達(dá)水平升高，提示CBR3-AS1在胃癌發(fā)生過程中可能發(fā)揮重要調(diào)控作用。研究表明上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)與腫瘤細(xì)胞遷移及侵襲密切相關(guān)，上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)上調(diào)可抑制EMT從而抑制腫瘤轉(zhuǎn)移，間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-cadherin表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)EMT從而增強(qiáng)腫瘤轉(zhuǎn)移能力[13]。本研究結(jié)果顯示，干擾CBR3-AS1的表達(dá)后細(xì)胞活力顯著降低，遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)顯著減少，E-cadherin表達(dá)升高，N-cadherin表達(dá)降低，提示干擾CBR3-AS1的表達(dá)可抑制胃癌細(xì)胞增殖，還可能通過調(diào)控EMT途徑從而抑制胃癌細(xì)胞遷移及侵襲。

miR-5195-3p通過下調(diào)EIF4A2增強(qiáng)三陰性乳腺癌對紫杉醇的化學(xué)敏感性[14]。miR-5195-3p表達(dá)下調(diào)可促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移及腫瘤發(fā)生[15]。miR-5195-3p可抑制人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲[16]。miR-5195-3p通過直接靶向癌基因KLF5抑制人膀胱癌細(xì)胞的增殖及侵襲[17]。本研究結(jié)果顯示，胃癌細(xì)胞中miR-5195-3p的表達(dá)水平顯著降低，進(jìn)一步分析顯示，CBR3-AS1可靶向結(jié)合miR-5195-3p，還可負(fù)向調(diào)控miR-5195-3p的表達(dá)，由此推測CBR3-AS1可能通過調(diào)控miR-5195-3p的表達(dá)從而影響胃癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲。本研究將si-CBR3-AS1與anti-miR-5195-3p共轉(zhuǎn)染至胃癌細(xì)胞，結(jié)果顯示，細(xì)胞增殖、遷移與侵襲能力增強(qiáng)，并可抑制E-cadherin表達(dá)及促進(jìn)N-cadherin表達(dá)，說明干擾miR-5195-3p表達(dá)可降低干擾CBR3-AS1表達(dá)對胃癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的抑制作用。提示干擾CBR3-AS1表達(dá)可能通過上調(diào)miR-5195-3p的表達(dá)從而抑制胃癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲。

綜上所述，干擾CBR3-AS1表達(dá)可減弱胃癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力，其作用機(jī)制可能通過靶向調(diào)控miR-5195-3p的表達(dá)而發(fā)揮作用，可為進(jìn)一步揭示胃癌發(fā)生及轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制奠定實驗基礎(chǔ)，還可能作為胃癌靶向治療的潛在靶點。但關(guān)于miR-5195-3p下游靶基因及其可能作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探究。