賈辰樂,史克駿，南 杰，張 蕾

(山西省腫瘤醫(yī)院，山西 太原 030013)

我國頭頸部腫瘤的年發(fā)病率為15.22/10萬,占全身惡性腫瘤的4.45%，而且近年來發(fā)病率呈現(xiàn)明顯的升高趨勢，嚴(yán)重威脅著人類健康。頭頸部腫瘤類型多，以甲狀腺癌發(fā)病率最高。雖然經(jīng)過了幾十年的不斷努力，診療手段已有顯著的提高，但甲狀腺癌的生存率沒有明顯提高。在現(xiàn)有的手術(shù)、放化療等傳統(tǒng)治療方式之外，尋找新的治療方法是當(dāng)前研究的熱點。

過繼免疫細(xì)胞治療作為一種副作用小的新型療法近些年來受到科學(xué)界廣泛關(guān)注。比如細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷性細(xì)胞(CIK)，樹突狀細(xì)胞(DCs)，自然殺傷細(xì)胞(NK)，抗原嵌合受體T細(xì)胞(CAR-T)等[1]。這些細(xì)胞在體內(nèi)外均證實有較強的抗腫瘤效應(yīng)，但由于殺傷效率低，培養(yǎng)成本較高而受到一定的限制。γδT細(xì)胞是構(gòu)成機體固有免疫的一種重要細(xì)胞，特別在早期抗癌階段具有重要的作用，其抗原識別是非主要組織相容性復(fù)合體(MHC)限制性的，不依賴抗原的處理和呈遞過程，對腫瘤抗原的識別具有廣譜性特點[2-4]。雖然有報告證實其具有一定的殺腫瘤效應(yīng)，但它的體內(nèi)外殺傷活性研究報告相對較少[5]。在本研究選用甲狀腺癌腫瘤細(xì)胞作為靶細(xì)胞，研究γδT細(xì)胞的殺傷作用，為γδT細(xì)胞作為過繼細(xì)胞免疫治療應(yīng)用于臨床提供前期研究基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 試劑與儀器

PE標(biāo)記CD8、CD56、CD25、TCR-γδ的鼠抗人McAb及FITC標(biāo)記的CD4、HLA-DR、TCR-αβ的鼠抗人McAb均購自BD PharMingen公司；MTT檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；人外周血淋巴細(xì)胞分離液購自GE公司；注射用重組人白介素-2(IL-2)購自北京雙鷺?biāo)帢I(yè)股份有限公司；唑來膦酸(天晴依泰)購自正大天晴藥業(yè)集團股份有限公司；RPMI1640培養(yǎng)液、胰酶為Gibco公司產(chǎn)品；流式細(xì)胞儀為美國BECKMAN公司(FC500)；SW579細(xì)胞由中科院生物物理所惠贈。

1.2 方法

1.2.1 γδT細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定 采集健康志愿者外周血，淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心法分離人單個核細(xì)胞(PBMCs)，用RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為2×106/mL接種于25 mL培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)當(dāng)天加入唑來膦酸1 μmol/L和IL-2 300 U/mL，置于37℃、5%CO2條件下細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每3 d更換一半培養(yǎng)液，待細(xì)胞密度長至80%左右時陸續(xù)轉(zhuǎn)至75 mL、175 mL培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)15 d收集γδT細(xì)胞，取樣，PBS洗滌3次后，分別加入CD3、CD4、CD8、CD56、CD25、HLA-DR、TCR-αβ、TCR-γδ單克隆抗體，鑒定γδT細(xì)胞的純度。

1.2.2 γδT細(xì)胞殺傷實驗 調(diào)整對數(shù)生長期SW579、Hep-2細(xì)胞濃度為1×106/mL，作為γδT細(xì)胞體外殺傷的靶細(xì)胞，選取培養(yǎng)15 d的γδT細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，按照5∶1、10∶1、20∶1、40∶1的效靶比，每孔加入效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞各100 μL于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，同時設(shè)每個效靶比相應(yīng)的效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞對照。37℃共育4 h后，各孔加20 μLMTT(5 mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，離心棄上清，加入DMSO 200 μL/孔，輕柔振蕩10 min，酶標(biāo)儀460 nm檢測。殺傷率按下式計算：

殺傷率=[靶細(xì)胞對照孔A值-(實驗孔A值-效應(yīng)細(xì)胞對照孔A值)]/靶細(xì)胞對照孔A值×100%

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

SPSS10.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計數(shù)資料采用%表示，進行檢驗，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，兩類間比較采用配對t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體外成功培養(yǎng)鑒定γδT細(xì)胞

PBMCs經(jīng)過15 d培養(yǎng)，得到了百倍以上的細(xì)胞擴增，經(jīng)過流式細(xì)胞儀鑒定CD3-CD4-T:1.74%，CD3-CD8-T:5.02%，CD3-CD56-T:12.66%，CD3-HLA-DR-T:74.64%，CD4-CD25-T:0.38%，CD3-δβTCR-T:3.08%，CD3-γδTCR-T:87.28%，獲得了高純度的γδT細(xì)胞(見圖1)。

圖1 γδT細(xì)胞免疫表型鑒定

2.2 γδT細(xì)胞對頭頸部腫瘤細(xì)胞SW579的殺傷作用

從表1中可以看出，在40∶1、20∶1、10∶1、5∶1的效靶比時，γδT細(xì)胞對甲狀腺癌細(xì)胞及SW579均有明顯的殺傷作用，殺傷效率隨著效靶比升高而增大，兩兩比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而γδT細(xì)胞針對兩種細(xì)胞殺傷之間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表1 不同效靶比γδT細(xì)胞對兩種靶細(xì)胞的殺傷率表 %

3 討論

γδT細(xì)胞是介于特異性免疫與非特異性免疫之間的一種特殊類型的免疫細(xì)胞，主要分布于皮膚和黏膜組織，一般不超過T細(xì)胞總數(shù)的5%，γδT細(xì)胞處于機體免疫防護系統(tǒng)的第一線，在抗腫瘤免疫中具有重要作用，具有細(xì)胞毒性和分泌多種細(xì)胞因子及趨化因子的功能。γδT細(xì)胞是一種能識別癌抗原的免疫細(xì)胞又能殺傷癌細(xì)胞，主要用于識別癌細(xì)胞抗原，將這些抗原傳遞給其他效應(yīng)細(xì)胞，從而達(dá)到殺傷癌細(xì)胞的效果。但由于其數(shù)量有限，而且腫瘤患者本身的T細(xì)胞功能常常處于抑制狀態(tài)，因此，如何有效地在體外擴增活化純度較高的γδT細(xì)胞成為近些年研究的熱點。

本次研究使用唑來磷酸與IL-2聯(lián)合培養(yǎng)人體外周血PBMC，經(jīng)過15 d培養(yǎng)獲得純度高的γδT細(xì)胞，與國內(nèi)外報告類似[6]。然后選擇頭頸部常見的甲狀腺癌細(xì)胞與細(xì)胞株SW579作為靶細(xì)胞驗證γδT細(xì)胞在體外的抗瘤活性，結(jié)果顯示在不同的效靶比作用下，γδT細(xì)胞均有良好的抗腫瘤效應(yīng)，而且隨著效靶比的增高，抗腫瘤活性也逐步升高，本研究中設(shè)定的濃度界值為40∶1，研究發(fā)現(xiàn)隨著濃度的繼續(xù)升高，對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用不再增高，而對正常細(xì)胞卻有明顯殺傷，這與國內(nèi)外對免疫細(xì)胞治療達(dá)成的共識保持一致，國外的相關(guān)研究也曾有報道[3]。γδT細(xì)胞針對兩種類型腫瘤細(xì)胞的殺傷活性沒有明顯差異，也證實了γδT細(xì)胞主要以非特異性機制對抗腫瘤，具有廣譜的抗腫瘤效應(yīng)。本研究雖然對頭頸部高發(fā)病甲狀腺癌進行了不同效靶比中γδT細(xì)胞對兩種靶細(xì)胞的殺傷率的比較，但局限于樣本數(shù)量，以及對甲狀腺癌不同類型的治療效果的比較，以及頭頸部其他類型惡性腫瘤之間的比較，因此要想實現(xiàn)規(guī)模化應(yīng)用于臨床還需要多中心大樣本對照，以及對γδT細(xì)胞對頭頸部腫瘤細(xì)胞殺傷作用機制的更深研究。

綜上所述，γδT細(xì)胞能分泌大量細(xì)胞因子,參與體內(nèi)多種生理及病理過程,在免疫監(jiān)視及免疫防御等方面具有重要作用,可對癌細(xì)胞產(chǎn)生有效的細(xì)胞毒性反應(yīng)。目前臨床試驗結(jié)果表明,γδT細(xì)胞在抗腫瘤方面展現(xiàn)出了良好的應(yīng)用前景 體外高效誘導(dǎo)擴增γδT細(xì)胞簡單可行，擴增的γδT細(xì)胞對甲狀腺癌有明顯的殺傷效應(yīng)，而且殺傷率隨著效靶比的升高而增大，但達(dá)到40∶1為臨界點。γδT細(xì)胞可以作為一種過繼免疫細(xì)胞在臨床上進一步進行研究。