黃雨欣，雷 蕾，華克勤，辛衛(wèi)娟

(1.復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院婦產(chǎn)科，上海 200090；2.同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院婦產(chǎn)科，上海 200120)

子宮內(nèi)膜癌(endometrial carcinoma，EC)起源于子宮內(nèi)膜上皮，是女性生殖系統(tǒng)的第二大惡性腫瘤[1]。根據(jù)相關(guān)癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，我國2015年新發(fā)子宮內(nèi)膜癌患者約為63 400，死亡人數(shù)約為21 800人[2]。來自美國癌癥協(xié)會的最新數(shù)據(jù)則預(yù)計(jì)，2020年美國各州患子宮內(nèi)膜癌的新發(fā)患者將達(dá)到65 620例。此外，該協(xié)會根據(jù)2009—2015年的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)得出，未發(fā)生轉(zhuǎn)移的子宮內(nèi)膜癌患者的5年生存率可達(dá)95%，這一數(shù)據(jù)要顯著高于發(fā)生局部轉(zhuǎn)移患者的69%及發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者的16%[1]。因此，早期篩查診斷及準(zhǔn)確判斷癌癥轉(zhuǎn)移情況對于提高子宮內(nèi)膜癌患者生存率及改善預(yù)后具有重要意義。

長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA,lncRNA)是一類長度超過200個核苷酸的非編碼RNA[3]。lncRNA可作為基因表達(dá)的調(diào)節(jié)劑，參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展。越來越多的證據(jù)表明，lncRNA的失調(diào)與癌變和癌癥進(jìn)展有關(guān)，并且lncRNA的異常表達(dá)可作為疾病的診斷或預(yù)后標(biāo)志。Chen等[4]發(fā)現(xiàn)，lncRNA HOTAIR的上調(diào)能產(chǎn)生促進(jìn)食管鱗狀細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移并導(dǎo)致預(yù)后不良。

RP11-395G23.3已被證實(shí)為一種長鏈非編碼RNA且與EC的發(fā)病機(jī)制相關(guān)[5]。然而，其在EC中的作用與臨床意義在之前的研究中并未闡明。本研究選取了41例EC患者的腫瘤組織及26例正常子宮內(nèi)膜組織作為對照，檢測RP11-395G23.3在組織中的表達(dá)水平，并分析其與臨床病理特征及免疫組化指標(biāo)之間的關(guān)系。由此，探討其作為子宮內(nèi)膜癌相關(guān)生物標(biāo)志物的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院于2013年8月—2016年5月收治的41例子宮內(nèi)膜癌患者的腫瘤組織為研究對象，年齡26～76歲，平均(56.22±10.51)歲，絕經(jīng)年齡(41.25±8.21)歲?；颊呓M織病理分類：子宮內(nèi)膜樣癌32例，子宮內(nèi)膜漿液性癌7例，子宮內(nèi)膜透明細(xì)胞癌2例；根據(jù)FIGO判斷的手術(shù)病理分期：Ⅰ期26例，Ⅱ期5例，Ⅲ期9例，Ⅳ期1例；病理分級(僅針對子宮內(nèi)膜樣癌)：G1級17例，G2級8例，G3級7例。患者術(shù)前均未行化療、放療或激素治療。對照組選取了26例正常子宮內(nèi)膜組織。本研究得到了復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)(編號：2016-64)，所有受試者均簽署了知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 定量RT-PCR 從樣本中提取RNA后，將總RNA(1 μg)配成總體系為20 μL并含ATP和poly(A)聚合酶(PAP)的反應(yīng)混合物，于37 ℃條件下多聚腺苷酸化1 h。隨后用苯酚-氯仿提取及乙醇沉淀后，使用特異性反轉(zhuǎn)錄引物及PrimerScript反轉(zhuǎn)錄酶(TaKaRa公司)對RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，引物序列見表1。使用2×SYBR Premix Ex Taq TM混合物(Takara公司)進(jìn)行RT-PCR，來檢測組織中RP11-395G23.3的表達(dá)水平。以GAPDH作為內(nèi)參，引物序列見表1。相對表達(dá)量根據(jù)2-ΔΔCt法計(jì)算，以RP11-395G23.3相對表達(dá)量的均值(0.535)作為標(biāo)準(zhǔn)。小于等于均值記作低表達(dá)組，反之則為高表達(dá)組。

表1 RT-PCR引物序列Tab.1 Primer sequence of RT-PCR

1.2.2 免疫組織化學(xué)法 標(biāo)本經(jīng)甲醛固定、石蠟包埋及切片后，采用LSAB法處理，并用DAB顯色及蘇木素襯染。免疫組化指標(biāo)評分采用雙盲法，在鏡下隨機(jī)選取10個高倍視野，根據(jù)陽性細(xì)胞所占的比例及染色強(qiáng)度兩個指標(biāo)共同判斷免疫組化指標(biāo)評分。(1) 根據(jù)陽性細(xì)胞所占比例評分：<5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分；(2) 根據(jù)染色強(qiáng)度評分：無色=0，淡黃色=1，棕黃色=2，深棕色=3。最終得分為陽性細(xì)胞所占比例得分與染色強(qiáng)度得分相加的結(jié)果，并以此判定免疫組化指標(biāo)表達(dá)。將0判定為“-”，≤2判定為“+”，≤4判定為“++”，>4判定為“+++”。此外，將“-”及“+”記作低表達(dá)組，而“++”及“+++”則記作高表達(dá)組。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 RP11-395G23.3的表達(dá)水平

EC患者腫瘤組織中RP11-395G23.3表達(dá)水平(0.535±0.648)較對照組(1.477±1.329)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.312，P=0.002)。

2.2 RP11-395G23.3與EC臨床特征的關(guān)系

RP11-395G23.3表達(dá)水平與脈管內(nèi)見癌栓有關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；RP11-395G23.3表達(dá)水平與患者的年齡、組織病理分類、絕經(jīng)情況、FIGO分期、組織學(xué)分級、肌層浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移間的比較均未見有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

表2 RP11-395G23.3表達(dá)與EC患者臨床特征及免疫組化指標(biāo)間的關(guān)系Tab.2 Expression of RP11-395G23.3 and its relationships with clinical features and immunohistochemical indicators of EC patients [n(%)]

續(xù)表

2.3 RP11-395G23.3與免疫組化指標(biāo)的關(guān)系及相關(guān)性分析

RP11-395G23.3表達(dá)水平與雌激素受體(estro-genreceptor，ER)、孕激素受體(progesteronerec-eptor，PR)及P53表達(dá)水無關(guān)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；RP11-395G23.3與Ki-67表達(dá)水平有關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；并且，RP11-395G23.3與Ki-67表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.379,P=0.014)，見表3。

表3 RP11-395G23.3與免疫組化指標(biāo)的相關(guān)性Tab.3 Correlation between RP11-395G23.3 expression and immunohistochemical indicators

3 討 論

近年來，隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展，人們飲食結(jié)構(gòu)和生活習(xí)慣也發(fā)生改變，隨之代謝性疾病發(fā)病率增加，子宮內(nèi)膜癌出現(xiàn)了發(fā)病率升高和發(fā)病年輕化的趨勢[6]。雖然約90%子宮內(nèi)膜癌患者會出現(xiàn)陰道流血等表現(xiàn)，但早期EC患者在婦科檢查時可無異常表現(xiàn)。未在早期確診的患者將錯失最佳的治療時機(jī)，導(dǎo)致較低的長期生存率及預(yù)后不良的結(jié)果。因此，探討有助于子宮內(nèi)膜癌的早期診斷、病情進(jìn)程評估及判斷預(yù)后的生物標(biāo)志物，具有十分重要的臨床意義。

自2013年TCGA數(shù)據(jù)發(fā)布以來，人們一直在努力將分子檢測納入常規(guī)臨床組織學(xué)診斷評估中[7]。越來越多的研究結(jié)果證實(shí)，lncRNA與疾病包括癌癥[8]的發(fā)生機(jī)制相關(guān)。本研究旨在通過檢測子宮內(nèi)膜癌患者腫瘤組織中RP11-395G23.3的表達(dá)水平，將其與正常子宮內(nèi)膜組織中RP11-395G23.3的表達(dá)水平進(jìn)行對照，并闡明其與EC的臨床病理特征以及免疫組化指標(biāo)間的關(guān)系，為進(jìn)一步研究子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生機(jī)制、探尋潛在的診斷及治療靶點(diǎn)提供思路。

lncRNA可以通過基因轉(zhuǎn)錄，染色質(zhì)動力學(xué)，染色質(zhì)環(huán)化，組蛋白修飾，端粒生物學(xué)，蛋白質(zhì)復(fù)合物組裝，RNA剪接和翻譯等多個方面實(shí)現(xiàn)其調(diào)控作用[9]。lncRNA的失調(diào)在腫瘤的發(fā)生及發(fā)展中均具有重要意義[10]。在早前的研究中，lncRNA Hox反轉(zhuǎn)錄RNA(Hox transcript antisense RNA,HOTAIR)被證實(shí)來自HoxC基因反義鏈的轉(zhuǎn)錄，該基因的反義鏈特別位于染色體12q13.13上的HoxC11和HoxC12之間[11]。在He等[12]開展的包含87個樣本的研究中，近3/4的子宮內(nèi)膜癌樣本中檢測到了HOTAIR的表達(dá)上調(diào)。與正常組織相比，HOTAIR在EC組織中的表達(dá)明顯上調(diào)。He等還發(fā)現(xiàn)，HOTAIR與EC的轉(zhuǎn)移擴(kuò)散相關(guān)，HOTAIR的高表達(dá)與EC的轉(zhuǎn)移和整體生存率的降低呈正相關(guān)。肺腺癌轉(zhuǎn)錄相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1,MALAT1)也是一類受到廣泛關(guān)注與研究的lncRNA。MALAT1啟動子區(qū)域的結(jié)合位點(diǎn)能夠與TCF4相互作用，經(jīng)由Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)途徑誘導(dǎo)其自身表達(dá)。PCDH10(一種腫瘤抑制蛋白)則能通過抑制該途徑來抑制MALAT-1的轉(zhuǎn)錄。與正?；蛟錾淖訉m內(nèi)膜相比，EC樣品中的lncRNA-MALAT-1被下調(diào)[13-14]。在近年來的研究中，MALA-T1，HOTAIR，SRA，H19，OVAAL，CASC2等越來越多的lncRNA被證明與EC存在密切關(guān)聯(lián)[15]。

先前的研究中已證實(shí)RP11-395G23.3與miR-205-5p-PTEN網(wǎng)絡(luò)相關(guān)，并在EC的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中發(fā)揮重要作用[5]。Qu等的[16]研究證實(shí)，PTEN為miR-205-5p的直接靶點(diǎn)。與正常組織相比，PTEN在EC中的表達(dá)減少而miR-205-5p的表達(dá)則顯著增加。PTEN的低表達(dá)與EC的發(fā)病機(jī)制相關(guān)，而miR-205-5p的高表達(dá)與整體生存率低有關(guān)[5]。RP11-395G23.3能夠通過與miR-205-5p結(jié)合以抑制后者的表達(dá)和活性，即lncRNA通過堿基配對發(fā)揮了“miRNA海綿”的作用[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，EC組織中RP11-395G23.3表達(dá)水平與脈管內(nèi)見癌栓及Ki-67表達(dá)水平有關(guān)，且與Ki-67表達(dá)水平呈負(fù)性相關(guān)。

多數(shù)子宮內(nèi)膜癌的生長緩慢，而EC中的高級別內(nèi)膜樣癌及漿液性癌、透明細(xì)胞癌、癌肉瘤等類型則發(fā)展較快，能夠在短期內(nèi)發(fā)生轉(zhuǎn)移。其中，淋巴轉(zhuǎn)移為EC的主要轉(zhuǎn)移途徑。脈管內(nèi)見癌栓則提示腫瘤細(xì)胞已入侵血管或淋巴管，極有可能導(dǎo)致淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等危險因素發(fā)生。NCCN子宮腫瘤臨床實(shí)踐指南中指出，廣泛脈管內(nèi)癌栓是內(nèi)膜癌復(fù)發(fā)的顯著危險因素，提示預(yù)后不良[18]。脈管內(nèi)癌栓可作為子宮內(nèi)膜癌的預(yù)后因素。Li等[19]指出，lncRNA參與了多種癌癥細(xì)胞的轉(zhuǎn)移級聯(lián)反應(yīng)，提示lncRNA在腫瘤的轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。本研究數(shù)據(jù)顯示，在脈管內(nèi)見癌栓的EC患者的組織標(biāo)本中，RP11-395G23.3的表達(dá)水平顯著低于脈管內(nèi)未見癌栓組。這提示，RP11-395G23.3可能參與了子宮內(nèi)膜癌的進(jìn)展過程，且其低表達(dá)與EC患者的不良預(yù)后間存在密切關(guān)系。

近年來，大量證據(jù)表明，lncRNA的失調(diào)與腫瘤細(xì)胞的生長有關(guān)，可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的持續(xù)增長[20-21]。Cai等[22]發(fā)現(xiàn)，長基因間非蛋白質(zhì)編碼RNA665(long intergenic non-protein coding RNA 665,LINC00665)在EC組織中表達(dá)明顯上調(diào)，且在抑制LINC00665的表達(dá)后，子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的Ki-67水平顯著降低。即LINC00665的缺失可抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的活性，阻滯了G1期，并可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Ki-67是與細(xì)胞有絲分裂密切相關(guān)的核抗原，可反映細(xì)胞的增殖活性，在除G0期以外的細(xì)胞周期中均可檢測到Ki-67的表達(dá)。Ki-67表達(dá)量的多少與細(xì)胞的增殖、分化密切相關(guān)，可用作腫瘤發(fā)生、發(fā)展及細(xì)胞活性的檢測指標(biāo)，并且可作為結(jié)直腸癌、卵巢癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤的診斷指標(biāo)[23]。王彥秋等[23]的研究顯示，Ki-67與子宮內(nèi)膜癌患者FIGO分期、病理分級、肌層浸潤以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。并且，Ki-67高表達(dá)提示子宮內(nèi)膜癌患者的預(yù)后不良。根據(jù)本研究結(jié)果顯示，RP11-395G23.3的表達(dá)水平也與Ki-67的表達(dá)水平相關(guān)，且二者之間呈負(fù)性相關(guān)關(guān)系。即在RP11-395G23.3高表達(dá)的組織中，Ki-67水平較低，腫瘤細(xì)胞的生長受到抑制。也就是說，隨著RP11-395G23.3表達(dá)水平的增高，Ki-67表達(dá)水平將隨之降低。這提示，RP11-395G23.3的低表達(dá)可能與EC的發(fā)生發(fā)展及不良預(yù)后相關(guān)。這與根據(jù)RP11-395G23.3表達(dá)水平與脈管內(nèi)癌栓的形成間關(guān)系所得出的結(jié)論一致。即RP11-395G23.3可能參與EC的發(fā)生發(fā)展且其低表達(dá)與不良預(yù)后相關(guān)。因此，RP11-395G23.3與子宮內(nèi)膜癌密切相關(guān)，推測RP11-395G23.3能夠成為用于子宮內(nèi)膜癌的診斷、判斷病程進(jìn)展、患者預(yù)后、甚至是治療靶點(diǎn)的生物標(biāo)志物。

綜上，子宮內(nèi)膜癌中RP-11395G23.3的表達(dá)水平與脈管內(nèi)癌栓形成及Ki-67水平相關(guān)，可作為與子宮內(nèi)膜癌相關(guān)的生物標(biāo)志，用于子宮內(nèi)膜癌的診斷、評估病程發(fā)展及治療中，為EC的發(fā)生發(fā)展機(jī)制及患者治療提供新思路。在未來，RP-11395G23.3等基因在子宮內(nèi)膜癌的起源、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)等的作用及機(jī)制將會得到更完善的闡釋，并成為進(jìn)一步的研究方向。但本研究的病例數(shù)較少，在進(jìn)一步的研究中需要擴(kuò)大研究的樣本數(shù)量并通過繼續(xù)隨訪EC患者以驗(yàn)證其與患者預(yù)后情況之間的關(guān)系。