劉 娟，林 超，莊志剛

(1.同濟(jì)大學(xué)附屬第一婦嬰保健院乳腺外科，上海 201204；2.同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院，上海 200092)

乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤。2020年美國(guó)癌癥學(xué)會(huì)公布的數(shù)據(jù)顯示乳腺癌占女性新發(fā)腫瘤數(shù)的30%，高居第一位[1]。據(jù)報(bào)道，大約20%～40%的新診斷乳腺癌患者將經(jīng)歷明顯的臨床抑郁和心理困擾[2-4]。乳房切除術(shù)造成的乳房缺損經(jīng)常給患者的生理和心理帶來(lái)嚴(yán)重的創(chuàng)傷。乳房重建的實(shí)施則有助于幫助患者重塑身體外形，提高患者生存質(zhì)量，緩解部分臨床焦慮。乳房重建的方法主要包括假體植入和自體脂肪移植[5-7]，但假體植入引起的并發(fā)癥較多，諸如感染、血腫、積液、包膜攣縮、皮瓣壞死等[8-9];自體脂肪移植后脂肪細(xì)胞易液化、鈣化和凋亡，效果不夠穩(wěn)定，且脂肪鈣化會(huì)對(duì)術(shù)后定期影像學(xué)復(fù)查造成一定的誤導(dǎo)[10-11]。

干細(xì)胞是具有多向分化能力的未分化細(xì)胞[12]，其中脂肪干細(xì)胞因其來(lái)源充足、獲取簡(jiǎn)便、產(chǎn)量高且增殖速度快等優(yōu)點(diǎn)成為組織工程和再生醫(yī)學(xué)主要的細(xì)胞來(lái)源[13-14]。脂肪干細(xì)胞已被廣泛應(yīng)用于乳房重建，在假體植入和自體脂肪移植中都是有益的[15]。Zuk等[16]首次從人脂肪組織中成功提取脂肪源干細(xì)胞(human adipose-derived stem cells,hADSCs)。后續(xù)的研究發(fā)現(xiàn)，hADSCs的成脂分化過(guò)程受一些調(diào)控因子和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控，如C/EBPβ、PPARγ、Wnt/β-catenin和PI3K/Akt等[17-19]。近年的研究發(fā)現(xiàn)，高度保守的TRIB蛋白家族對(duì)脂肪的形成具有影響作用[20-21]。TRIB蛋白家族由3種相關(guān)的絲氨酸/蘇氨酸激酶樣蛋白TRIB1、TRIB2和TRIB3組成，其中TRIB2可以通過(guò)抑制Akt的活性，降解C/EBPβ，達(dá)到抑制脂肪生成的作用[22]。Andersen等[23]發(fā)現(xiàn)，在納米支架表面涂覆小干擾RNA(siRNA)沉默間充質(zhì)干細(xì)胞的TRIB2基因能夠有效促進(jìn)干細(xì)胞的成脂分化。然而，利用非病毒載體遞送siRNA促進(jìn)ADSC向脂肪分化的研究鮮有報(bào)道。本研究使用前期發(fā)現(xiàn)的生物可降解聚氨酯CPU作為非病毒基因遞送載體[24]，研究其介導(dǎo)TRIB2-siRNA進(jìn)入hADSCs的轉(zhuǎn)染活動(dòng)，檢測(cè)TRIB2基因的沉默效率及對(duì)干細(xì)胞成脂分化過(guò)程的影響，為T(mén)RIB2基因在促進(jìn)脂肪分化的領(lǐng)域提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株、主要試劑和儀器

人源脂肪干細(xì)胞ADSC購(gòu)自美國(guó)ATCC公司；DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)和青霉素-鏈霉素溶液(P/S)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；Lipofecta-mineTM2000、Lyso-Tracker Green購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；DEPC水，TRIzol購(gòu)自美國(guó)Ambion公司；氯仿、異丙醇、1,4-雙(3-氨基丙基)哌嗪(BAP)、PrimeScriptTMRT Master Mix reagent Kit、TB GreenTMPremix Ex TaqTM(TliR-NaseH Plus) Reagent Kit購(gòu)自日本TaKaRa公司；Hoechst33342購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；倒置熒光顯微鏡及照相系統(tǒng)購(gòu)自日本Olympus公司；酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；Viscoteck GPCmax型凝膠滲透色譜儀和納米粒度及電位分析儀購(gòu)自英國(guó)Malvern公司；激光共聚焦顯微鏡購(gòu)自德國(guó)Leica公司；siRNA購(gòu)自吉瑪基因公司，TRIB2-siRNA序列：5′-GGACGAAGAGAGGACUCGGdTdT-3′，陰性對(duì)照NC-siRNA序列：5′-CCCUAUUCUCCUUCUUCGC-dTdT-3′。

1.2 陽(yáng)離子聚氨酯材料CPU的合成及化學(xué)表征

根據(jù)文獻(xiàn)[24]合成生物可降解的陽(yáng)離子型CPU，即通過(guò)2,2′-二硫代二乙醇雙對(duì)硝基苯基碳酸酯與1,4-雙(3-氨基丙基)哌嗪縮聚反應(yīng)，制備出CPU。通過(guò)凝膠滲透色譜儀測(cè)得CPU的數(shù)均分子量(Mn)為316 000,重均分子量(Mw)為50 000，分子量分散指數(shù)(Mw/Mn)為1.58。

使用Viscoteck GPC max型凝膠滲透色譜儀測(cè)試CPU的分子量及分散度。將CPU與siRNA按N/P為20∶1吹打混勻，室溫25 ℃條件下孵育30 min 后，使用納米粒度及電位分析儀測(cè)量復(fù)合物的粒徑、分散度及表面電荷。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

人源脂肪干細(xì)胞ADSC培養(yǎng)在含有10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素以及10 ng/mL成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)的DMEM/F12培養(yǎng)基中，于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d更換培養(yǎng)基。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組及瞬時(shí)轉(zhuǎn)染方法

將人工合成的TRIB2-siRNA和NC-siRNA溶于DEPC水中制成20 μmol/L貯存液，實(shí)驗(yàn)時(shí)用DEPC水稀釋成所需濃度。實(shí)驗(yàn)分為：Blank組(未處理的細(xì)胞做空白對(duì)照)，Lipo2000組(LipofectamineTM2000作為基因轉(zhuǎn)染載體)，CPU組(CPU作為基因轉(zhuǎn)染載體)，NC組(使用CPU轉(zhuǎn)染NC-siRNA)。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染(以24孔板為例)：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以2×104個(gè)/孔的密度接種到24孔板中，接種24 h后觀察細(xì)胞，待細(xì)胞融合至40%～50%進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。LipofectamineTM2000/siRNA比例為4/1,CPU/siRNA的N/P比為20∶1,每孔轉(zhuǎn)染siRNA質(zhì)量為0.5 μg。轉(zhuǎn)染時(shí)將CPU與siRNA按質(zhì)量比混勻后，輕柔地吹打5次后，室溫下靜置30 min。用無(wú)血清培養(yǎng)基轉(zhuǎn)染細(xì)胞，1 h后更換成全培養(yǎng)基(含血清)完成轉(zhuǎn)染過(guò)程。

1.5 成脂誘導(dǎo)方法

將細(xì)胞按1.4方法轉(zhuǎn)染后，待細(xì)胞長(zhǎng)至基本融合，換為成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基(A液：1 μmol/L地塞米松，10 μg/mL胰島素，200 μmol/L吲哚美辛和0.5 mmol/L IBMX，含10%胎牛血清、1%雙抗的基礎(chǔ)培養(yǎng)基；B液：10 μg/mL胰島素，10%胎牛血清，1%雙抗的基礎(chǔ)培養(yǎng)基)。小心吸走完全培養(yǎng)基后每孔加入0.5 mL誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基A液，誘導(dǎo)3 d 后，更換B液；24 h后吸走B液，換回A液進(jìn)行誘導(dǎo)。A液B液交替作用，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求分別誘導(dǎo)2、7、14和28 d。

1.6 Alamar Blue法檢測(cè)CPU對(duì)細(xì)胞增殖的影響

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞按每孔2×104細(xì)胞密度均勻的加入到24孔板中，加入TRIB2-siRNA/CPU復(fù)合物后將置于37 ℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h后用Alamar Blue檢測(cè)細(xì)胞活力，每組3個(gè)平行復(fù)孔。細(xì)胞存活率的計(jì)算方法如下。

細(xì)胞存活率(%)=(Asample-A)/(Acontrol-A0)×100

Asample代表實(shí)驗(yàn)組吸光度值；A0代表1×Alamar Blue工作液吸光度值；Acontrol代表空白組吸光度值。

1.7 激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞攝取情況

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的ADSC細(xì)胞5×104/皿接種于20 mm激光共聚焦專(zhuān)用皿上，置于恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞融合度至40%～50%時(shí)進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，將帶有CY5標(biāo)記的TRIB2-siRNA與CPU混合后無(wú)血清條件下轉(zhuǎn)染2、4和8 h，后續(xù)分別用Hoechst33342和Lyso Tracker Green對(duì)細(xì)胞核和溶酶體進(jìn)行染色，然后通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察ADSC細(xì)胞內(nèi)熒光表達(dá)情況。細(xì)胞內(nèi)紅色熒光表示CY5-TRIB2-siRNA,藍(lán)色熒光表示細(xì)胞核，綠色熒光代表溶酶體。

1.8 qPCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞后TRIB2 mRNA的表達(dá)

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的ADSC細(xì)胞以2×104/孔的密度接種于24孔板中，實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、Lipo2000組、CPU組、NC組。接種24 h后轉(zhuǎn)染TRIB2-siRNA，分別于2、7、14和28 d分別收集各組細(xì)胞，利用傳統(tǒng)TRIzol法抽提RNA，然后通過(guò)反轉(zhuǎn)錄試劑盒Prime ScriptTMRT Master Mix Reagent Kit將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板,采用TB GreenTMPremix Ex TaqTM(TliRNaseH Plus) Reagent Kit進(jìn)行qPCR反應(yīng)。TRIB2以及內(nèi)參GAPDH的引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.9 油紅O染色及定量分析結(jié)果

將ADSC細(xì)胞接種于24孔板中，待細(xì)胞融合至40%～50%時(shí)轉(zhuǎn)染TRIB2-siRNA(實(shí)驗(yàn)分組同1.8)，之后成脂誘導(dǎo)并培養(yǎng)28 d。將各組細(xì)胞用4%多聚甲醛固定30 min，經(jīng)PBS洗滌后每孔加入0.5 mL油紅O工作液(油紅O貯存液∶二次水=3∶ 2，混勻后用中性濾紙過(guò)濾即可)染色30 min，再次洗滌后置于倒置顯微鏡下觀察成脂染色效果并拍照。使用異丙醇萃取脂滴中的油紅O并測(cè)量518 nm處的吸光度(A518)值進(jìn)行半定量分析。每個(gè)樣本重復(fù)3次。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 陽(yáng)離子型聚氨酯/siRNA復(fù)合物的表征

在Hepes緩沖溶液(pH=7.4)中，CPU/siRNA復(fù)合物在N/P為20∶1的條件下，粒徑為(158.9±0.8) nm，粒徑分散度較小(PDI=0.221)，表面帶有正電荷[(25.6±2.5) mV]，見(jiàn)圖1。

圖1 CPU/siRNA復(fù)合物的粒徑及表面Zeta電位Fig.1 Particle size and zeta potential of CPU/siRNA complexesA：CPU/siRNA復(fù)合物粒徑；B：表面Zeta電位

2.2 CPU在ADSC中的轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞毒性測(cè)定

qPCR法檢測(cè)TRIB2-siRNA轉(zhuǎn)染hADSCs的TRIB2mRNA表達(dá)水平。CPU組TRIB2mRNA的表達(dá)水平(0.291±0.038)較空白對(duì)照組顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.000 1)，并且低于Lipo2000組的TRIB2mRNA的表達(dá)水平(0.515±0.056，P<0.000 1)，見(jiàn)圖2A。使用Alamar Blue檢測(cè)細(xì)胞存活率表明，CPU組對(duì)hADSCs的細(xì)胞活性影響很小，細(xì)胞的存活率為(96.4±1.9)%，與空白組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖2B。

圖2 TRIB2-siRNA轉(zhuǎn)染hADSCs后TRIB2 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平及細(xì)胞存活率Fig.2 The relative expression of TRIB2 mRNA and cell survival rate of hADSCs after transfection with TRIB2-siRNAA：TRIB2 mRNA相對(duì)表達(dá)水平；B：細(xì)胞存活率；多組之間的比較采用單因素方差分析，****P<0.000 1

2.3 siRNA在ADSCs中的攝取過(guò)程

使用CY5標(biāo)記的siRNA轉(zhuǎn)染hADSCs，并分別使用LysoTracker標(biāo)記溶酶體,Hoechst33342標(biāo)記細(xì)胞核,觀察siRNA進(jìn)入細(xì)胞的情況。轉(zhuǎn)染2 h時(shí)，細(xì)胞體內(nèi)的siRNA(紅色)較少；當(dāng)轉(zhuǎn)染4 h時(shí)，部分siRNA位于酸性?xún)?nèi)含體/溶酶體(綠色)。但轉(zhuǎn)染8 h時(shí)，紅色與綠色重疊較少，說(shuō)明siRNA逃逸至細(xì)胞胞質(zhì)中，見(jiàn)圖3。這說(shuō)明CPU能夠有效的介導(dǎo)siRNA進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中。

圖3 激光共聚焦顯微鏡觀察CPU/siRNA-CY5(紅色)轉(zhuǎn)染hADSCs后siRNA在hADSCs中的位置Fig.3 Laser confocal microscope was used to observe the position of siRNA in hADSCs after CPU/siRNA-CY5(red)LysoTracker和Hoechst33342染料分別標(biāo)記溶酶體(綠色)和細(xì)胞核(藍(lán)色)；標(biāo)尺大小為20 μm

2.4 體外培養(yǎng)2、7、14和28 d后ADSCs TRIB2 mRNA的表達(dá)水平

使用LipofectamineTM2000和CPU分別介導(dǎo)TRIB2-siRNA體外轉(zhuǎn)染hADSCs后，體外成脂誘導(dǎo)分別培養(yǎng)2、7、14和28 d，通過(guò)qPCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)TRIB2mRNA的表達(dá)，見(jiàn)圖4。轉(zhuǎn)染2 d后，Lipo-2000組與CPU組兩組之間TRIB2mRNA的表達(dá)水平具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.000 1)。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞體內(nèi)TRIB2mRNA的表達(dá)水平逐漸回升，Lipo2000組和CPU組轉(zhuǎn)染2、28 d的TRIB2mRNA的表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。

圖4 qPCR分析TRIB2-siRNA轉(zhuǎn)染hADSCs且成脂誘導(dǎo)后細(xì)胞TRIB2 mRNA的表達(dá)水平Fig.4 The relative expression of TRIB2 mRNA of hADSCs after transfected with TRIB2-siRNA and differentiation was induced with adipogenic medium by qPCR多組之間的差異比較采用單因素方差分析；***P<0.001,****P<0.000 1

2.5 成脂誘導(dǎo)28 d后ADSC細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞分析

使用CPU/TRIB2-siRNA轉(zhuǎn)染hADSCs且成脂誘導(dǎo)28 d后，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行油紅O染色，光學(xué)顯微鏡下觀察脂滴形成情況。TRIB2組的脂滴數(shù)量明顯較未處理的細(xì)胞(Blank組)多，且脂滴顏色較深，見(jiàn)圖5A。用異丙醇將溶解在脂滴中的油紅O萃取，測(cè)量510 nm處的吸光度值(A510)，TRIB2組的吸光度值高于Blank組，見(jiàn)圖5B。用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，TRIB2組和Blank組的吸光度值的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。

圖5 CPU/TRIB2-siRNA轉(zhuǎn)染hADSCs且成脂誘導(dǎo)分化28 d的光學(xué)顯微鏡照片F(xiàn)ig.5 Optical micrograph of hADSCs stained with oil red O after transfected with TRIB2-siRNA and induced with adipogenic medium for 28 daysA：倒置顯微鏡下觀察染色照片，標(biāo)尺大小為100 μm；B：對(duì)油紅O染色進(jìn)行半定量分析；**P<0.001

3 討 論

成體干細(xì)胞具有多向分化的潛能，是再生醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中重要的種子細(xì)胞源[25]。脂肪干細(xì)胞成脂肪分化是一個(gè)多因素、多因子調(diào)節(jié)的復(fù)雜過(guò)程[12]。TRIB蛋白家族由3種相關(guān)的絲氨酸/蘇氨酸激酶樣蛋白TRIB1、TRIB2及TRIB3組成，其在脂肪調(diào)控的過(guò)程中發(fā)揮作用[20-21]。Bezy等[26]發(fā)現(xiàn)TRIB3在3T3-L1細(xì)胞過(guò)表達(dá)抑制C/EBPβ的磷酸化和PPARγ的誘導(dǎo)，進(jìn)而阻止3T3-L1的分化。TRIB2作為T(mén)RIB3的同源性基因，在脂肪形成過(guò)程中也發(fā)揮著類(lèi)似的調(diào)節(jié)作用。Naiki等[22]的研究表明，TRIB2通過(guò)蛋白酶體依賴(lài)性機(jī)制與C/EBPβ同工型LAP結(jié)合抑制Akt活化與C/EBPβ的降解，從而抑制脂肪生成。

成功的遞送siRNA進(jìn)入脂肪干細(xì)胞依賴(lài)安全、有效的遞送載體。目前常用的遞送載體主要分為病毒載體和非病毒載體。病毒載體主要包括慢病毒和腺相關(guān)病毒，它具有轉(zhuǎn)染效率高的特點(diǎn)，但存在較高的免疫原性和潛在的致癌性，而且制備復(fù)雜、技術(shù)門(mén)檻較高，限制了其在臨床上的廣泛應(yīng)用。比較而言，非病毒載體毒副作用小、結(jié)構(gòu)容易調(diào)控、易于制備，具有廣闊的應(yīng)用前景[27]。陽(yáng)離子多聚物是一種非病毒載體[28]。Andersen等[23]利用可降解聚酯納的納米支架遞送TRIB2-siRNA夠促進(jìn)脂肪干細(xì)胞向脂肪的分化。本研究采用課題組制備的含有二硫鍵的CPU作為載體，轉(zhuǎn)運(yùn)TRIB2-siRNA進(jìn)入脂肪干細(xì)胞。本課題組前期研究證實(shí)，CPU具有生物可降解性、生物相容性和低毒性等特點(diǎn)[29]，可作為DNA的遞送載體。帶正電荷的CPU能夠通過(guò)靜電作用將帶負(fù)電的siRNA包裹、壓縮以及最終形成帶正電的納米復(fù)合物。細(xì)胞膜特有的雙分子層結(jié)構(gòu)表面呈負(fù)電性。因此，該復(fù)合物所帶的正電荷有助于復(fù)合物的細(xì)胞內(nèi)吞。使用激光共聚焦顯微鏡觀察到CPU能有效介導(dǎo)CY5標(biāo)記的TRIB2-siRNA進(jìn)入干細(xì)胞。本研究的數(shù)據(jù)表明，CPU組TRIB2mRNA的表達(dá)量明顯下降且細(xì)胞增殖率在95%以上，這說(shuō)明CPU能高效的遞送siRNA，且具有較低的細(xì)胞毒性。

綜上，通過(guò)聚氨酯轉(zhuǎn)運(yùn)TRIB2-siRNA能有效轉(zhuǎn)染脂肪干細(xì)胞并促進(jìn)干細(xì)胞的成脂分化。在未來(lái)的乳房重建術(shù)中，利用CPU/TRIB2-siRNA轉(zhuǎn)染脂肪干細(xì)胞為乳房重建提供了一種新的方案。