馮 濤 ， 閆 爽 ， 薛 原

(東北林業(yè)大學(xué)野生動物與自然保護(hù)地學(xué)院 ， 黑龍江 哈爾濱 150040)

大腸桿菌被認(rèn)為是衡量食品糞便污染的一個指標(biāo)，其耐藥性和基因可以通過食物鏈轉(zhuǎn)移給人類，這對公共衛(wèi)生有潛在的風(fēng)險[1]。β-內(nèi)酰胺類藥物是目前在臨床上最為廣泛使用的抗生素之一，超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(Extended-spectrum-β-lactamases, ESBLs)是一種由質(zhì)粒介導(dǎo)傳播的可以水解β-內(nèi)酰胺類藥物的水解酶[2]，由于抗生素的廣泛甚至不正當(dāng)使用，導(dǎo)致多種ESBLs的基因型產(chǎn)生，包括TEM、OXA、CTX-M和SHV等[3]。近年來，國外已有關(guān)于產(chǎn)ESBLs菌株引起疾病暴發(fā)流行的報道[4]，我國對這類大腸桿菌的檢出率也在急劇增加[5]。

本試驗檢測和分析了東北地區(qū)不同狐源養(yǎng)殖場中ESBLs基因分布情況，旨在調(diào)查狐源中產(chǎn)ESBLs大腸桿菌的分子流行情況，為東北地區(qū)狐源養(yǎng)殖場的臨床用藥、預(yù)防和控制ESBLs基因的傳播和流行提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株 大腸桿菌質(zhì)控菌株(編號為ATCC25922)，由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供；試驗菌株，于2016—2019年分離自東北不同地區(qū)狐養(yǎng)殖場，并分離純化和鑒定為大腸桿菌，共224株。

1.2 試劑 藥敏紙片，購自杭州天和微生物試劑有限公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒、DNA 片段凝膠回收試劑盒，均購自愛思進(jìn)生物技術(shù)有限責(zé)任公司；水解酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基(Mueller-Hinton,MH)、瓊脂糖，均購自西隴科學(xué)股份有限公司；10×Buffer、dNTP、Taq酶、DL-2 000 marker、6×Loading Buffer、pMD18-T 載體、感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH5α，均購自TaKaRa公司。

1.3 ESBLs耐藥表型的測定 ESBLs耐藥表型的檢測采用美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化研究所(CLSI)[6]推薦的雙紙片法進(jìn)行判定。初篩試驗中，將試驗用大腸桿菌均勻涂布于MH培養(yǎng)基，采用紙片擴(kuò)散法，滿足頭孢他啶(CAZ)的抑菌直徑≤22 mm或頭孢噻肟(CTX)的直徑≤27 mm，樣本即可能為產(chǎn)ESBLs的菌株。進(jìn)行確證試驗，將試驗用菌均勻涂布于MH培養(yǎng)基瓊脂平板，貼頭孢他啶(CAZ)、頭孢他啶/克拉維酸(CAZ/Clav)為1組，頭孢噻肟(CTX)、頭孢噻肟/克拉維酸(CTX/Clav)為2組，共兩組藥敏紙片，若任一組藥物的抑菌圈直徑差≥5 mm，即可確定為產(chǎn)ESBLs的菌株。

1.4 ESBLs基因型的檢測 按照參考文獻(xiàn)[4,7-8]設(shè)計引物序列，TEM-F:GTATCCGCTCATGAGACAATA，TEM-R:AGAAGTGGTCCTGCAACTTT；CTX-M-F:GGGCTGAGATGGTGACAAAGAG，CTX-M-R:CG TGCGAGTTCGATTTATTCAAC；SHV-F:TCTCCCTGTTAGCCACCCTG，SHV-R:CCACTGCAGCAGCTGCCG TT；OXA-F:GCAGCGCCAGTGCATCAAC，OXA-R:C CGCATCAAATGCCATAAGTG。對擴(kuò)增出來的PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳驗證，膠回收純化后與pMD18-T載體連接，并轉(zhuǎn)入到感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH5α中，將質(zhì)粒樣本送至吉林庫美生物技術(shù)有限公司測序部進(jìn)行序列測定，利用DNASTAR軟件分析，與GenBank的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較分析，確定基因型。

2 結(jié)果

2.1 ESBLs檢測 224株狐源大腸桿菌在初篩試驗中有178株為疑似產(chǎn)ESBLs菌株，經(jīng)確證試驗，178株疑似菌株均為產(chǎn)ESBLs菌株，占總菌株數(shù)的79.46%(178/224)。

2.2 ESBLs基因型的檢測 在224株狐源大腸桿菌中，TEM、OXA、CTX-M型和SHV型基因擴(kuò)增均出現(xiàn)陽性，擴(kuò)增片段大小與預(yù)期目的片段相符，經(jīng)測序可得，其同源性均在99%以上。

分別統(tǒng)計單獨攜帶和復(fù)合基因型的檢出情況，見表1。由表1可知，TEM、CTX-M、SHV和OXA陽性率依次為98.21%、75.45%、62.50%和93.30%，TEM和OXA為主要的ESBLs的基因型。同時檢出4種基因型的比例最大，為47.32%，攜帶2個及2個以上基因型的大腸桿菌高達(dá)98.21%，沒有單獨攜帶CTX-M和SHV的情況。

表1 狐源大腸桿菌產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因攜帶情況及基因型Table 1 Detection of genotypes of ESBLs-producing Escherichia coli strains isolated from fox

3 討論

抗生素在獸醫(yī)臨床用藥和促進(jìn)動物生長發(fā)育中起到重要的作用，但是由于抗生素的廣泛使用或者使用不當(dāng)?shù)?，?dǎo)致細(xì)菌出現(xiàn)耐藥性，甚至出現(xiàn)多重耐藥菌。自首次發(fā)現(xiàn)產(chǎn)ESBLs菌株以來[9]，國內(nèi)外各地檢出ESBLs菌株的比例越來越大。其中產(chǎn)ESBLs菌株在大腸桿菌和克雷伯菌中報道最多[10]。尤其需要注意的是，編碼β-內(nèi)酰胺酶的基因大多位于質(zhì)粒上，并且可以伴隨質(zhì)粒通過接合、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)等在細(xì)菌種內(nèi)甚至種間傳播[11]，而且產(chǎn)ESBLs菌株所包含的質(zhì)粒常常也攜帶著其他非ESBLs的耐藥基因[12]，使耐藥菌的擴(kuò)散范圍越來越廣，為耐藥菌的防控和獸醫(yī)臨床治療造成了不可逆的影響。

在本次試驗中對狐源大腸桿菌進(jìn)行了ESBLs耐藥表型的檢測，有178株為產(chǎn)ESBLs的菌株，陽性率高達(dá)79.46%。對全部試驗用大腸桿菌進(jìn)行耐藥基因型的檢測，其中TEM的檢出率最高，有220株大腸桿菌表現(xiàn)為具有TEM型，陽性率為98.21%。Fortini等[13]對尼日利亞的健康豬進(jìn)行檢測，同樣以TEM為主要的ESBLs流行基因型。國外相關(guān)研究[14]也表明，ESBLs的基因型在由TEM向CTX-M轉(zhuǎn)變。所有細(xì)菌都攜帶ESBLs耐藥基因，超過95%以上的細(xì)菌攜帶2種及2種以上的耐藥基因型，同時攜帶4種基因型的陽性率為47.32%，與曹敏等[15]報道的貴州部分地區(qū)豬源大腸桿菌ESBLs基因型的結(jié)果相似，這也證明了狐源大腸桿菌的ESBLs耐藥基因型較為復(fù)雜，對藥物極易產(chǎn)生耐藥情況，并且對動物的臨床治療產(chǎn)生了困難。

由于毛皮動物的飼養(yǎng)在我國占據(jù)較為重要的地位，而對其耐藥性和耐藥基因的研究工作較少，開展ESBLs的檢測和監(jiān)控，用以防止多重耐藥菌的擴(kuò)散和暴發(fā)，對指導(dǎo)獸醫(yī)臨床用藥具有一定的意義。了解ESBLs耐藥基因的流行病學(xué)規(guī)律，可以有效的評估耐藥性從動物擴(kuò)散到環(huán)境甚至傳播到人類的風(fēng)險。建議采用聯(lián)合用藥或者抗生素替代的方式，避免耐藥性的進(jìn)一步擴(kuò)散，減少耐藥菌的公共衛(wèi)生安全。