張日欣 , 范 強 , 賀永明 , 俞美子
(遼寧農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院畜牧獸醫(yī)系 , 遼寧 營口 115009)
沙門菌是一種常見的人獸共患病原菌,不僅造成養(yǎng)殖戶嚴重的經(jīng)濟損失,同時威脅著人類的食品安全,每年都有大量人群被感染,敗血癥或胃腸炎等是感染沙門菌的典型癥狀[1-3]。莊河大骨雞是遼寧省培育的地方特色雞群,其以體大敦實,覓食能力強,產(chǎn)蛋多且大,肉質(zhì)鮮嫩等特點[4-5]。近幾年,莊河大骨雞飼養(yǎng)在遼南地區(qū)發(fā)展迅猛,規(guī)?;B(yǎng)殖場與日俱增,在感染莊河大骨雞的眾多病原菌中,沙門菌是較常見的致病菌,嚴重制約了莊河大骨雞養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[6-7]。因此,對莊河大骨雞中沙門菌的病原菌的分離、鑒定及藥敏試驗具有重要意義。
1.1 病料收集 于蓋縣、莊河、岫巖、遼陽等地區(qū)莊河大骨雞養(yǎng)殖場中隨機抽樣選取雞390只,取雞的心臟、肝臟、腸道等組織器官作為被檢材料,標(biāo)號。
1.2 質(zhì)控菌株 本次試驗使用質(zhì)控菌株為ATCC 14028,購自北京蘭博瑞生物技術(shù)有限公司。
1.3 儀器與試劑 生物安全柜(NUAIRE公司);全自動高壓立式滅菌鍋、恒溫培養(yǎng)箱(上海申安醫(yī)療器械有限公司);PCR擴增儀(美國伯樂BIO-RAD公司);營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、HE瓊脂培養(yǎng)基、SS瓊脂培養(yǎng)基、三糖鐵培養(yǎng)基,均購自北京奧博星生物技術(shù)有限公司;各種細菌微量生化鑒定管,購自杭州天和微生物試劑有限公司;DNA提取試劑盒、2×PCR SuperMix、Marker 2 000 bp,均購自天根生物科技(北京)有限公司。
1.4 細菌的分離培養(yǎng) 無菌采集雞的心臟、肝臟、腸道等組織器官,劃線接種于無菌麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板及SS瓊脂培養(yǎng)基平板上,(36±1)℃培養(yǎng)24 h。 觀察生長結(jié)果,選單個菌落繼續(xù)純化培養(yǎng),保種用于后續(xù)鑒定。
1.5 顯微鏡觀察 選取純化培養(yǎng)后的單個菌落涂片進行革蘭染色,鏡檢觀察細菌形態(tài)。
1.6 生化試驗 根據(jù)所購買的細菌生化鑒定管的說明書要求,對初步分離出來的沙門菌分離株依次接種于吲哚、丙二酸鹽、鄰硝基酚β-D-半乳糖昔(ONPG)、尿素、蔗糖、麥芽糖、尿素、甘露醇、乳糖等生化管中,經(jīng)(36±1) ℃恒溫培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果。
1.7 藥敏試驗 選取單個的疑似菌落進行純培養(yǎng),將培養(yǎng)好的菌液均勻的涂抹于普通固體培養(yǎng)基上,用無菌鑷子輕輕夾取各種藥敏紙片輕輕貼于培養(yǎng)基表面。各個藥敏紙片的中心距離應(yīng)大于2.5 cm,每個藥敏紙片距離平皿邊緣的距離應(yīng)該大于1.5 cm。 貼完后,將平皿倒置于恒溫箱中,(36±1)℃培養(yǎng)24 h后觀察,根據(jù)美國臨床和實驗室標(biāo)準協(xié)會(CLSI)藥敏標(biāo)準進行判定。
1.8 血清型鑒定 參照GB 4789.4—2016《沙門氏菌檢驗》采用A~F多價O血清及單因子血清鑒定沙門菌的O抗原,根據(jù)O抗原及H抗原第1相和第2相反應(yīng)結(jié)果進行血清分群和定型。
1.9 耐藥基因檢測 根據(jù)GenBank上發(fā)表的基因序列,經(jīng)過查閱相關(guān)文獻,結(jié)合軟件Primer 5.0引物設(shè)計,設(shè)計3對引物用來擴增四環(huán)素類、β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類代表性耐藥基因。PCR反應(yīng)體系20.0 μL:Premix TaqTM10.0 μL,上、下游引物各 1.0 μL,DNA模板1.0 μL,滅菌雙蒸水7.0 μL。擴增程序:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃ 30 s,51~55 ℃ 40 s,72 ℃ 45 s,30個循環(huán);72 ℃延伸8 min。產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳,凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。
表1 PCR擴增引物序列Table 1 Primer sequence of PCR amplification
2.1 沙門菌的分離 培養(yǎng)24 h后,部分菌株在SS培養(yǎng)基可見黑色透明菌落,繼續(xù)分離培養(yǎng)。麥康凱培養(yǎng)基可見無色菌落。經(jīng)純化、染色、鏡檢,確定為革蘭陰性菌,鏡檢可見菌體短小、兩端鈍圓,多分散存在。初步判定分離株為沙門菌,共計51株。
2.2 沙門菌的生化鑒定 生化鑒定結(jié)果見表2。51株分離株中49株分離株對葡萄糖、賴氨酸脫氫酶、果糖、甘露醇結(jié)果呈陽性,對乳糖、鳥氨酸、蔗糖、尿素、吲哚試驗呈陰性,與中國微生物菌種目錄給出的沙門菌生化反應(yīng)結(jié)果一致。本次試驗中共檢測樣品390份,分離鑒定后得到49株沙門菌,分離率為12.56%。
表2 生化反應(yīng)Table 2 Biochemical reaction
2.3 沙門菌藥敏試驗 結(jié)果顯示,49株沙門菌株對12種抗生素的耐藥率最高的集中在氟苯尼考,耐藥率為87.76%。對四環(huán)素(77.55%)、青霉素(73.47%)、慶大霉素(71.43%)耐藥率也較高。本試驗分離鑒定后得出49株沙門菌對抗生素耐藥情況見表3。
表3 藥敏試驗結(jié)果Table 3 Results of drug sensitivity test
對沙門菌進行多重耐藥性分析,49株沙門菌均對12種抗菌藥物有多重耐藥性,結(jié)果見表4。其中表現(xiàn)2種或2種以上藥物有多重耐藥性,4耐菌株所占比例最大,占28.57%,多重耐藥現(xiàn)象較為嚴重。分離株至少對2種藥物耐藥,并且表現(xiàn)為多重耐藥性,表明在沙門菌病治療時最好根據(jù)藥敏試驗結(jié)果,有針對性地科學(xué)用藥,實際生產(chǎn)中可選用氟苯尼考、四環(huán)素、青霉素、慶大霉素等敏感藥物。
表4 49株沙門菌的耐受抗生素種類分布Table 4 Distribution of resistant antibiotic species in 49 Salmonella strains
2.4 沙門菌分離株的血清學(xué)鑒定 49株沙門菌分離株經(jīng)血清學(xué)鑒定后,共鑒定出4種血清型,其中雞白痢沙門菌(1,9,12,-)為26株,占總沙門菌株的53.06%;其次,鼠傷寒沙門菌(1,4,5,12,i:1,2,)17株, 占總沙門菌株的34.69%;甲型副傷寒沙門菌(1,2,12,a:-)4株,占總沙門菌株的8.16%;曼哈頓沙門菌(6,8,d:1,5)2株,占總沙門菌株的4.08%。
2.5 耐藥基因的檢測 對49株沙門菌分離株的DNA進行PCR擴增,結(jié)果顯示,blaTEM耐藥基因檢出率最高,42株(占85.71%);其次為aadA1,32株(占65.31%);tetB,27株(占55.10%)。3種耐藥基因全部檢出的分離株為22株(占44.90%)。見圖1~3。
圖1 耐藥基因tetB PCR擴增結(jié)果Fig.1 PCR amplification results of drug resistance gene tetBM:DL-2 000分子標(biāo)記物; 1:陰性對照; 2、3、5、6:疑似沙門菌陽性樣品; 4:疑似沙門菌陰性樣品M:DL-2 000 molecular marker; 1:Negative control; 2,3,5,6:Suspected Salmonella positive samples; 4:Suspected Salmonella negative samples
圖2 耐藥基因blaTEM PCR擴增結(jié)果Fig.2 PCR amplification results of drug resistance gene blaTEMM:DL-2 000分子標(biāo)記物; 1:陰性對照; 2:疑似沙門菌陰性樣品; 3~6:疑似沙門菌陽性樣品M:DL-2 000 molecular marker; 1:Negative control; 2:Suspected Salmonella negative samples; 3-6:Suspected Salmonella positive samples
圖3 耐藥基因aadA1 PCR擴增結(jié)果Fig.3 PCR amplification results of drug resistance gene aadA1M:DL-2 000分子標(biāo)記物; 1:陰性對照; 2:疑似沙門菌陰性樣品; 3~6:疑似沙門菌陽性樣品M:DL-2 000 molecular marker; 1:Negative control; 2:Suspected Salmonella negative samples; 3-6:Suspected Salmonella positive samples
沙門菌感染是一種常見的人獸共患疾病,可造成嚴重的經(jīng)濟損失,深深困擾著莊河大骨雞的養(yǎng)殖戶們,面對沙門菌感染的嚴峻形勢,許多養(yǎng)殖戶選擇在養(yǎng)殖過程中大量使用抗生素,這使得沙門菌的耐藥譜型迅速增寬[8-9]。有報道稱,2018年華東地區(qū)共計分離出沙門菌71株,其中多重耐藥率高達93.94%[10]。遼寧地區(qū)養(yǎng)殖場沙門菌分離率為20.73%,其中41.98%的分離株為3類及3類以上耐藥菌株[11]。由此可見,禽源沙門菌耐藥性的問題日趨嚴峻。
本試驗對遼南地區(qū)莊河大骨雞養(yǎng)殖戶進行篩查,沙門菌分離率為12.56%,雞沙門菌分離株為49株,鑒定出4種血清型,依次為:雞白痢沙門菌,占53.06%;鼠傷寒沙門菌,占34.69%;甲型副傷寒沙門菌,占8.16%;曼哈頓沙門菌,占4.08%。耐藥性最高的3種抗生素依次為氟苯尼考、四環(huán)素、青霉素,耐藥率依次為87.76%、77.55%、73.47%。49株沙門菌對12種抗生素均有不同程度的耐藥性,且均為多重耐藥菌株。其中最少的耐藥2種,最多耐藥7種。表現(xiàn)2種或2種以上藥物有多重耐藥性,4耐菌株所占比例最大,占全部分離株的28.57%。耐藥結(jié)果一定程度上表明遼南地區(qū)莊河大骨雞沙門菌耐藥的嚴峻性。造成這方面原因可能是:養(yǎng)殖戶過度依賴抗生素,也可能是不同地區(qū)不同血清型的沙門菌對藥物的耐受程度有差異,或者抗生素的應(yīng)用劑量和方法的不科學(xué)[12-14]。在實際生產(chǎn)中對沙門菌病治療時最好根據(jù)藥敏試驗結(jié)果,有針對性地科學(xué)用藥,實際生產(chǎn)中可選用氟苯尼考、四環(huán)素、青霉素、慶大霉素等敏感藥物。對耐藥性較高的3種類型抗生素進行耐藥基因的檢測,blaTEM、aadA1、tetB三種耐藥基因的檢出率分別為85.71%、65.31%、55.10%。3種耐藥基因全部檢出的分離株為22株(占44.90%)??梢娔退幓虻臋z出率與耐藥情況關(guān)系密切,耐藥基因的攜帶與耐藥嚴重程度呈正相關(guān),同時考慮到食用雞肉抗生素的殘留禁用情況,此次篩選沒有選用氧氟沙星和恩諾沙星[15]。因此在莊河大骨雞的養(yǎng)殖過程中,首先要做好種源沙門菌的凈化,從源頭上切斷沙門菌的感染,同時應(yīng)及時有效的對發(fā)病雞群進行藥敏試驗,嚴格遵循藥物使用流程,以達到科學(xué)飼養(yǎng)的目的。