高一丁 ， 張偉偉 ， 鄧曉昆 ， 王 權(quán) ， 于詠蘭

(1. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 ， 北京 海淀 100193 ； 2. 北京聯(lián)寵國際檢測中心 ， 北京 海淀 100089)

銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa,P.aeruginosa)，又名綠膿桿菌，感染犬、貓時最常見的是引起耳道炎及表皮或深部的膿皮癥，也偶見尿路、呼吸道和血液感染等[1]。臨床治療P.aeruginosa感染難度較大，因其對多種臨床常用抗生素，如氨芐西林、阿莫西林、頭孢噻肟、頭孢曲松有天然耐藥性[2]。細(xì)菌對氟喹諾酮類藥物耐藥的機制主要為2種：作用靶點的突變與質(zhì)粒介導(dǎo)耐藥(Plasmid meditated quinolone resistance,PMQR)。作用靶點的突變被認(rèn)為是細(xì)菌對氟喹諾酮耐藥的主要機制，而質(zhì)粒介導(dǎo)耐藥目前被認(rèn)為常出現(xiàn)在腸桿菌科細(xì)菌中。氟喹諾酮類藥物作用于細(xì)菌的2種Ⅱ型拓?fù)洚悩?gòu)酶，分別由gyrA、gyrB基因和parC、parE基因調(diào)控。當(dāng)這些基因發(fā)生突變，導(dǎo)致氨基酸序列改變時，藥物與作用靶點結(jié)合的緊密性被破壞導(dǎo)致藥物失效[3]。來源于質(zhì)?？山閷?dǎo)氟喹諾酮耐藥的基因包括qnr基因家族，aac(6’)-Ib-cr基因、oqxAB基因和qepA基因，其介導(dǎo)氟喹諾酮耐藥的機制包括保護(hù)藥物作用位點、水解藥物和主動將藥物排出細(xì)菌體等[4]。

關(guān)于P.aeruginosa耐藥性的研究，目前國內(nèi)大多集中于經(jīng)濟(jì)動物和實驗動物，少有關(guān)于犬、貓源P.aeruginosa的相關(guān)研究。氟喹諾酮類藥物抗藥譜廣、吸收好、副作用低，被作為治療細(xì)菌感染的常用藥，并存在濫用現(xiàn)象。本試驗收集52株來源于犬、貓的P.aeruginosa，通過瓊脂稀釋試驗檢測其耐藥譜，通過PCR特異性擴(kuò)增探索其對氟喹諾酮類藥物的耐藥基因，為犬、貓P.aeruginosa感染后的科學(xué)防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株 本試驗檢測P.aeruginosa共52株，采集于2017年12月—2019年1月，其中20株為北京聯(lián)寵國際檢測中心分離保存，32株為本實驗室保存樣品。其中皮膚源菌株17株，耳道源菌株18株，呼吸道菌株17株。52株菌株中，33株來源于犬，19株來源于貓。

1.2 試劑和儀器 抗生素標(biāo)準(zhǔn)品，購自北京索萊寶科技有限公司、上海陶素生化科技有限公司和中國食品藥品檢定研究院；MH(A)瓊脂干粉，購自北京陸橋生物技術(shù)有限責(zé)任公司；質(zhì)粒提取試劑盒，購自天根生化科技(北京)有限公司；碳酸氫鈉、氫氧化鈉、二水磷酸二氫鈉、十二水磷酸氫二鈉，均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；PCR Mix、PCR Marker、核酸染料及TAE緩沖液等試劑，均購自北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司。試驗中使用的引物由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司合成。主要試驗儀器包括：海爾青島股份有限公司HR40-IIA2生物安全柜，MCO-18AC三洋二氧化碳培養(yǎng)箱，北京六一生物科技有限公司DYY-6D 型電泳儀和Vetri 96 梯度基因擴(kuò)增儀。

1.3 方法

1.3.1 菌株藥敏試驗 將保存好的菌株接種于血瓊脂平板上，在37 ℃條件下過夜復(fù)蘇獲得純化菌落。參考美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)-VET08標(biāo)準(zhǔn)所記錄的瓊脂稀釋法測定菌株對左氧氟沙星、馬波沙星、恩諾沙星、多西環(huán)素、慶大霉素、阿米卡星、頭孢吡肟、頭孢他啶、亞胺培南、美羅培南的最小抑菌濃度(Minimum inhibitory concentration,MIC)。試驗中各藥物所需溶劑與助溶劑參考CLSI-VET08與2018版CLSI標(biāo)準(zhǔn)所述。

1.3.2 菌株氟喹諾酮耐藥機制分析 使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取所有菌株的基因組DNA作為Ⅱ型拓?fù)洚悩?gòu)酶基因模板，并擴(kuò)增目標(biāo)序列。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，共35個循環(huán)；72 ℃再延伸8 min。PCR擴(kuò)增體系：模板4 μL，TaqMix 25 μL，ddH2O 17 μL，上下游引物各2 μL。各目標(biāo)序列所用引物參照參考文獻(xiàn)[3]進(jìn)行設(shè)計，見表1。使用質(zhì)粒提取試劑盒提取所有菌株的質(zhì)粒DNA作為PMQR基因模板，并擴(kuò)增目標(biāo)序列。擴(kuò)增條件：94 ℃ 預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，共35個循環(huán)；72 ℃再延伸8 min。PCR體系:模板4 μL、TaqMix 25 μL、ddH2O 17 μL、上下游引物各2 μL。各目標(biāo)序列所用引物參考文獻(xiàn)[5]，見表1。配制2%瓊脂糖凝膠，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳鑒定，并將陽性產(chǎn)物送至測序公司測序，將所得序列與標(biāo)準(zhǔn)序列比對鑒定。

表1 各目標(biāo)序列擴(kuò)增引物Table 1 Amplifyication primers of each target sequences

2 結(jié)果

2.1 菌株藥敏試驗 藥物瓊脂平板上的P.aeruginosa以單菌落的形式生長，在低濃度藥物瓊脂平板上可見黃綠色或綠色色素擴(kuò)散，質(zhì)控菌對所有藥物的MIC均在規(guī)定范圍內(nèi)，試驗菌株對各抗生素的敏感率見表2。

表2 犬、貓銅綠假單胞菌藥敏試驗結(jié)果Table 2 Drug sensitivity test results of Pseudomonas aeruginosa in dogs and cats

2.2 菌株氟喹諾酮類藥物耐藥機制分析 52株P(guān).aeruginosa中，均未檢測出qnrA、qnrB、qnrS、qepA基因和oqxAB基因，共有19株菌株檢測出aac(6’)-Ib基因，經(jīng)與標(biāo)準(zhǔn)序列比對后，19條序列均為單一功能的氨基糖苷?；D(zhuǎn)移酶，無介導(dǎo)氟喹諾酮耐藥功能。經(jīng)PCR特異性擴(kuò)增后，52株菌株均擴(kuò)增出了gyrA、gyrB、parC、parE基因序列，見表2。經(jīng)與標(biāo)準(zhǔn)序列比對后發(fā)現(xiàn)，共9株菌株發(fā)生了GyrA氨基酸的替代；3株發(fā)生了ParC氨基酸的替代；5株發(fā)生了ParE氨基酸的替代；無菌株發(fā)生GyrB氨基酸的替代，見表3。采用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，使用偏相關(guān)分析對GyrA、ParC、ParE氨基酸替換與氟喹諾酮類藥物耐藥結(jié)果進(jìn)行差異顯著性檢驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)本試驗中，GyrA氨基酸替換(r=0.392，P=0.004)、ParC氨基酸替換(r=0.326，P=0.018)、ParE氨基酸替換(r=0.294，P=0.034)均與氟喹諾酮類藥物耐藥性呈低度相關(guān)。GyrA、GyrB、ParC、ParE 氨基酸替代與恩諾沙星、馬波沙星、左氧氟沙星的 MIC的關(guān)系見表4。

表3 Ⅱ型拓?fù)洚悩?gòu)酶的氨基酸替代結(jié)果Table 3 The amino acids alternation in type Ⅱ topoisomerase

表4 氨基酸替換與氟喹諾酮類藥物最小抑菌濃度之間的關(guān)系Table 4 The relationship between amino acid alternation and fluoroquinolones MIC

3 討論

本次藥敏試驗結(jié)果表明，所有菌株對頭孢他啶與頭孢吡肟最敏感，2種藥物均只有1株菌株對其耐藥，這與文獻(xiàn)報道的世界范圍內(nèi)P.aeruginosa感染治療中，頭孢他啶與頭孢吡肟均為對抗P.aeruginosa感染的首選用藥[6]是吻合的。頭孢吡肟是第4代頭孢菌素類的代表藥物，頭孢他啶是第3代半合成藥物，對多重耐藥革蘭陰性桿菌具有良好的療效，建議選用頭孢他啶與頭孢吡肟作為P.aeruginosa感染時的首選用藥。本試驗中各菌株對氟喹諾酮類藥物耐藥率較高，分別為恩諾沙星19.2%、馬波沙星30.8%和左氧氟沙星15.4%，這一結(jié)果與Rubin等[7]在2008年發(fā)現(xiàn)的該菌對恩諾沙星耐藥率31%、馬波沙星27%、左氧氟沙星16%接近。

氟喹諾酮類藥物具有抗菌譜廣、副作用小、易吸收等優(yōu)點，其代表藥物恩諾沙星(商品名拜有利)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于犬、貓臨床。在獲得藥敏檢查結(jié)果之前，為了避免可能存在的多重耐藥導(dǎo)致前期治療失敗，推薦選用氟喹諾酮類藥物與β內(nèi)酰胺類藥物聯(lián)合用藥作為治療方案。

碳青霉烯類藥物被認(rèn)為是治療革蘭陰性桿菌感染的最后一道防線，細(xì)菌對其耐藥性的變化是耐藥監(jiān)測工作的重點。本次試驗中，亞胺培南的耐藥率為46.2%，2017年楊桐等[8]對全國范圍內(nèi)動物醫(yī)院分離的細(xì)菌的耐藥研究顯示，P.aeruginosa對亞胺培南的耐藥率為23.6%，遠(yuǎn)低于本次試驗的結(jié)果。這可能與部分獸醫(yī)盲目選擇其作為首選藥物有關(guān)?？紤]到公共健康安全，建議加以密切關(guān)注。

Lin等[9]在2012年進(jìn)行的試驗中，P.aeruginosa對阿米卡星的耐藥率為11.1%，慶大霉素的耐藥率為14.8%，亞胺培南的耐藥率為0，與本試驗結(jié)果差距較大。但其阿米卡星和慶大霉素的MIC50分別為<4 μg/mL和4 μg/mL，MIC90分別為8 μg/mL和>128 μg/mL，慶大霉素的MIC90遠(yuǎn)高于折點值，說明慶大霉素可能不適用于P.aeruginosa的治療。Lin等[9]試驗中亞胺培南的MIC90為4 μg/mL，本試驗中亞胺培南的MIC90為8 μg/mL，位于藥物敏感范圍內(nèi)，可用于臨床治療。2008年Rubin等[7]的試驗中阿米卡星和慶大霉素的耐藥率為3%和7%，MIC50與MIC90均小于折點值，這種差異可能是由于樣本來源的區(qū)域和時間不同，以及個體宿主差異所造成。

目前各種針對動物源的藥敏試驗中使用的耐藥折點版本混亂，主要有CLSI獸醫(yī)標(biāo)準(zhǔn)、CLSI人類臨床標(biāo)準(zhǔn)和EUCAST歐洲臨床標(biāo)準(zhǔn)3種，受藥物動力學(xué)和藥效學(xué)影響，各參考標(biāo)準(zhǔn)中不同菌株對不同物種的耐藥折點均有差異，人類臨床醫(yī)學(xué)與獸醫(yī)臨床所使用的參考標(biāo)準(zhǔn)中的折點也有所不同，折點的改變可能導(dǎo)致藥敏試驗結(jié)果出現(xiàn)很大差異，所以對于獸醫(yī)中未給出明確折點的藥物，評估其抗菌能力應(yīng)以臨床治療效果為主。

本次試驗中未檢測到任何PMQR基因，這也與目前已發(fā)表的一些結(jié)果相一致。目前研究認(rèn)為，PMQR基因主要的攜帶者是腸桿菌科。然而隨著時間發(fā)展，目前有少量研究報道了在假單胞菌屬細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)PMQR基因。2015年胡凡[10]從51株豬源和雞源P.aeruginosa中分離到了7例aac(6’)-Ib-cr基因、5例qnrS基因以及3例qnrB基因。2018年Vingopoulou等[11]從78株犬中耳炎病例中采集到的P.aeruginosa中分離到了2例qnrA，2例qnrS和1例qnrB基因。

P.aeruginosa主要的GyrA與ParC替換位點與腸桿菌科相似，1999年Akasaka等[3]檢測了150株耐左氧氟沙星P.aeruginosa的Ⅱ型拓?fù)洚悩?gòu)酶突變情況，其中119株出現(xiàn)了GyrA的氨基酸替換，主要替換模式是第83位的Thr替換為Ile或Ala，第87位的Asp替換為Asn、Gly、Tyr；第27株出現(xiàn)GyrB的氨基酸替換，主要替換模式是第470位的Glu替換為Asp；第84株出現(xiàn)ParC的氨基酸替換，主要替換模式為第87位的Ser替換為Leu或Trp；13株出現(xiàn)ParE的氨基酸替換，其中包括第473位的Ala替換為Val和第459位的Glu替換為Val。本次試驗中發(fā)現(xiàn)的各種氨基酸替換與該試驗結(jié)果[3]部分一致。Vingopoulou等[11]和Thirumalmuthu等[12]分別從中耳炎和角膜炎樣本中分離到的P.aeruginosa都發(fā)現(xiàn)了以GyrA中第83位由Thr替換為Ile，和ParC中第87位由Ser替換為Leu為主的氨基酸突變模式，Thirumalmuthu等[12]還發(fā)現(xiàn)了1例ParC中第752位氨基酸由Pro替換為Thr。

Akasaka等[3]證明，GyrB和ParE單獨發(fā)生替換時，不會對菌株耐藥性產(chǎn)生顯著增強，而GyrA單獨替換會顯著增高菌株耐藥性，當(dāng)GyrA發(fā)生2處替換時菌株耐藥性會更強，而當(dāng)ParC與GyrA同時發(fā)生替換時，會使這個效應(yīng)進(jìn)一步增強。在本試驗中(表4)，有3株菌株出現(xiàn)了GyrA替換表現(xiàn)了氟喹諾酮類的耐藥，但仍有2株菌株出現(xiàn)了GryA的替換仍對藥物敏感。受限于樣本數(shù)量，本試驗各菌株中GyrA均只出現(xiàn)1處替換，2株菌株同時出現(xiàn)了GyrA和ParC的替換但對藥物的耐藥性并無進(jìn)一步提升；本次試驗中1株菌株單獨發(fā)生了ParC的替換后對3種氟喹諾酮類藥物的耐藥性出現(xiàn)超常地提高，超過了ParC和GyrA雙替換的2株菌株；有2株菌株單獨發(fā)生了ParE的突變，對氟喹諾酮的MIC都超過了耐藥折點?？傊?，由于Ⅱ型拓?fù)洚悩?gòu)酶基因突變致氨基酸替換進(jìn)而導(dǎo)致P.aeruginosa耐藥性改變是相當(dāng)復(fù)雜的事件，需要積累更多的試驗數(shù)據(jù)才能找到其規(guī)律。另外，本次試驗中有9株未發(fā)生任何氨基酸突變的菌株也對所有氟喹諾酮類藥物耐藥，這說明試驗菌株可能存在其他耐藥機制的作用，如生物膜、主動外排系統(tǒng)、孔蛋白缺失等，需要進(jìn)一步地研究來證實。

P.aeruginosa感染是犬、貓臨床常見的傳染性疾病，本研究犬、貓P.aeruginosa對抗生素藥物耐藥性的檢測和氟喹諾酮類藥物耐藥機制的分析為臨床犬、貓P.aeruginosa感染的防治提供了參考。