高俊鳳，劉曼曼，郭召平，胡春平，馮珍鳳，嚴 軍

1上海中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，上海 201203；2上海中醫(yī)藥大學(xué)聯(lián)合培養(yǎng)單位//上海市嘉定區(qū)中醫(yī)醫(yī)院內(nèi)分泌科，上海 201899

2型糖尿病（T2DM）以糖脂代謝紊亂為主要表現(xiàn)，胰島素抵抗是T2DM 發(fā)病的關(guān)鍵因素，肝臟在全身代謝調(diào)節(jié)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，肝臟胰島素抵抗導(dǎo)致的代謝紊亂是影響機體葡萄糖和脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵［1-2］。Fetuin B是近年來新發(fā)現(xiàn)的半胱氨酸蛋白酶抑制劑超家族成員之一，是一種新型的肝臟分泌蛋白，由肝臟產(chǎn)生分泌入血［3］。研究表明，F(xiàn)etuin B增多會引起糖代謝和脂代謝異常，而且Fetuin B在體內(nèi)長期積累會增加胰島素抵抗的風(fēng)險，但其在代謝中的具體作用機制尚不明確［4-5］。腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）即絲氨酸/蘇氨酸激酶AMP依賴的蛋白激酶，是一種重要的能量感應(yīng)酶，是調(diào)節(jié)機體能量代謝的總開關(guān)。乙酰輔酶A羧化酶（ACC）是一種依賴生物素的變構(gòu)羧化酶，是AMPK的下游分子，AMPK/ACC通路抑制可加重胰島素抵抗，從而加劇葡萄糖和脂質(zhì)代謝紊亂。最新的一項研究表明，F(xiàn)etuin B抑制胰島素信號傳導(dǎo)，加重心肌缺血再灌注損傷，而大量研究表明，在嚙齒動物中，心肌缺血再灌注損傷可通過激活A(yù)MPK/ACC通路改善心肌胰島素抵抗，起到保護心臟的作用［6-10］。那么在肝臟中，F(xiàn)etuin B是否會抑制AMPK/ACC通路加重胰島素抵抗？

葛根具有調(diào)節(jié)免疫、降血糖、降血脂、抗氧化等藥理作用，屬于在臨床上運用廣泛且治療效果頗佳的中藥。葛根素可以通過激活A(yù)MPK相關(guān)通路改善胰島素抵抗，調(diào)節(jié)糖脂代謝［11-13］。那么葛根素是否通過抑制AMPK/ACC信號通路上游Fetuin B激活此通路發(fā)揮作用？故本研究擬通過T2DM小鼠模型，探討葛根素調(diào)控肝臟Fetuin B-AMPK/ACC信號通路改善胰島素抵抗作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

4～5周齡SPF級健康雄性C57BL/6J小鼠50只，體質(zhì)量13～17 g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：北京百善SCXK（京）2016-0006。動物飼養(yǎng)場所是北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司上海分公司，實驗動物使用許可證號：SYXK（滬）2017-0014。動物飼養(yǎng)在SPF級屏障環(huán)境中的實驗動物設(shè)施IVC系統(tǒng)，動物房溫度22±5 ℃，相對濕度（50±10）%，明暗周期12 h/12 h（光照時間8∶00～20∶00），鼠籠每日清潔消毒，所有小鼠自由飲水，自由飲食。本實驗經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)倫理會委員會批準。

1.2 試劑

高脂飼料[60%Kcal High-Fat（DIO）Diet，美 國RDI]；葛根素（Sigma)。鏈脲佐菌素（STZ,Sigma）；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na，上海源葉生物）；小鼠胰島素ELISA試劑盒、小鼠甘油三酯（TG）ELISA 試劑盒、小鼠膽固醇（TC）ELISA 試劑盒、小鼠游離脂肪酸（FFA）ELISA 試劑盒（武漢華美生物）；RIPA 裂解液、ECL發(fā)光劑（上海碧云天）；BCA 試劑盒[生工生物工程（上海）]；AMPKα1、P-AMPKαT183/T172、ACC、P-ACCS79 Antibody（Abcam）、內(nèi)參抗體GAPDH，英國abcam，生工生物工程（上海））；Fetuin B Antibody（成都正能生物）；HiScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit（南京諾唯贊生物）。

1.3 儀器

羅氏血糖儀及試紙[羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司]；高速恒溫冷凍離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）；微量移液器（日本NICHIRYO）；SLAN-96P 全自動醫(yī)用PCR分析系統(tǒng)（上海宏石醫(yī)療）；酶標儀（Bio Tek）；GENE GNOME SYNGENE BIO IMAGING（Bio Tek）；顯微鏡XD-202（南京江南永新光學(xué)）。

1.4 方法

1.4.1 模型制備 4～5周齡小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機選擇40 只小鼠進行造模，10 只小鼠作為正常對照組（ND）。ND組給予基礎(chǔ)飼料，造模組給予高脂飼料6周后，禁食12 h，腹腔注射STZ（100 mg/kg），注射后繼續(xù)喂養(yǎng)高脂飼料4周，剪尾采血，以連續(xù)2 d空腹血糖≥13.9 mmol/L為糖尿病模型成功［14］。

1.4.2 分組與給藥 按照標準，造模成功的小鼠共32只，采用隨機數(shù)字表法將32 只小鼠分為高脂飼料喂養(yǎng)的模型對照組（HFD），葛根素低劑量組（Pue-50組，50 mg/kg），葛根素中劑量組（Pue-100組，100 mg/kg），葛根素高劑量組（Pue-200組，200 mg/kg），8只/組，高脂飼料喂養(yǎng)持續(xù)至實驗終點。分組后開始1次/d定時給藥，ND組和HFD組給予等體積的生理鹽水灌胃，0.5%CMC-Na溶解葛根素，制備成葛根素混懸液［15-17］，灌胃給藥，干預(yù)時間為8周。

1.4.3 小鼠一般情況監(jiān)測 在實驗過程中，每天觀察并記錄小鼠的毛色、飲食、飲水及二便情況、精神狀態(tài)，直至給藥結(jié)束。

1.4.4 取材 給藥結(jié)束后，各組小鼠隔夜禁食8 h，10%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，眼球取血，室溫靜置30 min，以3000 r/min離心10 min，分離血清，保存在-20 ℃冰箱中以備后續(xù)實驗檢測。小鼠仰臥位固定于操作臺上皮膚消毒后，打開腹腔，快速分離肝臟，用生理鹽水洗滌，取部分于4%多聚甲醛固定，部分置于凍存管液氮速凍，最后腹腔注射過量10%戊巴比妥鈉麻醉，10 min后檢查小鼠生命體征，確保小鼠被處死。

1.4.5 指標檢測

1.4.5.1 血糖檢測 造模10周后連續(xù)2 d禁食8 h尾靜脈取血檢測空腹血糖（FBG），給藥4周和8周分別以尾靜脈剪尾取血檢測FBG。

1.4.5.2 小鼠血清空腹胰島素測定 以小鼠胰島素ELISA試劑盒測定小鼠血清胰島素濃度（FINS），根據(jù)公式計算胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）：HOMA-IR=（FBG×FINS）/22.5［18］。

1.4.5.3 小鼠肝臟TG、TC、FFA測定 取出肝組織，用無水乙醇制備成10%肝組織勻漿，離心，取上清。采用ELISA試劑盒測定小鼠肝臟勻漿上清液TG、TC、FFA的含量。

1.4.5.4 小鼠肝臟HE染色 經(jīng)4%多聚甲醛固定肝臟組織梯度脫水，石蠟包埋，切片（5 μm橫截面），HE染色，中性樹膠封片，并在顯微鏡下觀察肝臟的組織學(xué)變化，并進行圖像采集。

1.4.5.5 小鼠肝臟Fetuin B免疫組化 取適量固定于4%多聚甲醛肝臟組織，石蠟包埋切片，用二甲苯脫臘，0.5 mol/L檸檬酸緩沖溶液抗原修復(fù)，3%過氧化氫溶液阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，滴加一抗（Fetuin B 1∶100），4 ℃下孵育過夜，37 ℃復(fù)溫60 min，滴加二抗，37 ℃30 min，加DBA顯色，顯微鏡下觀察，采集圖像。結(jié)果判定：細胞質(zhì)或細胞核呈棕黃色顆粒者為Fetuin B陽性產(chǎn)物。在200倍視野范圍隨機選擇5個視野，輸入IPP6.0圖像分析軟件測定肝細胞中棕黃色顆粒的平均光密度值，值越大反映Fetuin B表達水平越高。

1.4.5.6 Q-RT-PCR 法檢測小鼠肝臟Fetuin B-AMPK/ACC通路mRNA表達 取小鼠肝臟組織100 mg，加入液氮研磨后備用。使用Trizol試劑提取小鼠肝臟組織總RNA，按照HiScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit說明書操作，去除基因組的DNA，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA，進行實時熒光定量PCR，配制PCR反應(yīng)體系，每個基因做3個復(fù)孔和1個陰性對照，在PCR分析儀上進行DNA擴增，擴增反應(yīng)條件為變性95 ℃30 s，退火58 ℃30 s，延伸72 ℃30 s 30個循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參基因，校正目標基因的熒光強度。所有引物由上海東寰生物科技有限公司設(shè)計合成（表1）。

表1 Q-RT-PCR引物序列Tab.1 Q-RT-PCR primer sequences

1.4.5.7 Western blot法檢測小鼠肝臟Fetuin B-AMPK/ACC通路蛋白表達 取小鼠肝臟組織100 mg，液氮研磨后加入含有97%RIPA+1%PMSF+1%蛋白酶抑制劑+1%磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液及相關(guān)抑制劑中，勻漿液離心，4 ℃，12 000 r/min，3 min，取上清。按照BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒完成蛋白定量；制備聚丙烯酰胺凝膠，并進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，37 ℃下在封閉液中封閉PVDF膜1 h，洗膜，將膜放在一抗稀釋液中（按說明書稀釋），4 ℃冰箱孵育過夜。次日用TBST洗膜3次，15 min/次。將洗好的膜放入稀釋好的二抗中（按說明書稀釋），室溫孵育1 h，用TBST洗膜3次，15 min/次。顯影：ECL發(fā)光試劑盒顯影，用GENE GNOME 系統(tǒng)曝光顯像，導(dǎo)出圖片，用ImageJ軟件對條帶進行灰度值分析，以GAPDH為內(nèi)參蛋白，校正目的蛋白灰度值。

1.5 統(tǒng)計分析

采用SPSS24.0軟件對數(shù)據(jù)進行處理，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差表示，滿足正態(tài)性、方差齊性的計量資料采用獨立樣本t檢驗或單因素方差分析，多個樣本均數(shù)間的多重比較用LSD檢驗；滿足正態(tài)性，不滿足方差齊性時，多個樣本均數(shù)間的多重比較用Dunnett's T3檢驗。不滿足正態(tài)性、方差齊性的計量資料用非參數(shù)的秩和檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。所有實驗都是獨立重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 葛根素對T2DM小鼠FBG和胰島素抵抗的影響

造模10周1 d、2 d HFD組與ND組相比，F(xiàn)BG升高（P<0.01）。不同劑量葛根素給藥后，與HFD組相比，Pue-50 mg/kg給藥組FBG有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義；Pue-100 mg/kg和Pue-200 mg/kg給藥組小鼠FBG均明顯下降（P<0.01）。Pue-50 mg/kg、Pue-100 mg/kg 和Pue-200 mg/kg給藥組較HFD組，F(xiàn)INS、HOMA-IR均顯著降低（P<0.01，表2）。

表2 葛根素對小鼠FBG和胰島素抵抗的影響Tab.2 Effects of puerarin on FBG and insulin resistance in T2DM mice(Mean±SD)

2.2 葛根素對T2DM小鼠肝臟TG、TC、FFA的影響

與ND組相比，HFD組小鼠肝臟TG、TC、FFA含量增多（P<0.01）。與HFD組相比，Pue-100 mg/kg和Pue-200 mg/kg 給藥組小鼠肝臟TG、TC、FFA 含量均下降（P<0.01）。Pue-50 mg/kg給藥組與HFD組相比有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（表3）。

表3 葛根素對T2DM小鼠肝臟TG、TC、FFA的影響Tab.3 Effects of puerarin on hepatic TG,TC and FFAin T2DM mice(Mean±SD)

2.3 葛根素對T2DM小鼠肝臟組織病理變化的影響

ND組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)完整，肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細胞排列整齊呈現(xiàn)肝索狀，且大小均勻，核圓居中，胞漿內(nèi)無空泡，肝細胞無脂肪變性；HFD組小鼠肝小葉內(nèi)肝索結(jié)構(gòu)紊亂，肝細胞形態(tài)異常，肝小葉邊界模糊，胞漿內(nèi)出現(xiàn)空泡，肝細胞腫脹伴有嚴重脂肪變性；Pue-50 mg/kg給藥組小鼠肝脂肪變性較HFD組有一定程度的減輕，但肝細胞排列欠規(guī)整，肝索結(jié)構(gòu)仍顯紊亂，肝細胞內(nèi)稍有水腫伴有輕度肝脂肪變性，胞漿內(nèi)有少量脂肪樣空泡；Pue-100 mg/kg和Pue-200 mg/kg給藥組小鼠肝細胞呈索狀排列，較為整齊，肝細胞無明顯水腫，胞漿內(nèi)可見少許的脂肪空泡，與HFD組相比，肝脂肪變性程度明顯改善（圖1）。

圖1 葛根素對T2DM小鼠肝臟病理變化的影響Fig.1 Effects of puerarin on liver pathology in T2DM mice(HE staining,original magnification:×200).A:ND group;B:HFD group;C:Pue-50 mg/kg;D:Pue-100 mg/kg;E:Pue-200 mg/kg.

2.4 葛根素對T2DM小鼠肝臟Fetuin B免疫組化的影響

ND組小鼠肝細胞質(zhì)內(nèi)見少量棕黃色顆粒，肝細胞Fetuin B表達正常，未見明顯病理變化；HFD組見大量棕黃色顆粒，肝細胞Fetuin B表達增加，免疫組化染色較ND組非常明顯；Pue-50 mg/kg 和Pue-100 mg/kg給藥組棕黃色顆粒較HFD組減少，F(xiàn)etuin B表達有所降低，免疫組化染色較HFD組有所減輕；Pue-200 mg/kg給藥組棕黃色顆粒較HFD組明顯減少，F(xiàn)etuin B表達明顯降低，免疫組化染色較HFD組明顯減輕（圖2，表4）。

表4 葛根素對T2DM小鼠肝臟Fetuin B含量的影響Tab.4 Effect of puerarin on hepatic fetuin B content in T2DM mice(Mean±SD)

2.5 葛根素對T2DM小鼠肝臟Fetuin B-AMPK/ACC通路mRNA表達的影響

與ND組相比，HFD組Fetuin B、ACC mRNA表達升高，AMPKmRNA表達降低（P<0.01）。與HFD組相比，經(jīng)過8周藥物干預(yù)，給藥組肝臟Fetuin B mRNA表達均有所降低（P<0.01）；Pue-100 mg/kg 和Pue-200 mg/kg給藥組肝臟AMPK mRNA 表達升高（P<0.01）；Pue-100 mg/kg 和Pue-200 mg/kg 給藥組肝臟ACC mRNA表達明顯降低（P<0.01）；Pue-50 mg/kg給藥組有上調(diào)AMPK mRNA表達，下調(diào)ACC mRNA表達的趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖3）。

2.6 葛根素對T2DM小鼠肝臟Fetuin B-AMPK/ACC通路蛋白表達的影響

與ND 組相比，HFD組Fetuin B、ACC蛋白表達升高（P<0.01），AMPKα1、P-AMPKα T183/T172、P-ACC S79蛋白表達均降低（P<0.01）。治療后，與HFD組相比，葛根素呈劑量依賴性降低Fetuin B、ACC蛋白表達（P<0.01），呈劑量依賴性升高AMPKα1、P-AMPKαT1183/T172、P-ACC S79蛋白表達（P<0.01，圖4）。

圖4 葛根素對T2DM小鼠肝臟Fetuin B-AMPK/ACC通路蛋白表達的影響Fig.4 Effects of puerarin on the protein expression of fetuin B-AMPK/ACC pathway in the liver of T2DM mice.ND:Normal control group;HFD:Model control group;**P<0.01 vs ND;##P<0.01 vs HFD.

3 討論

本研究證實葛根素下調(diào)肝臟Fetuin B水平，從而激活A(yù)MPK/ACC通路，促進AMPK磷酸化，抑制ACC活性，改善T2DM小鼠肝臟胰島素抵抗。葛根素改善胰島素抵抗的重要機制之一為上調(diào)AMPK，但相關(guān)分子機制尚不明確［19-20］。已有研究表明AMPK作為調(diào)節(jié)糖脂代謝的關(guān)鍵酶，參與葡萄糖、脂肪酸的合成和氧化分解，在正常生理狀態(tài)下，AMP/ATP比率上升時，AMPK被激活，抑制消耗能量的生物合成途徑（肝臟脂肪酸、膽固醇合成以及β細胞的胰島素分泌），激活產(chǎn)生ATP的分解代謝途徑（多種組織的脂肪酸攝取和氧化，糖酵解），調(diào)節(jié)細胞能量代謝平衡［21-22］。在高血糖、高血脂的病理環(huán)境下，AMPK下調(diào)導(dǎo)致正常生理調(diào)節(jié)機制發(fā)生紊亂，信號通路相關(guān)蛋白調(diào)控發(fā)生改變，反而激活下游靶點ACC的活性，抑制脂肪酸氧化，刺激脂質(zhì)沉積，降低胰島素敏感性，加劇胰島素抵抗，進而加重T2DM的進展［23-25］。本研究T2DM小鼠中，葛根素在mRNA水平上調(diào)AMPK，提示AMPK mRNA轉(zhuǎn)錄增多、降解減少，相關(guān)調(diào)控可能發(fā)生在轉(zhuǎn)錄前，如激活上游某種相關(guān)調(diào)控因子?有研究發(fā)現(xiàn)高脂誘導(dǎo)肥胖小鼠模型和HepG2肝脂肪變性細胞模型中Fetuin B表達上調(diào)，AMPK下調(diào)，而沉默肥胖模型小鼠和HepG2細胞模型Fetuin B基因后，AMPK磷酸化增強，肝臟脂肪變性減輕［26］。提示Fetuin B可能是AMPK的上游負調(diào)控因子。而本研究中，T2DM小鼠模型給予葛根素干預(yù)后，肝臟Fetuin B、ACC在mRNA和蛋白水平均顯著降低，AMPK則明顯升高，證實了葛根素下調(diào)Fetuin B水平，激活A(yù)MPK/ACC信號通路。那么Fetuin B調(diào)控AMPK/ACC通路是否在胰島素抵抗中發(fā)揮作用？

Fetuin B是一種影響糖脂代謝的重要新型肝臟細胞因子，基因位于鼠16號染色體，人3號染色體，而該位點是糖尿病等代謝疾病的遺傳基因易感位點［27-30］。有研究發(fā)現(xiàn)高脂飲食誘導(dǎo)小鼠肝原代細胞胰島素敏感性受損，是由脂肪變性改變肝細胞的蛋白分泌，F(xiàn)etuin B分泌異常增多所致［31］。最新的一項研究中，T2DM小鼠敲除Fetuin B基因后，心臟Fetuin B水平降低，胰島素受體底物1（IRS-1）、絲氨酸位點磷酸化增強，膜表面葡萄糖轉(zhuǎn)運體-4（Glut4）數(shù)量增加，心肌組織胰島素信號傳導(dǎo)改善［6］。故認為Fetuin B是T2DM胰島素抵抗中的關(guān)鍵因子。本實驗中，T2DM小鼠較ND組肝臟Fetuin B含量增加，F(xiàn)BG、FINS、HOMA-IR均明顯升高證實了以上推測。這亦與基于T2DM伴胰島素抵抗人群的一項研究中Fetuin B水平顯著升高的結(jié)果一致［32］。同時T2DM小鼠給予葛根素干預(yù)，隨著濃度增加，肝臟TG、TC、FFA水平降低，肝臟HE染色提示肝脂肪變性明顯減輕，血清FBG、FINS及HOMA-IR降低，胰島素抵抗明顯改善，糖脂代謝紊亂糾正。進一步行免疫組化及Western Blot檢測肝臟Fetuin B表達均明顯下降，Q-RT-PCR檢測肝臟AMPK mRNA水平顯著上調(diào)，ACC mRNA水平顯著下降；Western Blot檢測AMPK、P-AMPK、P-ACC均明顯升高，ACC 明顯下調(diào)，提示葛根素通過下調(diào)肝臟Fetuin B水平，激活A(yù)MPK/ACC信號通路，刺激AMPK活化，抑制ACC活性，加快脂肪酸氧化和糖酵解。既往研究報道了葛根素廣泛的藥理特性，減弱胰島素抵抗是其中之一，而對其改善T2DM 胰島素抵抗的分子機制報道較少［33］。本實驗在此基礎(chǔ)之上，進一步證實葛根素改善T2DM胰島素抵抗的分子機制之一可能是通過肝臟Fetuin B-AMPK/ACC信號通路，豐富了葛根素在調(diào)控胰島素抵抗中的作用。

綜上所述，F(xiàn)etuin B-AMPK/ACC通路與T2DM小鼠胰島素抵抗相關(guān)，葛根素能夠通過下調(diào)肝臟細胞因子Fetuin B干預(yù)AMPK/ACC通路的相關(guān)蛋白調(diào)控，增強AMPK磷酸化，增加P-ACC蛋白表達，降低ACC活性，從而改善胰島素抵抗，調(diào)節(jié)糖脂代謝，延緩T2DM 進程。本實驗初步闡明了葛根素介導(dǎo)Fetuin B-AMPK/ACC信號通路對T2DM胰島素抵抗的調(diào)控機制，但由于時間限制，僅進行了表型研究，下一步研究將結(jié)合體外細胞轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)基因小鼠等進一步驗證。此外，F(xiàn)etuin B是否可以調(diào)控其他糖脂代謝相關(guān)通路有待進一步探索。