趙茴茴，古文清，潘文斌，張漢彬，帥 領(lǐng)，刁瑞英，汪麗萍，

1南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東 廣州 510515；2中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院，廣東 廣州 510515；3南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510515；4深圳市第二人民醫(yī)院，廣東 深圳 518035

早發(fā)性卵巢功能不全（POI）是導(dǎo)致女性不孕的主要原因之一。其診斷標(biāo)準(zhǔn)是：≤40歲，閉經(jīng)（原發(fā)性或繼發(fā)性）至少4月，卵泡刺激素（FSH）水平兩次（相隔1個月以上）升高>25 U/L［1］。據(jù)統(tǒng)計，POI患者40歲前的發(fā)病率約1%，30歲前的發(fā)病率約0.1%，20歲前的發(fā)病率約0.01%［2］。POI的病因復(fù)雜，90%的POI是由遺傳、酶、自身免疫、感染或醫(yī)源性因素（如化療）導(dǎo)致，也可能是多因素共同作用的結(jié)果［3］。順鉑是一種常用化療藥物，用于治療多種類型的腫瘤，包括膀胱癌、頭頸部癌、肺癌、卵巢癌和睪丸癌等［4］。然而，化療的應(yīng)用提高了年輕癌癥患者的長期存活率，但患者POI的發(fā)病率亦隨之增加［5］。雖然針對順鉑引起的POI，國內(nèi)外學(xué)者開展了一系列研究［5-7］，但是，順鉑誘導(dǎo)卵巢損傷的機(jī)制尚不明確且缺乏有效的預(yù)測及治療手段。因此，研究順鉑損傷機(jī)制及診斷順鉑化療中卵巢損傷的程度顯得尤為重要。

FK506結(jié)合蛋白4（FKBP4，又稱FKBP52）是免疫親和素家族FK506結(jié)合蛋白的成員。它是類固醇激素核受體的分子伴侶，參與調(diào)節(jié)靶組織的內(nèi)分泌功能［8］。FKBP4的主要作用是調(diào)節(jié)類固醇激素受體的結(jié)合和轉(zhuǎn)運(yùn)，也與各種類型的癌癥、某些生殖及神經(jīng)疾病有關(guān)［9］。最新的研究指出，F(xiàn)KBP4的缺乏可以導(dǎo)致妊娠階段子宮對黃體酮的抵抗，增加流產(chǎn)的風(fēng)險［10-11］。但是，F(xiàn)KBP4在卵巢中的作用機(jī)制與功能未見報道。

MicroRNAs（miRNAs）是一類內(nèi)源性的非編碼RNA（ncRNAs）。成熟的miRNA與靶基因mRNAs的3'非翻譯區(qū)（3'UTRs）結(jié)合，可以介導(dǎo)基因翻譯后沉默。目前大量研究表明，microRNAs（miRNAs）具有調(diào)節(jié)POI發(fā)展進(jìn)程的作用［12-13］。研究表明，miR-483-5p可能通過一種新的線粒體分裂通路增加舌鱗狀細(xì)胞癌（TSCC）細(xì)胞對順鉑的敏感性［14］。然而，miR-483-5p對于順鉑誘導(dǎo)的卵巢功能損傷亟待闡明。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

TRIzolLS試劑（Invitrogen），脂質(zhì)體lipofectamine 3000（1∶130000，Invitrogen），The Realstar power SYBR kit（GeneStar），miR-483-5p mimics、miR-483-5p hairpinit real-time PCR kit（Gene Pharma），U6 snRNAreal-time PCR normali-zation kit（Gene Pharma），qPCR 引 物（Sangon），F(xiàn)KBP4 過表達(dá)質(zhì)粒（Gene Chem），辣根過氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗鼠 IgG（Jackson Immunoresearch），辣根過氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗兔IgG（Jackson Immuno-research），AlexaFluor?488 偶聯(lián)的 驢抗兔IGG（H+L）（Jackson Immunoresearch），AlexaFluor?594 偶聯(lián)的驢抗兔IGG（H+L）（Jackson Immunoresearch），雙熒光素酶報告分析系統(tǒng)（Promega），DeadendTM熒光TUNEL試劑盒（Promega），XhoⅠ和NotⅠ限制性內(nèi)切酶（Thermo Fisher），小鼠AMH（抗苗勒氏管激素）ELISA試劑盒（Elabscience），小鼠FSH（卵泡刺激素）ELISA試劑盒（Elabscience），人類/猴/小鼠E2（雌二醇）ELISA 試劑盒（Elabscience），DMEM（Gibco），DMEM/F12（Gibco）胎牛血清購自（Gibco），所有其他試劑均購自SigmaAldrich。

1.2 POI患者血清采集

本實(shí)驗(yàn)共招募了6 名無血緣關(guān)系的漢族POI 婦女，6例正常對照組。排除已知染色體異常、既往婦科手術(shù)、自身免疫性疾病、軀體異常（尤其是任何與POI綜合征相關(guān)的病例）或既往放/化療史的病例。正常及POI的血清樣本均來自深圳市第二人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心就診的患者。涉及該研究的患者均經(jīng)深圳市第二人民醫(yī)院倫理委員會（45575561-0）批準(zhǔn)，所有參與者均簽署知情同意書。

1.3 順鉑誘導(dǎo)的POI模型建立

實(shí)驗(yàn)用野生型雌性C57BL/6J小鼠（4 周齡）均購自南方醫(yī)科大學(xué)動物中心。小鼠飼養(yǎng)在南方醫(yī)科大學(xué)SPF等級動物實(shí)驗(yàn)部（SYXK（粵）2016-0167）。雌性小鼠于5周齡進(jìn)行順鉑誘導(dǎo)的POI模型建立。POI組與對照組模型建立方法為：腹腔注射順鉑/生理鹽水2.5 mg·kg-1·d-1，連續(xù)注射7 d［7］。造模方法見圖1。

圖1 順鉑誘導(dǎo)的小鼠POI模型構(gòu)建方法示意圖Fig.1 Treatments for establishing mouse models of CDDP-induced POI.Upper:CDDP-induced POI;Lower:Normal saline-treated.

1.4 胰蛋白酶消化與iTRAQ標(biāo)記

根據(jù)試劑盒的操作流程進(jìn)行iTRAQ標(biāo)記（Applied Biosystems，Sciex）［15］。操作流程簡述：每200 μg蛋白質(zhì)樣品在60 ℃下用TCEP還原劑還原1 h，然后用MMTS半胱氨酸封閉劑在室溫下烷基化30 min，隨后在37 ℃下使用胰蛋白酶（1∶50，Promega）過夜消化蛋白樣品。每組樣本分別標(biāo)有2個可用標(biāo)簽（對照：標(biāo)簽114和標(biāo)簽116；順鉑：標(biāo)簽117和標(biāo)簽119）。最后將所有標(biāo)記的多肽混合在一起。

1.5 卵母細(xì)胞過表達(dá)miR-483-5p轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建

miR-483-5p-floxed小鼠（賽業(yè)生物科技），Gdf9-Cre小鼠（JacksonLaboratory）。Gdf9-Cre 小鼠與miR-483-5p-floxed小鼠交配后產(chǎn)生的雌性miR-483-5p轉(zhuǎn)基因小鼠（miR-483-5p TG）中，Gdf9-Cre+的子代為卵細(xì)胞特異性過表達(dá)小鼠（miR-483-5p TG），同窩Gdf9-Cre-的子代為對照小鼠。小鼠的基因型用裂解的鼠尾組織經(jīng)PCR方法進(jìn)行鑒定。

1.6 實(shí)時熒光定量PCR（qRT-PCR）

總RNA和miRNA分別使用RNAiso Plus試劑和TRIzol LS試劑提取。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用RealStar Power SYBR 試劑盒在StepOne Plus Real-time PCR系統(tǒng)中進(jìn)行qRT-PCR。使用Hairpin-it Real-Time PCR 試劑盒對逆轉(zhuǎn)錄的miR-483-5p進(jìn)行qRT-PCR。最后計算ΔΔCt［16］獲得FKBP4/Gapdh、miR-483-5p/U6（組織和細(xì)胞）和miR-483-5p/miR-39-3p（血清）的比值，以確定POI和對照組之間的表達(dá)變化。qRT-PCR所用引物如下所示：

has-miR-483-5p-F:5'-AGAGCACAAGACGGGA GGAA-3'，has-miR-483-5p-R:5'-TATGGTTGTTCAC GACTCCTTCAC-3'，mmu-miR-483-5p-F:5'-CCACC TAAGACGGGAGAAGA-3'，mmu-miR-483-5p-R:5'-TATGGTTGTTGTGCTCTCTGACTC-3'，U6snRNA-F:5'-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3'，U6snRNA-R:5'-TTCACGAATTTGCGTGTCATC-3'，Cel-miR-39-3p-F:5'-CGTCGATCACCGGGTGTAAA-3'，Cel-miR-39-3p-R:5'-TATGGTTGTTCTGCTCTCTGTCTC-3'，F(xiàn)KBP4-F：5'-CCTCTCGAAGGAGTGGACATC-3'，F(xiàn)KBP4-R：5'-TCCCCGATCATGGGTGTCT-3'，Gapdh-F：5'-TGT GTCCGTCGTGGATCTGA-3'，Gapdh-R：5'-TTGCTG TTGAAGTCGCAGGAG-3'。

1.7 原代顆粒細(xì)胞的培養(yǎng)

選取4周齡的C57BL6/J小鼠依次腹腔注射PMSG（5 IU，Sigma），48 h后注射hCG（5 IU，Sigma），14 h后麻醉并處死小鼠，取出小鼠卵巢。刺破卵巢組織收集顆粒細(xì)胞，使用胰蛋白酶37 ℃消化3 min，隨后離心收集細(xì)胞沉淀，用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，隨后置于恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將提取的原代顆粒細(xì)胞隨機(jī)分為4組：對照組、miR-483-5p組、miR-483-5p+CDDP組和miR-483-5p+FKBP4+CDDP組。

1.8 細(xì)胞培養(yǎng)條件、DNA轉(zhuǎn)染和miRNA干擾

使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)人源宮頸癌細(xì)胞系（HeLa），使用10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)人顆粒細(xì)胞系（KGN）。使用脂質(zhì)體Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染miR-483-5p mimics和FKBP4過表達(dá)質(zhì)粒。

1.9 聚丙烯酰胺凝膠電泳

使用8%～12.5%的SDS-PAGE進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上（GE Healthcare），使用5%的脫脂牛奶室溫封閉1 h，與對應(yīng)一抗4 ℃孵育過夜，TBST清洗3次，每次5 min，與相應(yīng)二抗25 ℃孵育1 h，TBST 清洗3 次，每次5 min，使用Enhanced Chemiluminescence試劑盒（Bio-Rad）顯示免疫反應(yīng)蛋白。β-Actin作為內(nèi)參標(biāo)化目的蛋白。使用Image J軟件1.8.0對目的蛋白的表達(dá)進(jìn)行定量分析。所用一抗為：抗FKBP4兔多克隆抗體（1∶1000，ABclonal）、抗PARP兔多克隆抗體（1∶500，CST，9542S）、抗β-Actin（MG3）小鼠多克隆抗體（1∶3000，銳抗，RM2001）。

1.10 原位雜交

mmu-miR-483-5p的探針序列（Exiqon）含有固定的核酸和地高辛修飾的堿基（/5DigN/CTCCCTTC TCTTCTCCCGTCTT/3Dig_N/）。使用堿性磷酸酶偶聯(lián)的抗地高辛配基多克隆抗體和NBT/BCIP反應(yīng)液檢測miR-483-5p的表達(dá)。使用ImageJ軟件1.8.0對原位雜交圖像進(jìn)行密度計量學(xué)分析［17］。

1.11 熒光素酶測定

從小鼠cDNA中擴(kuò)增出FKBP4 mRNA 3'非翻譯區(qū)（GenBank:NM_010219.4），并用突變引物擴(kuò)增出結(jié)合突變區(qū)。PCR產(chǎn)物和空載的psiCHECK-2用XhoⅠ和NotⅠ限制性內(nèi)切酶以及T4連接酶進(jìn)行酶切和酶連。所用引物序列如下：

FKBP4 mRNA 3'UTR-F:5'-CCGCTCGAGGGGT GGAGACAGAAGCGTAG-3'，F(xiàn)KBP4 mRNA 3'UTRR:5'-ATTTGCGGCCGCTGACACCATCTAAAACTA CCCCC-3'，F(xiàn)KBP4結(jié)合突變區(qū)-F:5'-CCGCTCGAGCT CGGGTGGGTGGAGACAGA-3'，F(xiàn)KBP4結(jié)合突變區(qū)-R:5'-ATTTGCGGCCGCAAGAAAAGTAGGGTTGA GAGG-3'。使用miR-483-5p mimics和/或FKBP4質(zhì)粒通過脂質(zhì)體lipofectamine3000進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。

將FKBP4 mRNA 3'UTR表達(dá)質(zhì)?；騀KBP4結(jié)合突變區(qū)質(zhì)粒與miR-483-5p或陰性對照（NC）mimics分別共轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞。按產(chǎn)品說明書，使用雙熒光素酶報告分析系統(tǒng)對四組轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行分析。使用光度計（Glomax,Promega）［18］量化熒光信號。

1.12 石蠟切片與形態(tài)學(xué)分析

將分離的卵巢組織放置在4%多聚甲醛溶液中室溫固定24 h，石蠟包埋后制備成4μm厚的切片。切片脫蠟復(fù)水后行蘇木精-伊紅（H&E）染色，每組卵巢至少取5張（相隔100μmol/L）切片進(jìn)行卵泡計數(shù)與評級。根據(jù)卵泡的發(fā)育情況及發(fā)育階段，分別對正常卵泡（原始卵泡、初級卵泡、次級卵泡、竇卵泡）及閉鎖卵泡分別進(jìn)行計數(shù)［19］。

1.13 TUNEL實(shí)驗(yàn)

脫蠟復(fù)水后的組織切片使用蛋白酶K（20 μg/mL）透化組織，按產(chǎn)品說明書，予TUNEL試劑孵育。使用DAPI對細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)染后封片。每組卵巢取5張切片（相隔100μm），每張切片隨機(jī)選擇3個包含竇卵泡顆粒細(xì)胞的區(qū)域進(jìn)行TUNEL陽性信號量化，即對卵泡中凋亡的顆粒細(xì)胞進(jìn)行量化。圖像采集軟件為FluoView FV1000共聚焦顯微鏡（Olympus）。

1.14 免疫熒光

脫蠟復(fù)水后的組織切片于枸櫞酸鈉緩沖液高壓修復(fù)5 min，待冷卻后使用正常山羊血清37 ℃封閉1 h，與對應(yīng)一抗4 ℃孵育過夜，PBS清洗3次，每次5 min，再與相應(yīng)熒光二抗37 ℃孵育1 h，PBS清洗3次，每次5 min，DAPI 25 ℃復(fù)染15 min，50%甘油封片。圖像采集軟件為FluoView FV1000共聚焦顯微鏡（Olympus）。所用一抗為：抗連接蛋白43 兔多克隆抗體（1∶100，Immunoway）、抗連接蛋白37 兔多克隆抗體（1∶100，ABclonal）、抗ki67兔多克隆抗體（1∶300，ABclonal）、抗FKBP4兔多克隆抗體（1∶100，ABclonal）。

1.15 酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）

將新鮮血清樣本3000 r/min 離心10 min，分離血清。按產(chǎn)品說明書，使用針對AMH、FSH、E2的ELISA試劑盒檢測血清激素水平。最后用多功能酶標(biāo)儀（biotek）檢測吸光度，并使用origin2019計算標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行濃度換算。

1.16 統(tǒng)計學(xué)分析

統(tǒng)計分析使用IBM SPSS 25.0版，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差描述。Student's t檢驗(yàn)用于比較兩組之間的差異。單因素方差分析（ANOVA）、posthoc Tukey檢驗(yàn)用于比較三組之間的差異。P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 順鉑誘導(dǎo)的POI小鼠卵巢中，F(xiàn)KBP4的mRNA和蛋白水平表達(dá)均降低

iTRAQ分析結(jié)果顯示（圖2A），較生理鹽水組，順鉑誘導(dǎo)組的卵巢中FKBP4蛋白的表達(dá)顯著下調(diào)（差異倍數(shù)：-0.6503）。此外，qRT-PCR及Western blot結(jié)果顯示順鉑誘導(dǎo)組的卵巢中FKBP4的mRNA（P=0.0057，圖2B）及FKBP4蛋白水平均顯著降低（P=0.015，圖2C、D）。

圖2 順鉑誘導(dǎo)的POI小鼠模型中，F(xiàn)KBP4的表達(dá)下調(diào)Fig.2 FKBP4 expression is down-regulated in mice with CDDP-induced POI.A:Ovarian FKBP4 expression detected using iTRAQ analysis.B:Ovarian FKBP4 mRNA level detected using qRT-PCR.C:FKBP4 protein expression in the ovaries determined using Western blotting.D:Quantification of the results of Western blotting.*P<0.05,**P<0.01 vs control.

2.2 miR-483-5p可能是FKBP4的上游調(diào)節(jié)因子，其在順鉑誘導(dǎo)的POI小鼠模型及POI患者血清中均高表達(dá)

利用TargetScan軟件確定了可能的上游調(diào)控因子miR-483-5p，它可以與FKBP4mRNA的3'UTR上1771-1765序列特異性結(jié)合（圖3A）。對順鉑誘導(dǎo)組小鼠模型的卵巢和血清中miR-483-5p進(jìn)行分析。qRT-PCR結(jié)果顯示，較對照組，順鉑誘導(dǎo)組miR-483-5p表達(dá)水平在卵巢（P=0.0092，圖3B）和血清（P=0.001，圖3C）中均顯著升高。原位雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，較對照組，miR-483-5p在順鉑誘導(dǎo)組的卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞中高表達(dá)（P<0.001，圖3D、E）。此外，對POI患者血清樣本進(jìn)行qRTPCR檢測，與正?；颊呦啾龋琍OI患者miR-483-5p的表達(dá)量顯著升高（P<0.001，圖3F），這與順鉑誘導(dǎo)的POI小鼠模型結(jié)果一致。

圖3 在順鉑誘導(dǎo)的POI小鼠模型和POI患者血清中，miR-483-5p高表達(dá)Fig.3 miR-483-5p is highly expressed in the serum of POI mouse models and POI patients.A:Interaction between miR-483-5p and FKBP4 3'UTR region from human.Green represents the sequences from 1765 to 1771 of miR-483-5p,blue represents wild-type sequences in the 3'UTR from human FKBP4;red represents mutant sequences in the 3'UTR from human FKBP4.The expression of miR-483-5p was determined by qRT-PCR.B,C:miR-483-5p expressions in the ovaries and serum of mouse models of POI.D:In situ hybridization(Original magnification,upper panel:×200;lower panel:×200.Scale bar=50μm).E:Semi-quantification analysis.Images at the bottom show enlarged views of the inserted frame.F:Serum levels of miR-483-5p in POI patients determined using qRT-PCR.mRNA levels were normalized against miR-39-3p.**P<0.01,***P<0.001 vs control.

2.3 FKBP4是miR-483-5p的功能靶點(diǎn)，F(xiàn)KBP4可緩解順鉑聯(lián)合miR-483-5p過表達(dá)導(dǎo)致的顆粒細(xì)胞凋亡

轉(zhuǎn)染miR-483-5p mimics的HeLa細(xì)胞miR-483-5p表達(dá)上調(diào)（P<0.001，圖4A）。雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-483-5p mimic過表達(dá)可導(dǎo)致FKBP4 3'UTR報告質(zhì)粒的熒光素酶活性降低（P=0.009，圖4B），而對FKBP4 3'UTR結(jié)合突變區(qū)報告質(zhì)粒的熒光素酶活性沒有影響（P=0.787，圖4B）。此外，Western blot試驗(yàn)證明轉(zhuǎn)染miR-483-5p mimics的HeLa細(xì)胞FKBP4蛋白水平顯著降低（P<0.001，圖4C、D）。

圖4 體外實(shí)驗(yàn)中，F(xiàn)KBP4是miR-483-5p的功能靶點(diǎn)Fig.4 FKBP4 is a functional target of miR-483-5p.A:qRT-RCR analysis was used to test the transfection efficiency of miR-483-5p mimics in HeLa cells.B:The specific regulation of FKBP4 by miR-483-5p was demonstrated using luciferase analysis.C:The expression of FKBP4 protein was determined by Western blotting in HeLa cells transfected with miR-483-5p mimics.D:Quantitative analysis of the results of Western blotting.NC:Negative control.**P<0.01,***P<0.001 vs control.

我們在KGN 細(xì)胞和原代顆粒細(xì)胞中單獨(dú)/同時過表達(dá)miR-483-5p 或/和FKBP4。無論有無順鉑誘導(dǎo)，在miR-483-5p過表達(dá)后，KGN細(xì)胞和原代顆粒細(xì)胞FKBP4蛋白水平均下調(diào)（P=0.004，P=0.003，圖5A、B，P=0.015，P=0.001，圖5D、E），PARP 表達(dá)均上調(diào)（P=0.0051，P=0.0012，圖5A、C，P=0.024，P=0.023，圖5D、F）。此外，KGN細(xì)胞和原代顆粒中FKBP4過表達(dá)可緩解順鉑誘導(dǎo)和miR-483-5p過表達(dá)引起的PARP 表達(dá)上調(diào)（P=0.909，圖5A、C，P=0.486，圖5D、F）。

圖5 在KGN和原代顆粒細(xì)胞中，過表達(dá)FKBP4可減輕順鉑聯(lián)合miR-483-5p過表達(dá)引起的細(xì)胞凋亡Fig.5 Overexpression of FKBP4 in KGN and primary GCs alleviates apoptosis caused by CDDP and miR-483-5p overexpression.A-C:Expression levels of FKBP4 and PARP determined in KGN cells treated by CDDP plus miR-483-5p or/and FKBP4 plasmid transfection using Western blotting.D-F:Expression levels of FKBP4 and PARP determined in primary GCs treated with CDDP plus miR-483-5p or/and FKBP4 plasmid transfection using Western blotting.*P<0.05,**P<0.01 vs control.

2.4 卵母細(xì)胞過表達(dá)miR-483-5p加重了順鉑誘導(dǎo)的卵巢損傷

PCR 和qPCR 結(jié)果顯示miR-483-5p TG 小鼠中，在基因和mRNA 水平均特異性過表達(dá)miR-483-5p（P=0.0054，圖6A、B）。原位雜交及其半定量分析結(jié)果顯示miR-483-5p在miR-483-5p TG小鼠的卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞中表達(dá)升高（P=0.005，圖6C、D）。然而，F(xiàn)KBP4在miR-483-5p TG小鼠的卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞中表達(dá)顯著降低（P=0.019，圖6E、F）。并且，經(jīng)順鉑處理后，miR-483-5p TG小鼠的FKBP4蛋白水平進(jìn)一步降低（P<0.001，P=0.003，圖6E、F）。

圖6 用Cre/loxP系統(tǒng)建立miR-483-5p TG小鼠Fig.6 miR-483-5p TG mice established using the Cre/LoxP system.F1 offspring mice were genotyped using PCR(A)and qRT-PCR(B).The 200 bp bands corresponds to the miR-483-5p LoxP(-),while the 500 bp band corresponds to miR-483-5p LoxP(+),and the band below the 500 bp band corresponds to Gdf9-Cre.C,D:Location and expression of miR-483-5p were tested in the ovaries from miR-483-5p TG mice using in situ hybridization(Huge image:×100,upper right image:×200).The insert on the lower left shows an enlarged view of the inserted frame.E,F:Location and expression of FKBP4 were tested in the ovaries from miR-483-5p TG mice using immunofluorescence (×200).The mouse model was divided into four groups,including control plus saline,control plus CDDP,miR-483-5p TG plus saline,and miR-483-5p TG plus CDDP.*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001 vs control,#P<0.01 vs CDDP.

miR-483-5p TG小鼠的卵巢質(zhì)量略微減輕，但無統(tǒng)計學(xué)差異（圖7A、B）。對照組與過表達(dá)組小鼠經(jīng)過順鉑誘導(dǎo)卵巢質(zhì)量均會顯著減輕。但miR-483-5p TG小鼠對順鉑造成的卵巢重量減輕影響更顯著（P=0.001，圖7A、B）。HE 結(jié)果（圖7C）表明，與順鉑誘導(dǎo)組相比，miR-483-5p TG小鼠在順鉑誘導(dǎo)下的原始卵泡、竇卵泡顯著減少（P=0.003，P=0.003，圖7D），而閉鎖卵泡的數(shù)量顯著上升（P<0.001，圖7E）。此外，與順鉑誘導(dǎo)組相比，miR-483-5p TG小鼠在順鉑誘導(dǎo)下的AMH和E2顯著降低（P<0.001，圖7F、G），而FSH水平顯著升高（P=0.027，圖7H）。免疫熒光結(jié)果顯示，與順鉑誘導(dǎo)組相比，miR-483-5p TG小鼠在順鉑誘導(dǎo)下顆粒細(xì)胞的凋亡水平顯著升高，增殖水平顯著下調(diào)（P<0.001，圖7I，J、M，N）。并且，與順鉑誘導(dǎo)組相比，連接蛋白37 和連接蛋白43 的水平均顯著降低（P=0.032，P<0.001，圖7K，L、O，P）。

3 討論

POI是導(dǎo)致不孕的主要原因之一，但目前仍無公認(rèn)有效的治療方法。因此尋找病因，確定病程對治療至關(guān)重要［20］。POI發(fā)生的原因之一是化療藥物產(chǎn)生的生殖毒性。近幾十年來，年輕女性癌癥患者的5年生存率呈上升趨勢，但患者成年后的不孕率也顯著增加［21］。順鉑通過PTEN/AKT/FOXO3a通路過度激活休眠的原始卵泡，進(jìn)而導(dǎo)致POI［6-7］。由于，伊馬替尼通過抑制c-Abl-TAp63通路保護(hù)小鼠卵母細(xì)胞免受化療的損害，從而緩解順鉑造成的卵巢損傷仍存在爭議［22］。因此，確定POI患者的預(yù)防性診斷標(biāo)記物和有效的治療方法仍亟待解決。miR-483-5p可能通過一種新的線粒體分裂通路增加舌鱗狀細(xì)胞癌（TSCC）細(xì)胞對順鉑的敏感性［14］。同時，miR-483-5p通過抑制MAPK通路參與軟骨細(xì)胞基質(zhì)的丟失［23］。也有研究發(fā)現(xiàn)多囊卵巢綜合征患者卵丘細(xì)胞miR-483-5p水平顯著降低；miR-483-5p可能通過激活PI3K/AKT 通路促進(jìn)卵丘細(xì)胞增殖；以及miR-483-5p可能在降低胰島素抵抗中發(fā)揮重要作用［24-26］。并且，microRNAs（miRNAs）在POI的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用［12］。因此，本研究旨在探討順鉑誘導(dǎo)POI的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)POI的發(fā)生和發(fā)展的新方法。

通過C57BL/6小鼠構(gòu)建順鉑誘導(dǎo)的POI模型，探討POI的潛在機(jī)制。蛋白質(zhì)組和iTRAQ分析發(fā)現(xiàn)，在順鉑誘導(dǎo)的POI 模型中，卵巢中FKBP4 蛋白顯著下調(diào)。FKBP4作為FK506結(jié)合蛋白（FKBPs）家族的一員，能夠與HSP90復(fù)合物結(jié)合，且是雄激素、糖皮質(zhì)激素和孕激素受體信號通路的重要正向調(diào)節(jié)因子［26］。此外，F(xiàn)KBP4也與各種類型的癌癥以及部分生殖和神經(jīng)疾病有關(guān)［9］。雄性和雌性FKBP4缺陷小鼠均表現(xiàn)出雄激素、糖皮質(zhì)激素及孕酮的不敏感［27］。我們的研究表明，在順鉑誘導(dǎo)的POI模型中，F(xiàn)KBP4 mRNA和蛋白的表達(dá)水平均降低。因此，F(xiàn)KBP4在卵巢中的表達(dá)下調(diào)可能在順鉑誘導(dǎo)POI的損傷過程中起作用。

為了進(jìn)一步闡明FKBP4在順鉑誘導(dǎo)的POI中下調(diào)的原因，我們利用TargetScan軟件確定了FKBP4的上游內(nèi)源性調(diào)節(jié)因子，miR-483-5p。并且，miR-483-5p能與FKBP4 mRNA的3'UTR 1771-1765位點(diǎn)特異性結(jié)合。通過qRT-PCR，發(fā)現(xiàn)順鉑誘導(dǎo)卵巢中miR-483-5p高表達(dá)。與正?；颊呦啾龋琍OI患者miR-483-5p水平也上調(diào)。miR-483-5p的上調(diào)與腎上腺皮質(zhì)癌的疾病特異性生存期縮短顯著相關(guān)［28］。且miR-483-5p還被證實(shí)通過刺激肥大軟骨細(xì)胞和血管形成影響骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生和發(fā)展［29］。通過原代和KGN細(xì)胞系進(jìn)一步證明，F(xiàn)KBP4過表達(dá)可以降低順鉑聯(lián)合miR-483-5p過表達(dá)而導(dǎo)致的PARP 的升高。因此，本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)KBP4 是miR-483-5p確認(rèn)的功能靶點(diǎn)；過表達(dá)FKBP4可以緩解順鉑和miR-483-5p過表達(dá)引起的細(xì)胞凋亡。

為了探究miR-483-5p在POI發(fā)生發(fā)展中的作用，我們建立了卵母細(xì)胞特異性過表達(dá)miR-483-5p的轉(zhuǎn)基因小鼠。與對照組相比，miR-483-5p TG小鼠無明顯的POI 病理特征。這表明單獨(dú)的過表達(dá)卵母細(xì)胞miR-483-5p并不能引起POI的病理特征。且有研究表明，過表達(dá)miR-483-5p的小鼠在肝臟形態(tài)方面沒有表現(xiàn)出任何異常的結(jié)構(gòu)變化［30］。然而，miR-483-5p TG小鼠，經(jīng)順鉑處理，會明顯加重POI的損傷并擾亂性激素水平。這表明miR-483-5p TG小鼠可能對順鉑更敏感，尤其是在卵巢損傷方面。

綜上所述，我們的研究揭示了一個新的通路miR-483-5p/FKBP4，在順鉑誘導(dǎo)的POI 中發(fā)揮作用。POI的損傷過程可能與上調(diào)的miR-483-5p導(dǎo)致FKBP4蛋白表達(dá)下降有關(guān)。miR-483-5p上調(diào)可能增加卵巢對順鉑藥物的敏感性，使卵巢功能降低。檢測血清miR-483-5p可以用來預(yù)測POI的發(fā)生和發(fā)展。