李 僑，邱宇翔，金 婷，柳滿然，侯懿烜

重慶醫(yī)科大學(xué)1臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，重慶 400016

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅女性健康［1］。侵襲轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤重要的生物學(xué)特征，與乳腺腫瘤復(fù)發(fā)以及乳腺癌患者預(yù)后不良密切相關(guān)，同時也是導(dǎo)致患者死亡的主要原因［2］，然而驅(qū)動乳腺腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制尚不清楚［3］。因此，深入研究乳腺癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制，可以為開發(fā)新的乳腺癌診治策略提供理論基礎(chǔ)，有利于改善患者的生存率和預(yù)后。

微小RNA（miRNA）是一類由18～25個核苷酸組成的小分子非編碼RNA，在多種細(xì)胞和生理過程中發(fā)揮重要作用，與多種人類腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移有關(guān)［4-5］。miRNA調(diào)控乳腺腫瘤轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制不一而足，包括調(diào)節(jié)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化［6］、腫瘤干細(xì)胞特性［7］、腫瘤微環(huán)境［8］、血管形成［9］以及外泌體［10］等。例如：miR-140-5p通過靶向調(diào)控VEGF-A抑制乳腺癌細(xì)胞的血管形成和侵襲［11］；miR-204-5p可通過重塑腫瘤免疫微環(huán)境減弱乳腺癌的增殖和遷移［12］，提示乳腺腫瘤中某些miRNA異常，不僅影響乳腺癌發(fā)生發(fā)展，并可能是乳腺腫瘤轉(zhuǎn)移評估和生物治療的有效生物標(biāo)志物和靶點(diǎn)［13］。然而，諸多miRNA在乳腺癌中的作用及相關(guān)的分子機(jī)制尚待研究。本研究通過TCGA數(shù)據(jù)庫中miRNA測序數(shù)據(jù)，挖掘出miR-4719在乳腺癌組織中表達(dá)下調(diào)，但該miRNA在乳腺癌中的生物學(xué)作用尚未見報(bào)道。作為表觀遺傳學(xué)的一個重要組分，miRNA主要通過干擾靶mRNA翻譯或促進(jìn)其降解下調(diào)蛋白質(zhì)或長鏈非編碼RNA的表達(dá)來發(fā)揮調(diào)節(jié)作用［14］。因此，我們進(jìn)一步借助microT在線網(wǎng)站對miR-4719的潛在靶基因進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測，分析發(fā)現(xiàn)ARHGAP36是其最可能的潛在靶基因。Rho GTP酶活化蛋白36（ARHGAP36）屬于Rho GTP酶蛋白家族成員。該蛋白家族參與了細(xì)胞的黏附與遷徙、細(xì)胞骨架重組、腫瘤血管生成、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等多項(xiàng)生理過程，在腫瘤的發(fā)展與轉(zhuǎn)移中起重要作用［15］。對該家族蛋白成員的研究顯示，ARHGAP4可調(diào)控哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路和低氧誘導(dǎo)因子1α信號通路，進(jìn)而促進(jìn)胰腺癌的生長［16］；ARHGAP9在乳腺癌中高表達(dá)，且可促進(jìn)乳腺癌的侵襲遷移［17］。此外，ARHGAP36已被報(bào)道在甲狀腺癌、髓母細(xì)胞瘤以及嗜鉻細(xì)胞瘤中高表達(dá)，與這些腫瘤的惡性進(jìn)展相關(guān)［18］?；谶@些研究背景，我們推測miR-4719可能通過靶向ARHGAP36在乳腺腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。

在本研究中，我們較深入地研究了miR-4719 對ARHGAP36的調(diào)控作用，以及miR-4719/ARHGAP36信號軸對乳腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響。本研究不僅豐富了我們對乳腺癌轉(zhuǎn)移機(jī)制的認(rèn)識，同時為臨床乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移潛能的評估和預(yù)后監(jiān)測提供了有潛在價(jià)值的生物標(biāo)志物。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

RPMI 1640、DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)液，胎牛血清及0.25%胰酶（Gibco）；Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑及TRIzol提取試劑（Invitrogen）；PrimeScriptTMRT Reagent Kit和SYBR Premix Ex TaqTM（TaKaLa）；miR-4719、U6、ARHGAP36及β-actin基因引物（上海生物工程）；RIPA裂解液、PMSF 和BCA蛋白濃度檢測試劑盒（碧云天）；抗ARHGAP36多克隆抗體（Invitrogen）；抗β-Actin單克隆抗體（SAB）；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔和山羊抗鼠IgG（中杉金橋）；電化學(xué)發(fā)光液（Bio-Rad）；miR-4719 mimics 及NC mimics、sh ARHGAP36 及 對 照shRNA（shNC）和熒光素酶報(bào)告基因載體（吉瑪制藥）；ARHGAP36過表達(dá)質(zhì)粒及其空載體質(zhì)粒（金開瑞）。

實(shí)驗(yàn)儀器：CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱和4 ℃低溫離心機(jī)（Thermo），雙垂直板電泳槽，DYY III穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（六一生物科技），數(shù)字凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad），熒光定量PCR儀（Thermo），超微量分光光度計(jì)（Thermo）。

1.2 組織標(biāo)本

30 例未經(jīng)放化療的乳腺癌病人腫瘤組織及癌旁正常組織取自于重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院進(jìn)行手術(shù)治療的乳腺癌患者，標(biāo)本被保存于重慶醫(yī)科大學(xué)臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室?；颊吆炇鹆酥橥鈺?，乳腺癌標(biāo)本的收集均完全符合重慶醫(yī)科大學(xué)倫理委員會（審批號：2020-762）的規(guī)定。

1.3 細(xì)胞及其培養(yǎng)

人乳腺癌MDA-MB-231，BT549細(xì)胞，人正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A和人胚胎腎細(xì)胞HEK293T由重慶醫(yī)科大學(xué)臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。MDA-MB-231 和HEK293T 細(xì) 胞 用 含10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基培 養(yǎng)，BT549 細(xì) 胞 用含10% FBS 的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，MCF-10A細(xì)胞用含5%馬血清、20 ng/mL表皮生長因子、10 μg/mL胰島素、100 ng/mL霍亂病毒和0.5 μg/mL氫化可的松的DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)。所有細(xì)胞均置于37 ℃、含5%CO2的無菌恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d更換新鮮培養(yǎng)基。待細(xì)胞生長至融合度為80%～90%時，進(jìn)行傳代。細(xì)胞處于對數(shù)生長期時進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

待乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和BT549生長至融合度為50～60%時，將miR-4719 mimics和NC mimics、sh ARHGAP36 和shNC、ARHGAP36 過表達(dá)質(zhì)粒和Vector按說明書陳述的步驟分別轉(zhuǎn)染BT549和MDAMB-231細(xì)胞。轉(zhuǎn)染24 h后收集細(xì)胞，TRIzol法提取總RNA。

1.5 組織RNA的提取

無菌剪刀剪碎50 mg組織，加入1 mL TRIzol 試劑于冰上研磨勻漿，組織充分溶解后收集懸浮液。加入200 μL 三氯甲烷，使用渦旋器震蕩混勻，靜置20 min 后離心；取透明層與等體積異丙醇（400 μL）混勻，室溫靜置離心，加入適量75%冰酒精清洗沉淀，晾干后加入適量DEPC水溶解RNA沉淀。

1.6 逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時定量PCR（qRT-PCR）

用PrimeScriptTMRT Reagent Kit 試劑盒按說明書陳述的步驟將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，置于-40 ℃冰箱中穩(wěn)定保存。使用Nanodrop-2000超微量分光光度計(jì)進(jìn)行RNA濃度/純度檢測。用配套的實(shí)時熒光定量PCR試劑盒SYBR Premix Ex TaqTM，ddH2O，引物以及cDNA配制PCR反應(yīng)體系，然后使用實(shí)時熒光定量分析儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

miRNA的PCR反應(yīng)條件：95 ℃，2 min；95 ℃，10 s；57 ℃，20 s；72 ℃20 s。循環(huán)40次。

mRNA的PCR反應(yīng)條件：95 ℃，30 s；95 ℃，30 s；53 ℃，30 s；72 ℃，20 s。循環(huán)40次。以β-actin為內(nèi)參基因，結(jié)果以2-ΔΔCt值表示目的RNA的相對表達(dá)水平。

1.7 蛋白質(zhì)印跡法

收集細(xì)胞，加入RIPA裂解液（含1%PMSF），冰上裂解細(xì)胞30 min。低溫離心機(jī)中轉(zhuǎn)速12 800×g 離心30 min，吸取上清液，棄沉淀。向2 μL上清與18 μL PBS混合液中加入200 μL BCA，37 ℃水浴箱中孵育30 min，用分光光度儀檢測吸光度值A(chǔ)562nm，根據(jù)吸光度值計(jì)算出總蛋白濃度。將各組蛋白濃度調(diào)整一致后，加入1/4蛋白液總體積的上樣緩沖液，沸水浴中加熱5 min，置于-80 ℃冰箱中保存。每孔加樣40 μg 蛋白，進(jìn)行SDSPAGE電泳。電泳完成后在恒流的條件下將分離的蛋白條帶轉(zhuǎn)移至0.22 μm聚偏氟乙烯膜（PVDF）。待轉(zhuǎn)膜完成后，用10%脫脂奶粉將PVDF膜室溫封閉2～4 h，在4 ℃冰箱孵育一抗過夜。PVDF膜在TBST中用搖床振搖洗滌3次，每次10 min。室溫下，再將膜用辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔或山羊抗鼠IgG二抗孵育80 min，TBST搖洗3次。電化學(xué)發(fā)光顯色液覆蓋膜，用凝膠成像分析儀（Bio-Rad）對蛋白條帶進(jìn)行顯影。

1.8 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

收集并計(jì)數(shù)各組細(xì)胞，按5×105/孔的細(xì)胞密度在六孔板中進(jìn)行鋪板，每組設(shè)置3個復(fù)孔。將各組細(xì)胞置于37 ℃，5%CO2的無菌恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，用200 μL槍頭垂直均勻劃線，用PBS洗滌漂浮的細(xì)胞3次，分別于0 h和24 h時用光學(xué)顯微鏡在40倍的放大倍數(shù)下拍照。應(yīng)用圖像分析軟件ImageJ對細(xì)胞遷移率進(jìn)行計(jì)算。細(xì)胞遷移率=(初始劃痕面積－相應(yīng)點(diǎn)劃痕面積)/初始劃痕面積×100%。

1.9 Transwell實(shí)驗(yàn)

在Transwell小室的濾膜上預(yù)先加入40 μL稀釋好的基質(zhì)膠（無血清培養(yǎng)基與基質(zhì)膠的體積比為1∶8）。消化離心收集各組細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后混勻計(jì)數(shù)。向24孔板的每個孔中加入500 μL含10%FBS的培養(yǎng)基，Transwell小室中加入200 μL含3.0×104細(xì)胞的無血清的細(xì)胞懸液，每組設(shè)置3個復(fù)孔，置于37 ℃，含5%CO2的孵箱中培養(yǎng)13 h后取出小室，PBS緩沖液清洗、4%多聚甲醛固定細(xì)胞15 min，再用濕棉簽擦拭去掉小室內(nèi)的細(xì)胞，晾干，0.5%結(jié)晶紫染色5 min，于PBS中清洗后晾干。正置相差光學(xué)顯微鏡下，對左、右、上、下、中5個視野（100×）拍照，計(jì)算5個視野的平均值代表每孔細(xì)胞的侵襲能力。

1.10 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

構(gòu)建ARHGAP36 3'-UTR 野生型（ARHGAP36-WT）和突變型（ARHGAP36-MUT）熒光素酶表達(dá)載體。按照lipofectamine2000說明書，將ARHGAP36-WT和ARHGAP36-MUT質(zhì)粒分別與miR-4719 mimics和NC mimics一起轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞。48 h后棄去培養(yǎng)液，用細(xì)胞裂解液冰上裂解細(xì)胞30 min，低溫離心機(jī)中12 800×g離心10 min，吸取上清液，向上清中加入熒光素酶底物反應(yīng)，3 min 后用雙熒光素酶檢測系統(tǒng)（Promega）測定熒光素酶活性。

1.11 免疫組化染色

將用乳腺癌病人組織制成的石蠟切片預(yù)先在80 ℃烤箱中烘烤2 h，脫蠟復(fù)水（依次將載玻片放入二甲苯10 min，3次；無水酒精5 min，2次；95%酒精，5 min，70%酒精5 min，50%酒精5 min），3%H2O2溶液封閉過氧化物酶10 min，然后將切片置于檸檬酸鈉緩沖液中微波爐加熱10 min進(jìn)行抗原修復(fù)。血清封閉15 min后，與抗ARHGAP36一抗（1∶100）在4 ℃孵育過夜。HRP標(biāo)記的聚合物偶聯(lián)二抗染色切片1 h。將免疫復(fù)合物用DAB顯色5～8 min，細(xì)胞核用蘇木素復(fù)染30 s，脫水，透明，中性樹膠封片。待封片干燥后在顯微鏡下觀察拍照。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 22.0 軟件。組內(nèi)兩兩比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示計(jì)量資料。組間關(guān)聯(lián)性分析使用卡方檢驗(yàn)。P<0.05代表差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究所有實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 miR-4719在乳腺癌患者組織中表達(dá)下調(diào)并且與不良預(yù)后相關(guān)

qRT-PCR結(jié)果顯示，miR-4719在乳腺癌組織中表達(dá)量顯著下調(diào)（P<0.001，圖1A）。此外，通過KM plotter數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，miR-4719低表達(dá)與乳腺癌患者的不良預(yù)后明顯有關(guān)（P=0.007，圖1B）。

2.2 miR-4719可抑制乳腺癌細(xì)胞BT549和MDA-MB-231的遷移和侵襲

qRT-PC結(jié)果顯示：MDA-MB-231和BT549中miR-4719的水平相對正常乳腺細(xì)胞MCF-10A顯著下調(diào)（P<0.01，圖2A）；miR-4719 mimics組中miR-4719的表達(dá)水平相對NC mimics組細(xì)胞明顯升高（P<0.01，圖2B）。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell 實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，過表達(dá)miR-4719顯著抑制了細(xì)胞的遷移能力（P<0.05，圖2C、D）和侵襲能力（P<0.05，圖2E、F）。

圖2 miR-4719在乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)并且可抑制細(xì)胞的遷移和侵襲Fig.2 miR-4719 is downregulated in breast cancer cells and miR-4719 mimics inhibits cell migration and invasion.A:miR-4719 was downregulated in breast cancer cells compared to normal breast cell MCF-10A.**P<0.01 vs MCF-10A.B:Overexpressing efficiency of miR-4719 was detected by qRT-PCR.**P<0.01 vs NC mimics.C,D:Cell migration capacities were detected by wound healing assay (Scale bar=100 μm).*P<0.05 vs NC mimics.E,F:Cell invasion abilities determined by Transwell assay(Scale bar=100 μm).*P<0.05 vs NC mimics.

2.3 miR-4719靶向抑制ARHGAP36的表達(dá)

利用miRNA靶基因在線預(yù)測網(wǎng)站microT（http://diana.cslab.ece.ntua.gr/ microT/），我們發(fā)現(xiàn)ARHGAP36是miR-4719最有可能的靶基因（圖3A）。qRT-PCR結(jié)果顯示：與癌旁正常組織相比，ARHGAP36在乳腺癌組織中表達(dá)量顯著上調(diào)（P<0.001，圖3B）。相關(guān)性分析則發(fā)現(xiàn)ARHGAP36和miR-4719存在明顯的負(fù)相關(guān)關(guān)系（r=-0.5345，P<0.01，圖3C），這與人乳腺癌組織免疫組化染色的結(jié)果一致（P<0.001，圖3D）。此外，qRT-PCR 結(jié)果表明：相較于MCF-10A 細(xì)胞，ARHGAP36在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)水平亦顯著增加（P<0.01，圖3E、F）；過表達(dá)miR-4719 可以明顯降低ARHGAP36的表達(dá)水平（P<0.01，圖3G）。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)：過表達(dá)miR-4719可顯著減弱ARHGAP36-WT 的熒光素酶活性，而對ARHGAP36-MUT的熒光素酶活性無影響（圖3H）。綜上所述，miR-4719可通過直接結(jié)合在ARHGAP36的3'-UTR抑制ARHGAP36的表達(dá)。

圖3 ARHGAP36是miR-4719的靶基因Fig.3 ARHGAP36 is the target gene of miR-4719.A:Potential target genes of miR-4719 were predicted by online website microT.B:The expression of ARHGAP36 was detected by qRT-PCR in breast cancer tissues (n=30).***P<0.001.C:Pearson correlation analysis of miR-4719 and ARHGAP36 expression in breast cancer tissues(n=30).D:ARHGAP36 protein level was determined using IHC staining in breast cancer tissues (×100,scale bar=100 μm).***P<0.001.E,F:mRNA and protein level of ARHGAP36 in breast cancer cells were detected by qRT-PCR and Western blotting,respectively.**P<0.01,***P<0.001 vs MCF-10A.G:ARHGAP36 RNA level was detected by qRT-PCR after the transfection with miR-4719 mimics.**P<0.01 vs NC mimics.H:The binding of miR-4719 to ARHGAP36 was verified by dual-luciferase reporter assay.**P<0.01 vs NC mimics.

2.4 敲低ARHGAP36可抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲

qRT-PCR 和western blot 結(jié)果證明，轉(zhuǎn)染小發(fā)夾RNA后癌細(xì)胞中ARHGAP36的表達(dá)被有效沉默（P<0.01，圖4A、B）。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，沉默ARHGAP36可有效抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力（P<0.05，圖4C～F）。

圖4 敲低ARHGAP36抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲Fig.4 Knockdown of ARHGAP36 inhibits the migration and invasion of breast cancer cells.A,B:Knockdown efficiency of ARHGAP36 measured by qRT-PCR and Western blotting.C,D:Cell migration capacities detected by wound healing assay(Scale bar=100 μm).E,F:Cell invasion abilities determined by Transwell assay.*P<0.05,**P<0.01 vs shNC group.

2.5 過表達(dá)ARHGAP36可逆轉(zhuǎn)外源性miR-4719對乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力的抑制

qRT-PCR和western blot結(jié)果證實(shí)，在過表達(dá)miR-4719的乳腺癌細(xì)胞中外源導(dǎo)入ARHGAP36質(zhì)?？捎行Щ謴?fù)ARHGAP36在RNA和蛋白水平的表達(dá)（P<0.01，圖5A、B）。進(jìn)一步的功能實(shí)驗(yàn)表明，恢復(fù)ARHGAP36的表達(dá)能有效逆轉(zhuǎn)過表達(dá)miR-4719導(dǎo)致的MDA-MB-231 和BT549 細(xì)胞遷移和侵襲能力的下降（P<0.05，圖5C～F）。

圖5 過表達(dá)ARHGAP36可以促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲Fig.5 Overexpression of ARHGAP36 promotes the migration and invasion of breast cancer cells.A,B:RNA and protein level of ARHGAP36 were detected by qRT-PCR and western blot,respectively.C,D:Cell migration capacities detected by wound healing assay (Scale bar=100 μm).E,F:Cell invasion abilities determined by Transwell assay (Scale bar=100 μm).*P<0.05,**P<0.01.

3 討論

乳腺癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制極其復(fù)雜。大量研究表明，遺傳多樣性、表觀修飾和腫瘤微環(huán)境等因素均與乳腺癌的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［19-22］。例如，Chen等［23］發(fā)現(xiàn)，ZMYND8可被p300/CBP蛋白乙?；?，乙?；腪MYND8可進(jìn)一步激活HIF通路，從而促進(jìn)乳腺癌的轉(zhuǎn)移。然而，我們對引起乳腺腫瘤轉(zhuǎn)移的生物學(xué)過程仍知之甚少［24］，因此更全面詳盡地闡明驅(qū)動腫瘤轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制值得進(jìn)一步深入探討。

miRNA作為遺傳多樣性的重要范疇之一，可參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化和侵襲等多種生物學(xué)過程，在腫瘤轉(zhuǎn)移的各個階段均發(fā)揮重要作用。如：miR-454-3p、miR-615-3p、miR-200c和miR-141等已被報(bào)道在不同階段參與乳腺癌的轉(zhuǎn)移［25-27］；miR-34a可通過靶向調(diào)控c-met 的表達(dá)抑制肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲［28］。然而，miRNA作用的組織以及條件特異性嚴(yán)重阻礙了有關(guān)miRNA的研究被有效轉(zhuǎn)化到臨床腫瘤的診治中［29］。因此，深入探究miRNA在乳腺癌轉(zhuǎn)移中的作用及其分子機(jī)制對臨床干預(yù)乳腺癌轉(zhuǎn)移具有重要價(jià)值。本研究發(fā)現(xiàn)：miR-4719在乳腺癌細(xì)胞和癌組織中顯著下調(diào)，與患者的預(yù)后不良明顯相關(guān)；此外，miR-4719可顯著抑制細(xì)胞的遷移和侵襲。這些結(jié)果提示miR-4719可能通過靶向調(diào)控某些基因的表達(dá)在乳腺癌的轉(zhuǎn)移中起抑制作用。

據(jù)報(bào)道，ARHGAP36在甲狀腺癌、髓母細(xì)胞瘤以及嗜鉻細(xì)胞瘤中均表達(dá)升高，且其異常表達(dá)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的錨定非依賴性生長、增殖和遷移［30-31］。其中，錨定非依賴性生長是腫瘤轉(zhuǎn)移的重要因素之一，提示ARHGAP36 可能與腫瘤的轉(zhuǎn)移緊密相關(guān)。然而，ARHGAP36 在乳腺癌轉(zhuǎn)移中的生物學(xué)作用尚未見報(bào)道。我們的研究結(jié)果顯示，ARHGAP36在乳腺癌組織和細(xì)胞中表達(dá)升高，并且乳腺癌組織中miR-4719與ARHGAP36的表達(dá)呈明顯的負(fù)相關(guān)關(guān)系。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)miR-4719可以與ARHGAP36的3'-UTR直接結(jié)合，說明ARHGAP36是miR-4719的一個靶基因。功能實(shí)驗(yàn)則進(jìn)一步證實(shí)敲除ARHGAP36明顯減弱了乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲，而過表達(dá)ARHGAP36則可逆轉(zhuǎn)過表達(dá)miR-4719對細(xì)胞遷移和侵襲能力的抑制，表明miR-4719通過干擾ARHGAP36的表達(dá)在乳腺癌的轉(zhuǎn)移中起到抑制作用，因此我們的結(jié)果可能為乳腺癌的早期診斷提供新的腫瘤生物標(biāo)志物。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)一種新的miRNA即miR-4719，并證實(shí)其在乳腺癌組織中低表達(dá)，且與預(yù)后不良相關(guān)。分子機(jī)制上，miR-4719通過靶向調(diào)控ARHGAP36對乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲發(fā)揮作用。此外，我們還首次證明了ARHGAP36在乳腺癌中發(fā)揮了促癌細(xì)胞的遷移和侵襲作用。然而，miR-4719/ARHGAP36信號軸具體是如何調(diào)控乳腺細(xì)胞的侵襲遷移，miR-4719在乳腺癌患者血清或血漿中的表達(dá)能否用于乳腺癌轉(zhuǎn)移潛能和預(yù)后預(yù)測，這些問題將值得進(jìn)一步研究。