徐 璐，錢 峰，孫 磊

上海交通大學(xué)藥學(xué)院細(xì)胞與治療抗體工程研究中心，上海 200240

頭頸癌是好發(fā)于人口腔、鼻腔、咽、喉等部位粘膜表面的鱗狀細(xì)胞癌，據(jù)統(tǒng)計(jì)僅2018年就有超過(guò)90萬(wàn)新發(fā)病例，死亡人數(shù)超過(guò)40萬(wàn)，嚴(yán)重威脅人類健康［1-2］。目前，頭頸癌的首選治療手段是手術(shù)切除、放化療［3］，但由于放射性治療對(duì)人體存在的毒性反應(yīng)，有20%～30%的患者無(wú)法完成整體放化療過(guò)程［4］。對(duì)于中晚期并伴隨局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的頭頸癌患者，尋找有效的抗頭頸癌藥物對(duì)于提高患者生存期及生活質(zhì)量至關(guān)重要。三硫二芐基（DTS）是商陸科蒜香草（Petiveria alliacea L）中的一種主要活性成分［5］。該藥用植物在民間被廣泛運(yùn)用于哮喘、關(guān)節(jié)炎、腫瘤等疾病的治療［6］，現(xiàn)代藥理研究證實(shí)其在各種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中也具有明顯療效，例如焦慮、疼痛、記憶力減退和癲癇發(fā)作等，能夠有效改善大腦認(rèn)知、記憶和學(xué)習(xí)能力［6-7］。有研究顯示DTS及其類似物能夠抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖［8］，但DTS在頭頸癌中的作用尚未報(bào)道。

抗凋亡是腫瘤細(xì)胞的一種惡性表型，目前多數(shù)腫瘤治療策略與細(xì)胞凋亡信號(hào)通路激活相關(guān)［9］。線粒體介導(dǎo)的凋亡依賴于線粒體外膜上Bcl-2家族蛋白之間的相互作用以及細(xì)胞色素c的釋放，從而促進(jìn)一系列凋亡蛋白酶包括caspase-3的激活［10］；同時(shí)線粒體外膜通透性的增高也會(huì)導(dǎo)致線粒體去極化，造成線粒體膜電位降低以及凋亡因子釋放［11］。已知PI3K/Akt信號(hào)通路廣泛參與了多種癌癥的發(fā)病機(jī)制，由生存因子誘導(dǎo)的Akt激活可以抑制細(xì)胞凋亡，調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)和分化［12］。p53是多種腫瘤的抑制因子，能夠調(diào)控細(xì)胞周期，也是早期頭頸癌常見的突變基因［13］。本研究闡明了DTS對(duì)頭頸癌細(xì)胞HN30增殖和凋亡的影響，并對(duì)其作用機(jī)制作進(jìn)一步探討。

1 材料和方法

1.1 試劑

三硫二芐基（Cato Research Chemicals）（C14H14S3，MW：278.46，純度≥98.0%，CAS：6493-73-8）；DMEM培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素雙抗（100×）、胰酶（Thermo Fisher）；胎牛血清（浙江天杭生物）；結(jié)晶紫、MTT粉末（生工生物工程（上海））；Annexin Ⅴ-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（杭州聯(lián)科生物）；線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒（JC-1）、RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（上海碧云天）；一抗β-actin，caspase-3，cleaved caspase-3，Bcl-2，p-Akt，Akt，p-p53，p53（Cell Signaling Technology）；人源頭頸部鱗狀癌細(xì)胞株HN30（美國(guó)菌種保藏中心）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人源頭頸部鱗狀癌細(xì)胞株HN30、HN12和SCC25所用培養(yǎng)基為含10%胎牛血清及1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。觀察到細(xì)胞狀態(tài)良好，于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期進(jìn)行胰酶消化、傳代操作。

1.3 克隆形成實(shí)驗(yàn)

分別取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期且狀態(tài)良好的HN30、HN12和SCC25細(xì)胞，胰酶消化并離心收集，梯度稀釋后以400/孔的細(xì)胞密度接種至六孔板，加入2 mL/孔的培養(yǎng)液以及相應(yīng)濃度的DTS，37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)7 d。待顯微鏡下觀察到單個(gè)克隆點(diǎn)含有50及以上細(xì)胞，終止培養(yǎng)，棄上清，甲醇固定20 min，0.1%結(jié)晶紫染色，20 min后洗去染色液晾干拍照，克隆點(diǎn)計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 MTT實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱量MTT 粉末并用無(wú)菌PBS 溶解，得到5 mg/mL的MTT溶液。收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期且狀態(tài)良好的HN30細(xì)胞，梯度稀釋后以1×103/孔的細(xì)胞密度接種至96孔板，過(guò)夜培養(yǎng)。每孔換新鮮培養(yǎng)液200 μL，并加入相應(yīng)濃度的DTS孵育24 h。孵育結(jié)束，每孔加入20 μL5 mg/mL的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄上清，每孔加入100 μL DMSO，置于水平搖床上，震蕩5～10 min，待孔內(nèi)紫色沉淀充分溶解，酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm 處的A490nm。各組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 凋亡檢測(cè)

收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期且狀態(tài)良好的HN30細(xì)胞，以4×105/孔的細(xì)胞密度接種至12孔板，過(guò)夜培養(yǎng)。每孔換新鮮培養(yǎng)液2 mL，并加入相應(yīng)濃度的DTS孵育24 h。孵育結(jié)束，消化、收集細(xì)胞，冷PBS洗3遍。根據(jù)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書，加入1×binding buffer重懸，轉(zhuǎn)移至流式管中，加入FITC和PI染液避光孵育。流式細(xì)胞儀（LSRFortessaTMX-20；BD Biosciences）上機(jī)檢測(cè)，結(jié)果通過(guò)Flowjo 7.6軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 線粒體膜電位檢測(cè)

收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期且狀態(tài)良好的HN30細(xì)胞，以4×105/孔的細(xì)胞密度接種至12孔板，過(guò)夜培養(yǎng)。每孔換新鮮培養(yǎng)液2 mL，并加入相應(yīng)濃度的DTS孵育24 h。孵育結(jié)束，消化、收集細(xì)胞，冷PBS洗3遍。根據(jù)線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書，配置JC-1染色工作液，避光孵育20 min后，離心，用JC-1染色緩沖液洗3遍，PBS重懸。流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)，結(jié)果通過(guò)Flowjo 7.6軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 Western blot 蛋白印跡分析

1.7.1 蛋白樣品處理 將HN30細(xì)胞以1×106/孔的細(xì)胞密度接種至六孔板，貼壁后加入相應(yīng)濃度的藥物刺激。用RIPA裂解液裂解蛋白，根據(jù)BCA定量結(jié)果調(diào)齊蛋白濃度。

1.7.2 電泳及轉(zhuǎn)膜 配置10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠。電壓80 V至各孔樣品跑齊，調(diào)整電壓為120 V至樣品跑到底。取出蛋白膠，按“纖維墊-濾紙-膠-膜-濾紙-纖維墊”的順序放置，電壓110 V 將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素（NC）膜上。轉(zhuǎn)膜結(jié)束，取出NC膜，在5%的脫脂牛奶中室溫封閉2 h。1×TNET buffer 洗膜，4 ℃下與對(duì)應(yīng)的一抗孵育14 h，1×TNET buffer 洗膜。室溫孵育二抗2 h，1×TNET buffer 洗膜?，F(xiàn)配ECL 顯影液，使用Bio-Rad 凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行條帶顯色和拍照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本研究各實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3次重復(fù)，數(shù)據(jù)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，作圖與分析采用Graph Pad Prim 5軟件，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DTS抑制頭頸癌細(xì)胞增殖

克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，DTS結(jié)構(gòu)如圖1A所示，在DTS刺激下，與溶劑對(duì)照組相比，不同頭頸癌細(xì)胞株HN30、HN12和SCC25的增殖能力均被抑制，且隨DTS濃度增加，克隆點(diǎn)的數(shù)目逐漸減少（圖1B）。對(duì)HN30細(xì)胞的克隆點(diǎn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，1 μmol/L DTS 作用下，HN30 增殖幾乎被完全抑制（圖1C，P<0.001）。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同濃度DTS刺激HN30細(xì)胞24 h后，細(xì)胞活力顯著降低（圖1F，P<0.01），呈現(xiàn)劑量依賴性。

2.2 DTS誘導(dǎo)HN30細(xì)胞凋亡

DTS刺激HN30細(xì)胞24 h，凋亡細(xì)胞比例顯著增多（圖2A）。對(duì)第一象限及第四象限的凋亡細(xì)胞進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析顯示，DTS能夠誘導(dǎo)HN30細(xì)胞凋亡，且具有劑量依賴性（P<0.05，圖2B）。

2.3 DTS誘導(dǎo)HN30細(xì)胞線粒體膜電位降低

當(dāng)細(xì)胞發(fā)生線粒體依賴性的早期凋亡，線粒體膜電位下降，JC-1探針由聚合物（紅色熒光）轉(zhuǎn)變?yōu)閱误w（綠色熒光）。在DTS刺激下，呈綠色熒光的細(xì)胞群體（右下）比例增多（圖3A），對(duì)JC-1單體比例進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析顯示，隨DTS濃度升高，JC-1單體比例逐漸增多（P<0.01，圖3B）。

圖3 DTS誘導(dǎo)HN30細(xì)胞線粒體膜電位降低Fig.3 DTS reduces mitochondrial membrane potential in HN30 cells.A:JC-1 fluorescent probe staining for detecting mitochondrial membrane potential of HN30 cells treated with 3,10,and 30 μmol/L DTS for 24 h;B:Percentages of JC-1 monomer cells.**P<0.01,***P<0.001 vs the solvent control group.

2.4 DTS調(diào)控HN30細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

不同濃度的DTS刺激HN30細(xì)胞24 h后，caspase-3表達(dá)降低，有活性的cleaved caspase-3表達(dá)升高，而Bcl-2含量顯著降低（圖4A）。分別對(duì)caspase-3、cleaved caspase-3和Bcl-2的蛋白條帶進(jìn)行灰度分析，結(jié)果顯示，DTS能夠調(diào)控HN30細(xì)胞的凋亡信號(hào)通路，誘導(dǎo)凋亡蛋白酶cleaved caspase-3 的表達(dá)，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)（P<0.05，圖4BC）。

圖4 DTS調(diào)控HN30細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)Fig.4 DTS regulates the expression of apoptosis-related proteins in HN30 cells.A:Western blot analysis of the expression of caspase-3,cleaved caspase-3 and Bcl-2 in HN30 cells after treatment with DTS(3,10,30 and μmol/L)for 24 h.B,C:Quantification of the protein expressions.*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001 vs the solvent control group.

2.5 DTS能夠抑制HN30細(xì)胞中Akt的磷酸化并激活p53通路

通過(guò)Western blot 檢測(cè)Akt 及p53 蛋白的變化，10 μmol/L DTS 刺激HN30 細(xì)胞，在不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)HN30細(xì)胞Akt及p53的表達(dá)，結(jié)果顯示，DTS刺激下，HN30 細(xì)胞Akt 磷酸化（Ser 473）降低，p53 磷酸化（Ser 15）增強(qiáng)，在16 h作用顯著（圖5A）。分別對(duì)Akt及p53的總蛋白水平和磷酸化水平進(jìn)行灰度分析，結(jié)果顯示，隨著DTS作用時(shí)間延長(zhǎng)，HN30細(xì)胞的Akt磷酸化被抑制，而p53磷酸化被激活（P<0.05，圖5B、C）。

圖5 DTS能夠抑制HN30細(xì)胞中Akt的磷酸化并激活p53通路Fig.5 DTS inhibits the phosphorylation of Akt and activates p53 pathway in HN30 cells.A:Western blot analysis of the phosphorylation level of Akt and p53 after treatment with DTS(10 μmol/L)for 0.5,1,2,4,8,and 16 h.B-D:Quantification of the protein expressions.*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001 vs the 0 h group.

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)活性含硫化合物DTS對(duì)頭頸癌HN30細(xì)胞具有顯著的增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)作用。DTS刺激后，HN30細(xì)胞中cleaved caspase-3蛋白呈劑量依賴性增加，Bcl-2蛋白呈劑量依賴性降低；同時(shí)，隨著DTS作用時(shí)間延長(zhǎng)，Akt磷酸化受到抑制，p53的磷酸化水平增加。這些結(jié)果表明DTS在HN30細(xì)胞中具有顯著的抗腫瘤活性。

DTS是從藥用植物Petiveria alliacea L中分離出的一種多硫化物，早期被報(bào)道具有抗病毒、消炎鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)等作用［14］，但是針對(duì)單體化合物DTS的抗腫瘤作用機(jī)制研究較少，本研究旨在探討DTS單體化合物的抗腫瘤作用。已有文獻(xiàn)報(bào)道，作為特異性RSK激酶抑制劑，WST-1初步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)DTS對(duì)肺癌、乳腺癌及胰腺癌細(xì)胞具有體外抗增殖作用［8］。與本研究結(jié)果相似，DTS在頭頸癌中也被證實(shí)具有抗增殖活性，但本研究發(fā)現(xiàn)DTS 還具有顯著的凋亡誘導(dǎo)作用，進(jìn)一步確證了DTS對(duì)頭頸癌的抗腫瘤作用。目前，針對(duì)DTS抗腫瘤作用的機(jī)制研究很少，深入探尋其作用靶點(diǎn)十分必要。有研究表明DTS能減弱神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞中絲裂原活化蛋白激酶MAPK（Erk1/2）酪氨酸殘基的去磷酸化，造成細(xì)胞微管解聚并抑制神經(jīng)突觸生長(zhǎng)［15］。研究顯示，DTS的類似物雙（4-氟芐基）三硫化物通過(guò)共價(jià)結(jié)合β-微管蛋白Cys 12殘基，直接抑制微管聚合，導(dǎo)致微管穩(wěn)定性的破壞，從而阻滯細(xì)胞的G2/M期［16］。與已有研究不同，本研究通過(guò)時(shí)間依賴性實(shí)驗(yàn)證實(shí)DTS可能影響Akt和p53蛋白的磷酸化，在頭頸癌HN30細(xì)胞中發(fā)揮作用，并且其凋亡誘導(dǎo)與線粒體膜電位降低相關(guān)，進(jìn)一步豐富了DTS在抗腫瘤機(jī)制方面的研究結(jié)果。

Akt參與調(diào)節(jié)細(xì)胞存活、增殖、生長(zhǎng)、凋亡、糖原代謝等多過(guò)程，具有廣泛的生物學(xué)活性，研究發(fā)現(xiàn)Akt的磷酸化影響了多種腫瘤細(xì)胞的凋亡、遷移［17］。對(duì)大腸癌患者的結(jié)直腸組織的分析結(jié)果顯示p-Akt表達(dá)的上調(diào)與腫瘤發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［18］。在HER2陽(yáng)性乳腺癌中，p-AKT的高基礎(chǔ)水平表達(dá)與腫瘤進(jìn)展和耐藥性相關(guān)［19］。本研究中，DTS刺激不同時(shí)間收集HN30細(xì)胞蛋白，通過(guò)免疫印跡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Akt總蛋白水平未見明顯差異，但p-Akt表達(dá)量明顯抑制，證實(shí)DTS對(duì)于HN30細(xì)胞的抗腫瘤活性與p-Akt的抑制相關(guān)。

腫瘤抑制蛋白p53調(diào)控細(xì)胞凋亡、周期及DNA損傷修復(fù)過(guò)程，在惡性腫瘤的發(fā)展和進(jìn)程中起著至關(guān)重要的作用，因本身基因突變或激活機(jī)制缺陷，p53在多種腫瘤中處于功能喪失狀態(tài)，因此靶向p53成為目前腫瘤治療的熱點(diǎn)［20-22］。本研究中，DTS作用后，p53總蛋白及p53磷酸化均顯著增加，表明DTS通過(guò)促進(jìn)p53的磷酸化，激活p53功能從而影響了HN30細(xì)胞的增殖和凋亡。

本研究發(fā)現(xiàn)DTS能夠有效抑制頭頸部鱗狀癌細(xì)胞HN30的增殖，并激活凋亡相關(guān)信號(hào)通路以線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制與Akt/p53信號(hào)通路相關(guān)。該發(fā)現(xiàn)揭示了DTS作為潛在抗腫瘤活性藥物可能的作用機(jī)制和靶點(diǎn)，同時(shí)也為頭頸癌的治療提供了參考依據(jù)。