朱 緩，孫婷婷，王圓圓，王 鐵，馬彩云，王春景，劉長青，郭 俁

蚌埠醫(yī)學(xué)院1檢驗醫(yī)學(xué)院，2生命科學(xué)學(xué)院，安徽 蚌埠 233000

2006年，有研究將4種轉(zhuǎn)錄因子Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4轉(zhuǎn)入成年小鼠皮膚成纖維細胞，獲得與胚胎干細胞特征類似的細胞，并具有自我更新能力和多向分化潛能，命名為“誘導(dǎo)多能干細胞”（iPSCs）［1］。該技術(shù)是近年來干細胞領(lǐng)域中一個里程碑式的突破，它解決了干細胞應(yīng)用由來已久的倫理學(xué)和免疫排斥等問題，具有無窮的開發(fā)潛力。

帕金森綜合癥（PD）的生化和病理改變不僅僅是由于黑質(zhì)紋狀體多巴胺能神經(jīng)元缺失，可能與腦內(nèi)重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)GABA 的缺失也存在很大關(guān)系［2-3］。Martinez-Cerdeno實驗組將胚胎來源的GABA能神經(jīng)元前體移植到帕金森大鼠紋狀體，75%移植細胞能分化為GABA能神經(jīng)元，整合到宿主紋狀體回路中，發(fā)揮功效改善帕金森大鼠運動行為［4］，但有限的胚胎組織來源限制了其應(yīng)用。iPSCs可以分化為各種組織細胞，使無限制備各種供體細胞成為可能［5-8］。因此iPSCs來源的GABA能神經(jīng)元前體用于帕金森病等神經(jīng)退行性疾病的治療，具有極大的應(yīng)用前景［9-10］。

近年來，多能干細胞定向分化研究取得了顯著進展。Goulburn 等［11］將人胚胎干細胞（hESCs）分化為GABA能神經(jīng)元前體，并提出維甲酸和成纖維細胞生長因子2（FGF2）在干細胞誘導(dǎo)GABA能神經(jīng)元前體中發(fā)揮重要作用，但該方法誘導(dǎo)的前體細胞效率低，僅占總細胞數(shù)的10%。2012年，研究發(fā)現(xiàn)SHH信號在誘導(dǎo)的前腦腹側(cè)NKX2.1+表達中起關(guān)鍵作用，他們采用改良的單層神經(jīng)分化方案，輔以SHH處理，提高誘導(dǎo)效率，證明了腹側(cè)前體細胞的產(chǎn)生數(shù)量隨SHH劑量的增加而增加［12］。2013年，學(xué)者相繼報道了從人誘導(dǎo)多能干細胞（hiPSCs）產(chǎn)生前腦GABA能神經(jīng)元前體的方法，但這些方法需要多種小分子和/或生長因子的組合（SB431542+LSB+XAV939+SHH+Purmorphamine）或（SB431542+BMPRIA-Fc+Dkk1+Purmorphamine+Y27632），增加了實驗成本和可變性［13-14］。同年，有研究僅使用高濃度的SHH或Pur激活hedgehog途徑，就能將hiPSCs 分步誘導(dǎo)分化為高純度的GABA能神經(jīng)元前體（大于90%）［15］。隨后相繼出現(xiàn)許多可以獲得成熟GABA能神經(jīng)元前體的分化方案［16-17］，但是依然存在分化過程繁瑣、耗時長等問題。2016年，有研究利用慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法，僅需7 d就能高效地將hiPSCs誘導(dǎo)成GABA能神經(jīng)元［18］，此法體系為之后GABA能神經(jīng)元的研究提供了很好的參考。

五指山小型豬來源的神經(jīng)元在生理和生物學(xué)特性等方面與人類神經(jīng)元具有高度相似性［19］。因此，豬來源細胞替代人類細胞，可能是一種有吸引力的異種神經(jīng)移植供體材料［20］。目前五指山小型豬模型已被廣泛應(yīng)用于人類神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究，但建立成熟豬GABA能神經(jīng)元前體的報道卻十分有限，因此亟須建立一個成熟的豬GABA能神經(jīng)元前體的體外分化體系。本研究首次成功建立豬iPSCs到GABA能神經(jīng)元前體的分化體系，并通過定向移植PD大鼠黑質(zhì)紋狀體區(qū)，觀察移植細胞存活和分化情況，為研究PD的發(fā)病機制和探索新的治療方法提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細胞系

豬iPS 細胞系由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所關(guān)偉軍教授惠贈；飼養(yǎng)層細胞（賽業(yè)生物科技公司）。

1.2 實驗動物

30只健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，約6周齡，體質(zhì)量180～220 g，由安徽醫(yī)科大學(xué)提供。清潔級動物房中飼養(yǎng)，環(huán)境溫度控制在26 ℃，飼養(yǎng)密度≤4只/盒，定期更換墊料，自由活動。高溫消毒飲水墊料，喂食商品化的顆粒飼料。

1.3 主要試劑

DMEM高糖培養(yǎng)基購自Hyclone，DMEM/F12培養(yǎng)基、非必需氨基酸（NEAA）、L-谷氨酰胺、β-巰基乙醇、Knockout 血 清 替 代 物、B27（Without VitaminA）、Laminin（Gibco），胎牛血清（Lonsa science srl），堿性成纖維細胞生長因子（FGF2,R&D），DMH1（TocrisBioscience），N2（Gemini），Poly-l-ornithine hydrobromide（PLO）、IV型膠原酶、6-羥基多巴胺（6-OHDA）、阿撲嗎啡（APO）（Sigma），肝 素（MCE），SB431542（StemGent），Purmorphamine（Millipore），兔抗Oct4、鼠抗SSEA1、鼠抗TRA-160、鼠抗Nestin、兔抗Sox2、兔抗PAX6、鼠抗Tuj1、兔 抗FOXG1 購 自Abcam，鼠 抗NKX2.1（Chemicon,Millipore），兔抗Nanog（CST），驢抗兔Cy3（Jackson Lab），驢抗鼠Alexa Fluor 488、CM-DiI、抗熒光淬滅封片劑（Invitrogen），維生素C（BioShap），DAPI染液（碧云天），Albumin Bovine（BSA,Solarbio。

1.4 五指山小型豬iPS細胞的傳代培養(yǎng)

復(fù)蘇五指山小型豬iPS細胞系（iPSCs），接種于飼養(yǎng)層細胞（γ射線輻照小鼠胚胎成纖維細胞）上，采用ES培養(yǎng)基培養(yǎng)，2 d/次更換培養(yǎng)液。

1.5 豬iPSCs表型鑒定及遺傳學(xué)特征檢測

豬iPSCs的多能性檢測利用免疫熒光技術(shù)對豬iPS細胞克隆多潛能性標(biāo)記分子SSEA1、OCT4、Nanog和TRA-160的表達進行特異性檢測。豬iPSCs的染色體G顯帶核型分析豬iPSCs處于增殖期時，按照染色體核型制備標(biāo)準(zhǔn)方法進行低滲、固定并滴片，Giemsa染色后，在油浸物鏡下觀察到100個擴散良好的中期分裂相，并進行核型分析［21］。

1.6 豬iPSCs向GABA能神經(jīng)元前體分化

1.6.1 豬iPSCs誘導(dǎo)為原始神經(jīng)上皮細胞（iNECs）豬iPSCs克隆長滿飼養(yǎng)層后，用IV型膠原酶消化收集細胞，加1 mL iPS培養(yǎng)基（不含F(xiàn)GF2）重懸后，將細胞轉(zhuǎn)入六孔板中，置37 ℃，5%CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d，2 d/1次換液。當(dāng)細胞聚集形成類胚體（EBs）時，更換為神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基NIM（SB431542、DMH1、FGF2）繼續(xù)培養(yǎng)3 d。第7 天，使用NIM 培養(yǎng)基（含10% FBS）將EBs 接種至PLO-laminin包被的六孔板，過夜培養(yǎng)后更換NIM培養(yǎng)基。在分化的第12天左右觀察EBs形態(tài)，用免疫熒光技術(shù)檢測表面特異性抗原SOX2、PAX6、Nestin與Tuj1表達。

1.6.2 iNECs誘導(dǎo)為GABA能神經(jīng)元前體吸棄培養(yǎng)基，向誘導(dǎo)原始神經(jīng)上皮細胞（iNECs）中加入IV型膠原酶1 mL，置37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中消化5 min，拍打至細胞團飄起，加1 mL培養(yǎng)基（含10%FBS）終止消化，移至15 mL 離心管，靜置5 min，去上清。加1 mL 的NIM（Pur、B27）培養(yǎng)基重懸細胞并移至新六孔板，懸浮培養(yǎng)9 d，2 d/次更換培養(yǎng)基。取神經(jīng)球至15 mL離心管，靜置5 min后去上清，加1 mLTrypLE 置于37 ℃，5%CO2的培養(yǎng)箱消化5 min，加入1 mL培養(yǎng)基（含10%FBS）終止消化，移至15 mL 離心管，1000 r/min，離心5 min，去上清。加NDM 培養(yǎng)基重懸成單細胞，接種于PLOLaminin包被的玻片（Cover Slip），每個玻片約10 000個細胞。置于37 ℃，5%CO2的培養(yǎng)箱過夜，次日用免疫熒光法檢測特征性蛋白NKX2.1和FOXG1。

1.7 豬iPSCs、iNECs和iGABA能神經(jīng)元前體表面特征性抗原的免疫熒光檢測

用4%多聚甲醛固定玻片上的細胞18 min，用0.2%Triton X-100 滲透8 min，之后用2%胎牛血清白蛋白（BSA）和10%驢或羊血清在室溫下封閉50 min［12］。通過以下一抗與標(biāo)本孵育4 ℃過夜，細胞多潛能標(biāo)志物：SSEA1（1∶200）、Oct4（1∶200）、Nanog（1∶200）、TRA-160（1∶200）；神經(jīng)元標(biāo)志物：鼠抗Nestin（1∶200）、兔抗Sox2（1∶300）、兔抗PAX6（1∶50）、MTUJ1（1∶300）；GABA 神經(jīng)元前體標(biāo)志物：鼠抗NKX2.1（1∶500）、兔抗FOXG1（1∶500）。次日，在避光、室溫條件下與二抗Alexa Fluor 488（1∶500）或Cy3（1∶800）孵育1 h后，用碘化丙啶（PI）或4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）復(fù)染細胞核10 min，共聚焦顯微鏡觀察（Olympus，F(xiàn)V-1200MPE SHARE）發(fā)光情況。

1.8 豬iPSCs-iGABA神經(jīng)元前體定向移植帕金森大鼠

將大鼠深度麻醉后，頭部用腦立體定位儀固定，采用6-OHDA 單側(cè)毀損法制備穩(wěn)定的PD 模型大鼠（圖6A），以冠狀縫和矢狀縫相交點即為前囟點，參考大鼠腦立體定位圖譜，確定SD大鼠右側(cè)前腦內(nèi)側(cè)束損傷位點：（1）AP-4.4 mm，ML-1.2 mm，DV-7.8 mm；（2）AP-4.0 mm，ML-0.8 mm，DV-8.0 mm，分別向這兩個預(yù)定靶點注入6-OHDA 4 μL（圖6B）。術(shù)后2周，腹腔注射APO（0.5 mg/kg）誘發(fā)大鼠的旋轉(zhuǎn)行為，以大鼠旋轉(zhuǎn)數(shù)≥210 r/30 min為建模成功的標(biāo)準(zhǔn)。將生長狀態(tài)良好的豬iGABA神經(jīng)元前體經(jīng)CM-DiI標(biāo)記（紅色熒光，圖6A），細胞濃度約為1.5×107/mL，采用PD模型相同的坐標(biāo)，將細胞立體定向移植入PD大鼠腦內(nèi)黑質(zhì)-紋狀體束。

1.9 行為學(xué)與免疫熒光檢測

APO誘導(dǎo)旋轉(zhuǎn)實驗：移植細胞8周后，APO誘導(dǎo)大鼠30 min內(nèi)旋轉(zhuǎn)的圈數(shù)與實驗組相比較，觀察治療組大鼠的運動功能改善情況。曠場實驗：將大鼠放入曠場箱中央格內(nèi)，迅速拉上周圍布簾，系統(tǒng)自動捕捉大鼠5 min內(nèi)的活動情況并分析其在中央格的逗留時間、運動總距離以及直立次數(shù)。選取移植細胞8周后大鼠，心臟灌注取腦后冰凍切片，用2%BSA、10%驢或羊血清和0.2%Triton X-100封閉1 h。加入稀釋過的一抗TH（1∶300）與GABA（1∶100），4 ℃孵育過夜。避光、室溫與Alexa Fluor 488（1∶500）或Cy3（1∶800）標(biāo)記的二抗孵育1 h。DAPI復(fù)染后，滴加適量抗熒光淬滅劑，封片，激光共聚焦顯微鏡觀察（Olympus，F(xiàn)V-1200MPE SHARE）。

2 結(jié)果

2.1 豬iPSCs形態(tài)特點及多能性鑒定

豬iPSCs呈典型的團狀克隆生長，呈圓形或橢圓形，細胞核大漿小，邊緣有較為清晰的界限，中央逐漸突起，倒置顯微鏡下觀察立體感更強，細胞排列更緊密（圖3A）。免疫熒光結(jié)果顯示，豬iPSCs高表達多能性標(biāo)記Nanog、OCT4、SSEA1和TRA-160（圖1A）。染色體G顯帶結(jié)果驗證了豬的染色體數(shù)目2n=38條，且形態(tài)正常（圖1B）。

圖1 豬iPSCs生物學(xué)特征鑒定Fig.1 Biological characteristics of miniature-swine iPSCs.A:Immunofluorescence detection of pluripotent markers of miniature-swine iPSCs(Original magnification:×100).B:G-band staining of miniature-swine iPSCs.

2.2 豬iPSCs-NECs誘導(dǎo)與特征檢測

豬iPSCs誘導(dǎo)分化為GABA能神經(jīng)元前體遵循兩個階段（圖2），第1階段，將豬iPSCs誘導(dǎo)分化為原始神經(jīng)上皮細胞（iNECs）。第2階段，繼續(xù)將iPSCs-NECs誘導(dǎo)分化形成GABA能神經(jīng)元前體細胞。

圖2 豬iPSCs-GABA神經(jīng)元前體的時間軸Fig.2 Timeline of generation of forebrain GABAneural progenitors.

豬iPSCs形成的類胚體呈球形，胚體飽滿，細胞間緊密粘附（圖3B）。第12天鏡下觀察到每個EB發(fā)育成一個集落，集落中包含典型玫瑰花結(jié)式的神經(jīng)管樣“rosette”結(jié)構(gòu)，即為誘導(dǎo)原始神經(jīng)上皮細胞（iNECs）（圖3C）。

圖3 豬iPSCs-GABA能神經(jīng)元前體各階段細胞的形態(tài)變化Fig.3 Morphological changes of miniature-swine iPSCs-GABA progenitors at different stages.A:Phase contrast images of iPSCs.B:iPSCs form embryoid bodies(EBs)in suspension culture for the first 6 days.C:On day 12,each EB develops into a colony containing neuroepithelial cells in the form of rosettes;D:On day 14,the rosette-containing colonies are detached and grown in suspension to form neuroepithelial spheres(NS).E:iPSCs-GABAprogenitors are induced.

免疫熒光染色結(jié)果顯示，分化得到的“rosette”樣結(jié)構(gòu)能夠表達神經(jīng)上皮細胞標(biāo)記物PAX6、SOX2、Nestin以及神經(jīng)微管蛋白標(biāo)記Tuj1，具有神經(jīng)上皮細胞特征（圖4）。

圖4 豬iPSCs-原始神經(jīng)上皮細胞表面標(biāo)志物的表達及量化Fig.4 Expression of surface markers of miniature-swine iPSCs-iNECs.A:NECs induced from miniature-swine iPSCs express SOX2,Nestin,PAX6 and TUJ1.B:Expression of specific markers of iPSCs-iNECs analyzed by flow cytometry.

2.3 豬iPSCs-NECs-iGABA 能神經(jīng)元前體的誘導(dǎo)及鑒定

將豬iPSCs-NECs更換含有高濃度Pur的NIM培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)，形成神經(jīng)上皮球（NS）（圖3D），第21天誘導(dǎo)成GABA能神經(jīng)元前體（圖3E）。經(jīng)免疫熒光染色結(jié)果顯示，90%以上的細胞誘導(dǎo)成為NKX2.1+和FOXG1+的iGABA神經(jīng)元前體細胞（圖5）。

圖5 豬iPSCs-前腦GABA能神經(jīng)元前體表面標(biāo)志物的表達及量化Fig.5 Characteristics of miniature-swine iPSCs-iGABA progenitors.A:The induced iPSCs-GABA progenitors are positive for the forebrain marker FOXG1 (red) and GABA progenitor marker NKX2.1(green).B:More than 90%of the cells are positive for NKX2.1 and FOXG1.C:Expression of FOXG1 and NKX2.1 analyzed by flow cytometry.

2.4 iPSCs-GABA能神經(jīng)元前體對PD模型大鼠的修復(fù)效應(yīng)

6-OHDA單側(cè)毀損法建模成功的SD大鼠（圖6A、B）在APO誘導(dǎo)旋轉(zhuǎn)實驗中表現(xiàn)出壓尾、弓背、嗅探等行為，并出現(xiàn)以左后肢為支點，不斷地向損傷對側(cè)旋轉(zhuǎn)的行為，轉(zhuǎn)圈數(shù)≥210 r/30 min。與模型組相比（n=10），iPSCs-GABA能神經(jīng)元前體移植8周后，APO誘導(dǎo)的旋轉(zhuǎn)行為顯著減少（P<0.01，n=12，圖6C），此外，GABA前體細胞移植后的大鼠比PD模型組更興奮、更活躍，曠場運動總距離顯著增加（P<0.01，圖6D）。

圖6 細胞移植帕金森大鼠行為學(xué)測試及量化Fig.6 Behavioral test of Parkinson's disease rat models before and after cell transplantation.A:iPSCs-iGABA progenitors were labeled with Cell Tracker CM-DiI before transplantation (×100).B:Two coordinates were identified in the ipsilateral right striatum during cell transplantation and establishment of PD model.C:Ipsilateral rotation in APO test;D:Heat maps of open field assay.*P<0.01.

大鼠腦組織冰凍切片免疫熒光檢測結(jié)果顯示，移植后8 周，70%以上的GABA 能神經(jīng)元前體細胞表達GABA+（圖7）。此外，CM-DiI標(biāo)記的細胞形成了明顯的移植物區(qū)域，而且許多CM-DiI標(biāo)記的細胞，TH染色也呈陽性，TH+細胞團散布于移植物各處，并整合于宿主紋狀體（圖7）。

圖7 豬iPSCs-iGABA能神經(jīng)元前體在大鼠腦內(nèi)的存活、分化Fig.7 Survival and differentiation of MiPSCs-iGABAprogenitors in vivo(×200).

3 討論

目前，iPSCs的體內(nèi)試驗多局限于大小鼠，但是大小鼠無論在生理生化特征還是免疫特性上和人類都有很大的區(qū)別，尤其是對脊髓損傷與神經(jīng)退行性病變，嚙齒類模型往往不能有效地模擬疾病。并且能夠?qū)崿F(xiàn)長時間實驗追蹤的醫(yī)學(xué)模型，大小鼠并不是最佳選擇。為了實現(xiàn)大小鼠和人之間的過渡，我們注意到另外一種模式生物-豬，五指山小型豬的器官和人類器官大小相近，解剖生理、血液指標(biāo)、免疫功能及50多項生理生化指標(biāo)近似人類，被用作皮膚科或心臟科的供體材料，更適合作為人類疾病研究的動物模型［20,22］。同時研究發(fā)現(xiàn)，豬和人的誘導(dǎo)多能干細胞系在維持多能性方面的信號通路具有相似性［23-24］。

GABA能神經(jīng)元屬于抑制性神經(jīng)元，它的丟失會導(dǎo)致一些神經(jīng)系統(tǒng)疾?。?5］。以細胞為基礎(chǔ)治療，旨在替代這些功能失調(diào)或受損的抑制細胞。本試驗在Liu等［15］的研究基礎(chǔ)上，首次成功建立豬iPSCs到GABA能神經(jīng)元前體的分化體系。豬iPSCs經(jīng)歷21 d包括兩個不同的分化階段后分化形成GABA能神經(jīng)元前體。本實驗還發(fā)現(xiàn)經(jīng)過PLO和Laminin雙重包被的培養(yǎng)皿、適當(dāng)?shù)募毎臃N密度將極大的提高存活率。這種無血清的分化體系，與之前的分化體系相比較，過程更簡單，耗時更短。與Sun等［18］利用慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)將iPSCs誘導(dǎo)成GABA能神經(jīng)元的方法相比，本實驗采用在培養(yǎng)基中添加小分子化合物組合誘導(dǎo)法，既避免了使用病毒載體可能產(chǎn)生的外源基因插入，又提高了誘導(dǎo)效率，具有更高的生物安全性和應(yīng)用潛力。

基于豬iPSCs的生長特性，本實驗在Liu等［15］的研究基礎(chǔ)上作了適當(dāng)?shù)恼{(diào)整：第1階段，豬iPSCs形成EBs后，使用NIM培養(yǎng)基（含SB431542、DMH1、FGF2）成功誘導(dǎo)分化獲得NECs，發(fā)現(xiàn)NIM（10%FBS）培養(yǎng)基更容易使EBs貼壁，并且培養(yǎng)時間由5～8 h延長至過夜，而適當(dāng)密度接種細胞以及PLO-Laminin雙包被培養(yǎng)皿，可增強NECs的黏附性；第2階段，形成神經(jīng)球后，使用NIM培養(yǎng)基（含Pur、B27）誘導(dǎo)得到GABA能神經(jīng)元前體，并表達其特異性標(biāo)志物，說明豬iPSCs成功分化為前腦GABA能神經(jīng)元前體。第2階段是本誘導(dǎo)方法最關(guān)鍵的部分，通過高濃度的Pur，激活hedgehog通路［15,26］，前腦內(nèi)NKX2.1+細胞的數(shù)量和Pur的濃度呈劑量依賴性［12］。同時，為了維持特定神經(jīng)前體的前腦同一性，要避免常用的神經(jīng)誘導(dǎo)劑如維甲酸或有絲分裂原如（FGF2），因為它們在不同程度上尾化神經(jīng)上皮［27］。

將豬iPSCs-iGABA能神經(jīng)元前體移植到6-OHDA損毀的大鼠黑質(zhì)紋狀體8周后，可以明顯恢復(fù)PD大鼠的運動功能障礙與神經(jīng)功能。而且，移植8周后，70%的iGABA能神經(jīng)元前體細胞表達GABA，這些GABA能神經(jīng)元可能負責(zé)調(diào)控紋狀體興奮性和抑制性信號的平衡，從而產(chǎn)生行為改變。此外，部分移植細胞分化為TH+神經(jīng)元，TH在多巴胺的生物合成中起著重要的調(diào)節(jié)作用。供體源性TH+細胞（DA神經(jīng)元）的成熟和增加以及與宿主腦之間突觸的形成可能有助于功能恢復(fù)。因此，PD大鼠的行為改善可能與紋狀體多巴胺能神經(jīng)元、GABA能神經(jīng)元的聯(lián)合作用有關(guān)。

綜上所述，本研究通過分步誘導(dǎo)法，成功將豬iPSCs誘導(dǎo)形成前腦GABA能神經(jīng)元前體細胞，將其移植至PD大鼠腦黑質(zhì)紋狀體區(qū)，能夠分化為功能性神經(jīng)元，改善PD大鼠的運動功能障礙。豬iPSCs-iGABA能神經(jīng)元前體的成功獲取為帕金森病的治療提供重要的細胞來源。