曹俊昌 劉啟鴻 林國晟 林 琳 胡艷紅 陳 勝*

(1.福建中醫(yī)藥大學(xué) 福建福州 350122；2福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院 福建福州 350003)

白內(nèi)障是指衰老、理化損傷、代謝、發(fā)育或免疫相關(guān)疾病等多因素直接或間接促使晶狀體混濁而導(dǎo)致視力下降的一種疾病，是全球主要的致盲性疾病之一[1]。大多數(shù)老年性白內(nèi)障病情分期發(fā)展緩慢，而視力的低下會(huì)給患者生活及工作造成極大困擾。對(duì)于早期老年性白內(nèi)障患者并不建議手術(shù)治療，目前臨床上西藥防治老年性白內(nèi)障如吡諾克辛鈉眼液[2]尚未獲得滿意的療效，人們已將目光投向中草藥。為此，找尋有效的藥物防治老年性白內(nèi)障并探討其作用機(jī)制的意義尤為重大。

車前子是記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》的利水滲濕藥，具有清熱利尿、滲濕通淋、明目、祛痰的功效?！端幮哉摗分刑峒捌淠苋ワL(fēng)毒，肝中風(fēng)熱，毒風(fēng)沖眼目，赤痛障翳，腦痛淚出，去心胸?zé)?。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)車前子可以減輕晶狀體的氧化損傷治療白內(nèi)障[3]，但其具體作用成分和介導(dǎo)的信號(hào)通路尚不清楚。因此，本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法收集車前子的活性成分和潛在靶點(diǎn)，聚焦白內(nèi)障的疾病靶點(diǎn)，構(gòu)建車前子治療白內(nèi)障的“化學(xué)成分-靶點(diǎn)-信號(hào)通路”網(wǎng)絡(luò)，為車前子治療白內(nèi)障的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制研究提供一定的參考。

一、材料與方法

（一）車前子的活性成分及基因靶點(diǎn)篩選

通過中藥成系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平（TCMSP）（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmspsearch.php）獲取車前子中口服生物利用（OB）≥30%和藥物相似（DL）≥0.18中藥活性成分；隨后從TCMSP數(shù)據(jù)庫中獲得車前子有效成分靶點(diǎn)，并將篩選到的靶點(diǎn)通過Uniprot（http：//www.uniprot.org/）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因注釋。

（二）白內(nèi)障靶點(diǎn)的篩選

以“白內(nèi)障”英文名為關(guān)鍵詞，利用Genecards（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmspsearch.php）數(shù)據(jù)庫和人類孟德爾遺傳綜合數(shù)據(jù)（OMIM）（http：//www.omim.org/）數(shù)據(jù)庫獲取白內(nèi)障的相關(guān)疾病靶點(diǎn)。

（三）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

通過CytosCape3.5.1（http：//www.cytoscape.org/）軟件構(gòu)建疾病-成分-靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)。將車前子活性成分-白內(nèi)障靶點(diǎn)導(dǎo)STRING平臺(tái)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，限定物種為“Homo sapiens”，設(shè)置最低相互作用閾值為“medium confidence（0.400）”，其余參數(shù)保持默認(rèn)設(shè)置。以PPI網(wǎng)絡(luò)連線的粗細(xì)代表相互作用的強(qiáng)弱，靶點(diǎn)的度（Degree）表示相互作用的靶點(diǎn)個(gè)數(shù)。

（四）GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

采用DAVID 6.8數(shù)據(jù)（https：//david.neiferf.gov/）進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，DAVID平臺(tái)列表與背景均設(shè)置為“Homo sapiens”。

二、結(jié)果

（一）藥效成分篩選結(jié)果

通過篩選共得出車前子治療白內(nèi)障5個(gè)藥效成分（詳見表1）

（二）藥效成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)預(yù)測

通過篩選得出車前子的有效活性成分作用靶點(diǎn)共150個(gè)。通過Genecards和OMIM系統(tǒng)共得到3486個(gè)與白內(nèi)障相關(guān)基因，作為疾病候選靶點(diǎn)基因。

（三）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

1.“成分-靶點(diǎn)-疾病”交互作用網(wǎng)絡(luò)

如圖1，該網(wǎng)絡(luò)共包含了96個(gè)節(jié)點(diǎn)，其中91個(gè)綠色代表藥物/成分直接作用的疾病靶標(biāo)，5個(gè)紫色代表藥物/成分。

圖1 “成分-靶點(diǎn)-疾病”交互作用網(wǎng)絡(luò)

2.靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)分析

如圖2所示，PPI網(wǎng)絡(luò)包含了90個(gè)靶蛋白節(jié)點(diǎn)，1394條相互作用連線。其中核心基因包括了AKT1、IL6、VEGFA、CASP3、JUN、PYGS2、EGF、MAPK1、EGFR、MMP9、MYC、CXCL8、CCL2、IL1B、FOS、MMP2等（如圖3所示）。

圖2 PPI網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)中核心基因柱狀圖

（四）GO功能富集和KEGG通路富集分析

富集結(jié)果如圖4和圖5所示。在GO功能富集分析過程中，共確定了125條GO條目，其中最主要的20條GO條目如圖4所示，包括了細(xì)胞因子受體結(jié)合、細(xì)胞因子活性、血紅素結(jié)合、四吡咯結(jié)合、受體配體活性、輔助因子結(jié)合、抗氧化活性、轉(zhuǎn)錄因子活性、RNA聚合酶-DNA結(jié)合等。通過KEGG通路富集分析，得到135條相關(guān)通路，其中主要的20條相關(guān)通路如圖5所示。顯示車前子干預(yù)白內(nèi)障可能是參與了晚期糖基化終末產(chǎn)物及其受體系統(tǒng)（AGE-RAGE）信號(hào)通路、流體變應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化通路、腫瘤壞死因子（TNF）信號(hào)通路、白細(xì)胞介素-17（IL-17）信號(hào)通路、人缺氧誘導(dǎo)因子（HIF-1）信號(hào)通路等調(diào)控。

圖4 GO功能富集圖柱狀圖

圖5 KEGG通路富集圖柱狀圖

三、討論

通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)車前子治療白內(nèi)障作用機(jī)制進(jìn)行初步研究，篩選獲得5個(gè)治療白內(nèi)障潛在活性成分，作用于91個(gè)潛在靶點(diǎn)，135條白內(nèi)障信號(hào)通路，包含了細(xì)胞因子、抗氧化等活性調(diào)節(jié)和相關(guān)受體結(jié)合等，通過調(diào)節(jié)AKT1、IL6、VEGFA、CASP3、JUN、PYGS2、EGF、MAPK1、EGFR、MMP9、MYC、CXCL8、CCL2、IL1B、FOS、MMP2等核心基因及AGE-RAGE信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路等發(fā)揮治療白內(nèi)障的作用，初步提示了車前子多成分、多靶點(diǎn)的治療白內(nèi)障作用的特點(diǎn)。

研究已表明AKT、IL-6、EGF、MAPK1、EGFR、MMP9、MYC、IL1B、MMP2等基因在晶狀體上皮細(xì)胞氧化損傷及凋亡中發(fā)揮重要的作用[4][6][7][8][9][10]。前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)車前子可通過抑制晶狀體上皮細(xì)胞的氧化損傷，而發(fā)揮減輕白內(nèi)障的作用。本研究通過PPI網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建發(fā)現(xiàn)車前子可能通過以上多靶點(diǎn)發(fā)揮抗晶狀體上皮細(xì)胞氧化作用。

KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，車前子成分作用的25個(gè)靶點(diǎn)（AKT1、VEGFA、CCND1、BCL2、BAX、MMP2、MAPK1、JUN、IL6、CASP3、PRKCA、STAT1、ICAM1、IL1B、CCL2、SELE、VCAM1、CXCL8、PRKCB、NOS3、THBD、SERPINE1、COL1A1、IL1A、COL3A1）富集于AGE-RAGE信號(hào)通路。晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGES）是由葡萄糖等還原糖類、核酸、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等通過非酶糖基化反應(yīng)生成的終末端產(chǎn)物[11]。在衰老的過程，特別是在糖尿病的情況下，AGES的形成和沉積都會(huì)加速[12]。AGES的沉積能夠加重疾病的發(fā)展。RAGE是AGES最重要的受體，二者間的相互作用參與許多疾病的病理生理學(xué)過程[13]。AGES能夠影響糖尿病并發(fā)癥的病理學(xué)過程是通過在細(xì)胞外基質(zhì)與膠原和纖維連接蛋白等形成交叉復(fù)合物，或者結(jié)合細(xì)胞內(nèi)各種受體蛋白例如RAGE可以導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)或功能的改變，或者上調(diào)某些確定的關(guān)鍵因子如轉(zhuǎn)錄因子[14]。臨床上發(fā)現(xiàn)糖尿病患者并發(fā)白內(nèi)障的機(jī)率較正常人高，本研究提示了基于AGERAGE信號(hào)通路，車前子能夠運(yùn)用于治療糖尿病性白內(nèi)障。

另外，KEGG通路富集還發(fā)現(xiàn)車前子的24個(gè)作用靶點(diǎn)（AKT1、VEGFA、BCL2、FOS、MMP2、MMP9、JUN、HMOX1、CAV1、ICAM1、IL1B、CCL2、SELE、VCAM1、NOS3、PLAT、THBD、IFNG、IL1A、GSTP1、NFE2L2、NQO1、CHUK、GSTM1）富集于流體剪應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣斑塊通路。研究發(fā)現(xiàn)流體剪應(yīng)力可影響血管內(nèi)皮功能進(jìn)而影響高血壓[15]。目前認(rèn)為高血壓患者并發(fā)白內(nèi)障的原因主要是眼周動(dòng)脈在損傷的血管功能下發(fā)生氧化性損傷，并影響到血-房水屏障功能，導(dǎo)致晶狀體營養(yǎng)不良，誘發(fā)白內(nèi)障[16]。由此可知，車前子對(duì)治療高血壓并發(fā)白內(nèi)障可能也具有一定的優(yōu)勢。

四、結(jié)束語

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果初步揭示了車前子以多成分、多靶點(diǎn)、多通路的協(xié)同作用發(fā)揮治療白內(nèi)障的作用，為車前子治療老年病如糖尿病、高血壓并發(fā)白內(nèi)障提供相關(guān)依據(jù)，但這些作用靶點(diǎn)和藥效成分仍需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)相關(guān)驗(yàn)證。