張 大，王真真，劉亞玲，李秀芩

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院小兒外科，河南 鄭州450052)

神經(jīng)母細(xì)胞瘤起源于交感神經(jīng)，是由神經(jīng)嵴細(xì)胞的交感神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常引起的，可以沿交感神經(jīng)節(jié)發(fā)生在任何地方，常表現(xiàn)出腫瘤位置間的異質(zhì)性，其中最常見的位置為腎上腺髓質(zhì)[1-2]。此外，神經(jīng)母細(xì)胞瘤在臨床特征上也具有異質(zhì)性，能夠自行消退和體外誘導(dǎo)分化[3]。在高危組NB患者中，MYCN基因的擴(kuò)增和ALK基因的突變等已經(jīng)被確定為其預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素[4]，盡管有手術(shù)、化療、免疫治療、干細(xì)胞移植等強(qiáng)化治療，高危組神經(jīng)母細(xì)胞瘤患兒總體生存率仍不足一半[5]。C19orf12基因位于第19染色體開放閱讀框12，編碼一種分子量為17 kDa的蛋白質(zhì)，定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體，以及線粒體相關(guān)的膜結(jié)構(gòu)上，參與線粒體的相關(guān)功能。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，C19orf12可能與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，在乳腺癌及卵巢癌中，C19orf12基因呈現(xiàn)出顯著過表達(dá)[6]。之前的研究認(rèn)為線粒體酶的突變是腫瘤細(xì)胞代謝改變的重要驅(qū)動(dòng)因素之一，而C19orf12是定位于線粒體結(jié)構(gòu)上的蛋白[7]，因此也有可能參與了腫瘤代謝調(diào)節(jié)。有研究表明，C19orf12主要通過抑制線粒體的功能及氧化磷酸化，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的糖酵解過程[8]，為其生長(zhǎng)和無限增殖提供能量和原材料，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲性。但關(guān)于C19orf12蛋白與神經(jīng)母細(xì)胞瘤之間的關(guān)系尚未有研究。本研究探索C19orf12蛋白在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中的表達(dá)情況，探討其臨床意義及價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象收集2016年1月至2019年12月在鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院小兒外科病區(qū)就診、行手術(shù)治療，術(shù)后病理提示為神經(jīng)母細(xì)胞瘤的29例患者的臨床資料及手術(shù)切除腫瘤組織標(biāo)本。所有病例均經(jīng)我院病理檢查確診，所有患者腫瘤組織標(biāo)本均經(jīng)患者家屬同意后加入科室標(biāo)本組織庫。術(shù)后隨訪時(shí)間截止至2020年12月。共有失訪13例，其中5例患者失聯(lián)，8例患者死亡，現(xiàn)有16例患者存活。由于本研究的病例樣本數(shù)目較少，失訪病例數(shù)目較多，因此在不影響統(tǒng)計(jì)學(xué)分析的情況下進(jìn)行缺失值的替換，全部納入統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。本研究已經(jīng)獲得我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 C19orf12蛋白檢測(cè)方法所有組織標(biāo)本制作成組織芯片后進(jìn)行切片并行免疫組化染色，染色結(jié)果采用3D-histech數(shù)字病理切片掃描儀掃描分析，分別計(jì)算并分析出測(cè)量區(qū)域內(nèi)陽性的累積光密度值以及陽性面積。以陽性累積光密度值/陽性面積計(jì)算出平均光密度值，反映陽性信號(hào)的平均深淺，即目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 C19orf12蛋白表達(dá)與神經(jīng)母細(xì)胞瘤特征之間的關(guān)系C19orf12蛋白表達(dá)與神經(jīng)母細(xì)胞瘤分期(Z=2.483，P=0.013)、危險(xiǎn)度分層(Z=2.141，P=0.032)、腫瘤直徑(Z=2.181，P=0.029)有關(guān)，而與MYCN基因是否擴(kuò)增(Z=1.635，P=0.102)、確診年齡(Z=0.415，P=0.678)、是否存在骨轉(zhuǎn)移(Z=0.065，P=0.948)、Ki-67指數(shù)(Z=0.346，P=0.729)無關(guān)。見圖1、表1。

圖1 C19orf12蛋白在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中的表達(dá)

表1 C19orf12蛋白表達(dá)與神經(jīng)母細(xì)胞瘤臨床病理特征之間的關(guān)系

2.2 C19orf12蛋白表達(dá)與神經(jīng)母細(xì)胞瘤預(yù)后的關(guān)系Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析顯示，C19orf12蛋白的表達(dá)水平與神經(jīng)母細(xì)胞瘤患兒死亡風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)，C19orf12蛋白高表達(dá)的神經(jīng)母細(xì)胞瘤患兒死亡風(fēng)險(xiǎn)高于C19orf12蛋白低表達(dá)的患兒。見表2。

表2 神經(jīng)母細(xì)胞瘤患兒死亡危險(xiǎn)因素分析

3 討論

神經(jīng)母細(xì)胞瘤起源于交感神經(jīng)，是兒童最常見的顱外實(shí)體腫瘤[9-10]，臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，病程轉(zhuǎn)歸不可預(yù)測(cè)，晚期病例的總體結(jié)局仍不樂觀，有關(guān)于神經(jīng)母細(xì)胞瘤的有效治療仍需要從分子生物學(xué)水平更進(jìn)一步研究，以探索新的治療靶點(diǎn)。在人類中，C19orf12基因編碼兩種蛋白質(zhì)亞型：較長(zhǎng)的一種存在于線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以及線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)之間的接觸區(qū)，是一種大小為17kDa的線粒體膜蛋白相關(guān)蛋白。很多研究證實(shí)，C19orf12基因的突變與神經(jīng)退行性變及細(xì)胞的凋亡有關(guān)[11]，盡管C19orf12基因的具體功能尚未明確，但有一些論據(jù)支持其參與線粒體代謝[12]，該基因的突變似乎與脂質(zhì)代謝、線粒體活性缺陷和線粒體自噬相關(guān)。線粒體酶的突變是腫瘤細(xì)胞代謝改變的重要驅(qū)動(dòng)因素，C19orf12是定位于線粒體結(jié)構(gòu)上的蛋白，因此也有可能參與了腫瘤代謝調(diào)節(jié)。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，在卵巢癌、乳腺癌及肺癌細(xì)胞中，C19orf12蛋白表達(dá)顯著增高[6-7, 13]，越來越多的研究表明，C19orf12可能與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。

目前已經(jīng)確定，MYCN基因擴(kuò)增是神經(jīng)母細(xì)胞瘤的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，但在本研究中，C19orf12蛋白的表達(dá)與MYCN基因的擴(kuò)增狀態(tài)無關(guān)，這可能與在所有的神經(jīng)母細(xì)胞瘤中，僅有25%的神經(jīng)母細(xì)胞瘤患兒表現(xiàn)出MYCN基因擴(kuò)增有關(guān)[13-14]，本研究中表現(xiàn)出MYCN基因擴(kuò)增的只有8例，需要進(jìn)一步收集病理組織，擴(kuò)大樣本量。多數(shù)研究[14]表明，確診年齡較大的患兒預(yù)后更差、死亡率更高。但在本研究中，經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)C19orf12蛋白表達(dá)水平與確診年齡之間無顯著的線性影響關(guān)系。腫瘤發(fā)現(xiàn)時(shí)的進(jìn)展程度與腫瘤的大小有密切關(guān)系，神經(jīng)母細(xì)胞瘤常見于腹膜后，在腫瘤較小時(shí)，常沒有明顯癥狀不易被發(fā)現(xiàn)，當(dāng)腫瘤增長(zhǎng)到一定程度出現(xiàn)癥狀時(shí)，腫瘤多有遠(yuǎn)期轉(zhuǎn)移。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)在≥5cm的神經(jīng)母細(xì)胞瘤中，C19orf12蛋白的表達(dá)水平較高。神經(jīng)母細(xì)胞瘤根據(jù)INSS分期系統(tǒng)分為四期，Ⅰ期腫瘤患兒原發(fā)腫瘤完全切除后不需術(shù)后放化療，預(yù)后較好，生存率高，而Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期腫瘤患兒的預(yù)后較差，但在第Ⅳ期中，存在Ⅳs期，研究表明，Ⅳs期神經(jīng)母細(xì)胞瘤自行消退特征更為明顯[15]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)C19orf12蛋白的表達(dá)在在Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期中升高，提示C19orf12蛋白過表達(dá)可能是神經(jīng)母細(xì)胞瘤患兒的危險(xiǎn)因素。根據(jù)COG系統(tǒng)將神經(jīng)母細(xì)胞瘤分為低危組、中危組和高危組，通過統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，在低危組中，C19orf12蛋白表達(dá)水平較低，在中高危組患兒中，C19orf12蛋白表達(dá)水平較高。同時(shí)我們也觀察到，在Ⅳ期和高危組中，C19orf12蛋白表達(dá)水平較Ⅲ期和中危組低，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但由于部分Ⅳ期和高危組患兒在臨床治療過程中經(jīng)化療再手術(shù)取下腫瘤組織，因此不能排除化療對(duì)患兒C19orf12蛋白表達(dá)水平的影響，后續(xù)研究中需要加強(qiáng)腫瘤標(biāo)本的收集與管理進(jìn)一步研究C19orf12蛋白表達(dá)水平與神經(jīng)母細(xì)胞瘤分期和危險(xiǎn)度分層間的關(guān)系。

影響神經(jīng)母細(xì)胞瘤預(yù)后的因素有許多，包括確診年齡、MYCN基因擴(kuò)增狀態(tài)等獨(dú)立危險(xiǎn)因素[16-18]。本研究隨訪了患兒的生存結(jié)局及無瘤生存時(shí)間，結(jié)合可能影響神經(jīng)母細(xì)胞瘤預(yù)后的多種因素以及C19orf12蛋白的表達(dá)水平，對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤患兒死亡風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析，均衡各影響因素，發(fā)現(xiàn)C19orf12蛋白表達(dá)水平與神經(jīng)母細(xì)胞瘤患兒死亡風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)，C19orf12蛋白表達(dá)升高的神經(jīng)母細(xì)胞瘤患兒的死亡風(fēng)險(xiǎn)顯著高于C19orf12蛋白低表達(dá)的患兒。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)，C19orf12蛋白在分期高、危險(xiǎn)度高、腫瘤大的神經(jīng)母細(xì)胞瘤中表達(dá)水平較高，C19orf12蛋白表達(dá)增高提示神經(jīng)母細(xì)胞瘤患兒預(yù)后不良。但是本研究收集的病例較少，且部分病例腫瘤組織受到一定程度的化療的影響，這是研究的局限所在，在后續(xù)的研究中，我們應(yīng)加強(qiáng)病例的收集和組織標(biāo)本的管理，增加隨訪時(shí)間，進(jìn)一步探討C19orf12蛋白在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中的意義及價(jià)值。