吳 雷，王玲玲

(1.吉林市中心醫(yī)院，吉林 吉林 132011；2.北華大學附屬醫(yī)院，吉林 吉林 132011)

扁塑藤素(Pristimerin，PTM)是一種天然三萜系化合物[1]，PTM及其相關化合物具有抗感染、抗氧化以及不同程度的抑制腫瘤作用[2].相關腫瘤抑制機制包括細胞周期阻滯、蛋白酶體活性誘導細胞凋亡、線粒體功能障礙等[3]，但針對細胞線粒體膜電位的調節(jié)鮮有報道.本研究主要在體內外環(huán)境中分別探討PTM對非小細胞肺癌的增殖和線粒體膜電位的調節(jié)作用，為明確PTM抑瘤機制提供參考.

1 材料與方法

1.1 材 料

PTM提取物、A549及H226細胞株、0.9%生理鹽水(北華大學附屬醫(yī)院精準醫(yī)學中心)；RPMI 1640培養(yǎng)液、優(yōu)質胎牛血清、胰酶(GIBCO公司，美國)；雙抗、DMSO、甲醇、溴酚藍混合液、0.5%結晶紫、MTT(北京百泰克生物技術有限公司)；細胞線粒體膜電位檢測試劑盒(北京天根生物技術有限公司)；BALB/c裸鼠(吉林大學基礎醫(yī)學院免疫學教研室).

1.2 方 法

1)MTT方法測定PTM作用下A549及H226細胞株的細胞存活率.按細胞濃度為10×104/mL進行MTT實驗備板，待細胞貼壁生長后進行后續(xù)研究.PTM按預設濃度(0、1、2、4、8、16 μmol/L)進行分組，分別與備板細胞共培養(yǎng)1.5、3、6、12 h，每組設立3個復孔.應用酶聯(lián)免疫分析儀在490 nm波長處測定吸光度值，得3個復孔平均值，繪制細胞存活曲線圖.

2)細胞集落形成實驗檢測PTM對非小細胞肺癌的長期毒性作用.選擇狀態(tài)良好的A549和H226單細胞懸液，按1×103個/孔細胞接種于6孔板中與PTM共培養(yǎng).按PTM濃度分組：0 μmol/L組(對照組)、0.1 μmol/L組、0.2 μmol/L組，設2個復孔；待肉眼可見克隆時終止培養(yǎng)，干燥后應用甲醇固定，0.5%結晶紫染色，倒置顯微鏡下記錄細胞集落數(shù)目.

3)PTM對A549移植瘤的生長抑制實驗.選擇30只BALB/c裸鼠(4周齡，20～22 g)，無菌飼養(yǎng)室12 h光照/黑暗循環(huán)，充足補給(食物和水)，環(huán)境適應期3 d.該研究經首都醫(yī)科大學倫理委員會(中國北京)批準(編號2017091011號).取備用A549細胞單細胞混懸液(濃度為1×106/mL，0.9%生理鹽水)100 μL接種于裸鼠前肢腋下位置，連續(xù)觀察移植瘤1～2周，記錄裸鼠體質量及腫瘤體積，直至腫瘤體積150 mm3左右視為造模成功.按PTM腹腔內注射劑量進行隨機分組：0.9%生理鹽水空白對照組(50 μL)、PTM 1 mg/kg治療組(50 μL)、PTM 2 mg/kg治療組(50 μL)，1次/2 d，連續(xù)治療4次；維持10 d，裸鼠頸椎脫臼處死，留取移植瘤瘤體，并稱質量.

4)應用流式細胞術測定PTM作用后細胞線粒體膜電位.PTM選擇8 μmol/L，分別與對數(shù)生長的A549和H226細胞共培養(yǎng)0(control)、3、6 h，替換含有10 μg/mL的Rhodamine 123細胞培養(yǎng)液4 mL，置于培養(yǎng)箱中孵育30 min，收集貼壁細胞制備單細胞懸液.每組任選1×104個細胞進行檢測，重復各組實驗3次，記錄平均值.

2 結 果

2.1 MTT法測定PTM作用下A549及H226細胞株的細胞存活率

應用MTT法測定PTM(0、1、2、4、8、16 μmol/L)作用下A549和H226細胞不同時長(1.5、3、6、12 h)的細胞存活率.與空白對照組比較，A549和H226兩組細胞隨PTM劑量的增加及孵育共培養(yǎng)時間的延長，細胞的平均存活率顯著降低.以PTM與兩組細胞孵育共培養(yǎng)6 h為基準，隨著PTM濃度升高，細胞存活率下降為A549細胞組：93.2%、81.27%、69.12%、54.82%、32.11%；H226細胞組：91.15%、84.02%、72.56%、53.12%、31.15%.本研究結果表明：PTM對非小細胞肺癌細胞株(A549和H226)的細胞抑制作用存在劑量和時間的關聯(lián)性.分別計算PTM孵育共培養(yǎng)6 h的IC50濃度值：A549細胞的IC50值為8.25 μmol/L，H226細胞的IC50值為8.17 μmol/L.見圖1.

圖1 PTM作用下A549及H226細胞株的細胞存活率Fig.1 Cell survival rate of A549 and H226 cell lines with PTM treatment

2.2 細胞集落形成實驗檢測PTM對非小細胞肺癌的長期毒性作用

通過細胞集落形成實驗檢測PTM對兩組非小細胞肺癌細胞(A549和H226)增殖的長期毒性作用.PTM與細胞共孵育濃度分別采用低濃度0.1、0.2 μmol/L，培養(yǎng)第6天進行細胞集落計數(shù)，研究結果顯示：與對照組(0 μmol/L)比較，0.1 μmol/L組A549及H226的細胞集落形成均受到抑制，并且0.2 μmol/L 組的細胞集落形成抑制更為明顯.研究結果表明：PTM對非小細胞肺癌細胞株(A549和H226)的長期細胞抑制作用同樣存在劑量和時間的關聯(lián)性.見圖2.

圖2 PTM作用下A549及H226細胞株的細胞集落Fig.2 Cell colony of A549 and H226 cell lines with PTM treatment

2.3 PTM對A549移植瘤的生長抑制

分析PTM對A549移植瘤體積及瘤體濕重影響的結果顯示：不同PTM腹腔內注射在治療第4天開始即出現(xiàn)腫瘤體積抑制現(xiàn)象，第5天移植瘤體積與對照組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01).在治療第7天，PTM 2 mg/kg治療組的移植瘤體積抑制作用優(yōu)于PTM 1 mg/kg治療組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05).濕重對比分析結果顯示：PTM 1 mg/kg治療組及PTM 2 mg/kg治療組濕重明顯低于空白對照組(P<0.01).PTM 1 mg/kg治療組與PTM 2 mg/kg治療組進行組間比較，結果顯示：PTM 2 mg/kg治療組移植瘤濕重低于PTM 1 mg/kg治療組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05).初步證明不同濃度PTM對體內非小細胞肺癌增殖同樣存在抑制作用.見圖3.

圖3 PTM對A549移植瘤的生長抑制Fig.3 Growth inhibition of PTM treatment on A549 transplanted tumors

2.4 流式細胞術測定細胞線粒體膜電位結果

應用流式細胞術測定兩組經PTM 8 μmol/L共培養(yǎng)的非小細胞肺癌(A549和H226)細胞線粒體膜電位，結果顯示：PTM對各組細胞作用時間持續(xù)3 h即可導致細胞線粒體膜電位下降，持續(xù)6 h時線粒體膜電位下降更為明顯，提示細胞線粒體膜電位與PTM對非小細胞肺癌細胞作用時長呈負相關，并初步證明PTM具有誘導非小細胞肺癌細胞線粒體膜電位去極化作用.見表1、圖4.

表1 PTM作用下A549及H226細胞株的線粒體膜電位Tab.1 Mitochondrial membrane potential of A549 and H226 cell lines with PTM treatment

圖4 PTM作用下A549及H226細胞株的線粒體膜電位Fig.4 Mitochondrial membrane potential of A549 and H226 cell lines with PTM treatment

3 討 論

惡性腫瘤是正常細胞在致癌因素的作用下發(fā)生的異常增生，在結構、功能和代謝方面均與正常細胞或組織顯示出明顯的不同，其發(fā)生是多因素、多階段、復雜漸進性的過程，具有細胞或組織的無限增殖且具有浸潤性和轉移性特點.流行病學調查[4]顯示：每年全球新發(fā)腫瘤患者可達700多萬人，預計在2030年腫瘤患者可能突破1 310萬人/a，我國癌癥死亡人數(shù)占全球癌癥死亡總數(shù)的1/4以上，并且近年來惡性腫瘤的發(fā)病趨向年輕化.目前，針對惡性腫瘤治療仍然集中在手術治療、放射線治療及化學藥物治療，其中化學治療占治療手段的主體地位，對于手術治療或放射治療方案仍保留部分化學治療為輔助手段.但由于癌細胞的基因易變性，產生了耐藥細胞逃逸、化療藥品對正常組織或細胞的強力殺傷等諸多問題，已經限制了大量化療藥物的臨床應用.因此，從不同途徑尋求新型抗癌藥物及探尋新的抑瘤機制仍是攻堅惡性腫瘤的基石.

扁塑藤素作為一種天然抗腫瘤候選新品已經在多種瘤體中顯示其廣譜的抗腫瘤作用[5]，并且作為一種配伍藥品也顯示了瘤體高選擇性、正常組織低毒性及對鉑類藥品增敏等優(yōu)勢[6-9].本研究以非小細胞肺癌細胞系A549及H226為體內外實驗標本來源，應用PTM施加外源性刺激，研究結果發(fā)現(xiàn)：不同濃度PTM(0、1、2、4、8、16 μmol/L)作用于A549和H226細胞不同時長(1.5、3、6、12 h)，其細胞存活率隨PTM劑量的增加及孵育共培養(yǎng)時間的延長顯著降低，提示PTM對非小細胞肺癌細胞株(A549和H226)的細胞抑制作用存在劑量和時間依賴.計算PTM孵育共培養(yǎng)6 h的IC50濃度值：A549-IC50=8.25 μmol/L，H226-IC50=8.17 μmol/L，提示PTM對兩種非小細胞肺癌細胞株作用接近，進一步證實了PTM的抑瘤廣譜性.以PTM 0.1、0.2 μmol/L與非小細胞肺癌細胞株(A549和H226)共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)細胞集落單克隆形成同樣受到抑制，并且存在劑量和時間的正反饋作用.經A549移植瘤模型的體內實驗進行移植瘤體積及瘤體濕重對比分析也證實了PTM的抑瘤作用依然存在劑量和時間的依賴性，在一項關于扁蒴藤素體外對HL-60細胞作用的研究[7]中也得到了同樣的結論.有報道[10]提示，PTM抑瘤機制可能包括細胞周期阻滯、蛋白酶體活性誘導細胞凋亡及線粒體功能障礙等.線粒體是細胞凋亡及其他死亡途徑的核心環(huán)節(jié)，其膜的作用在于維持能量和細胞穩(wěn)定.本研究中，應用流式細胞術測定細胞線粒體膜電位研究結果顯示：PTM作用持續(xù)3 h即可導致細胞線粒體電位下降，持續(xù)6 h時線粒體膜電位下降更為明顯，并初步證明PTM具有誘導非小細胞肺癌細胞線粒體膜電位去極化作用，這可能是PTM對非小細胞肺癌發(fā)揮抑制作用的機制之一.另外，還有關于PTM直接作用于線粒體膜電位誘導人乳腺癌發(fā)生caspase依賴性凋亡[11]、PTM通過活性氧介導的線粒體膜電位功能障礙發(fā)揮類熱休克蛋白90(HSP90)抑制劑活性導致腫瘤細胞凋亡等研究[12]報道.上述研究結果均支持PTM對非小細胞肺癌具有抑制增殖作用，并且與濃度及作用時間存在正相關，其機制可能是啟動了線粒體膜電位的去極化程序，為后續(xù)明確PTM的廣譜抑瘤機制提供了參考.