胡 萍，徐 影，盛 凈

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院，上海 200011)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是中老年人群常見的呼吸系統(tǒng)慢性病，發(fā)病率呈逐年上升趨勢[1].有研究[2-3]顯示：COPD發(fā)生、發(fā)展的病理過程與心血管疾病的發(fā)生密切相關(guān)，其中血管內(nèi)皮細胞結(jié)構(gòu)和功能異常是COPD患者并發(fā)心血管疾病的主要因素之一.內(nèi)皮祖細胞是血管內(nèi)皮細胞的前體，具備內(nèi)皮特性，在受損血管內(nèi)膜修復(fù)中發(fā)揮重要作用[4].β腎上腺素受體家族包括3個亞型，其中β2腎上腺素受體可通過G蛋白提升細胞內(nèi)cAMP水平，激活PKA，活化NF-κB等下游靶點，介導(dǎo)細胞多項生理活動[5].有研究[6]發(fā)現(xiàn)：大鼠淋巴組織中T細胞、B細胞均存在β2腎上腺素受體表達，參與調(diào)控細胞的增殖、分化等過程.亦有研究[7]顯示：CD34+干細胞可表達β2腎上腺素受體，其特異性激動劑能夠調(diào)節(jié)細胞遷移.但關(guān)于COPD患者外周血內(nèi)皮祖細胞中β2腎上腺素受體表達情況以及對細胞遷移的影響仍鮮有報道.本研究主要探討β2腎上腺素受體在COPD患者外周血內(nèi)皮祖細胞中的表達及作用.

1 對象與方法

1.1 研究對象

收集2019年1月—2019年10月上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院收治的COPD患者110例(COPD組)，其中，男78例，女32例；年齡58～75歲，平均(67.18±5.30)歲.另收集同期體檢的同年齡段健康志愿者62例為對照組，其中，男41例，女21例；年齡60～75歲，平均(66.95±4.16)歲.兩組年齡、性別間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05).本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，受試者自愿參與并簽署知情同意書.

入選標(biāo)準(zhǔn)：中重度穩(wěn)定期COPD患者；靜息狀態(tài)下動脈血氧分壓>60 mmHg，近1個月未使用激素類藥物.

排除標(biāo)準(zhǔn)：原發(fā)性高血壓、心律失常等原發(fā)性心血管疾??；惡性腫瘤、風(fēng)濕性疾病、腎病等影響外周血干細胞數(shù)量的疾??；糖尿病等代謝性疾病.

1.2 主要試劑

胎牛血清、內(nèi)皮細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Clonetics公司，美國)；β2腎上腺素受體拮抗劑(CI-118551)、β2腎上腺素受體激動劑(去甲腎上腺素，Sigma公司，美國)；Trizol總RNA抽提試劑盒、RIPA裂解液(上海捷瑞生物工程有限公司)；鼠抗人β2腎上腺素受體單克隆抗體、鼠抗人GAPDH單克隆抗體、山羊抗鼠IgG(上海玉博生物科技有限公司).

1.3 方 法

1.3.1 外周血早期內(nèi)皮祖細胞制備與鑒定

抽取受試者外周靜脈血，分離CD34+細胞；將CD34+細胞種植于內(nèi)皮細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48 h，棄去未貼壁的細胞；胰蛋白酶消化貼壁細胞，轉(zhuǎn)入2% BSA封閉液中繼續(xù)培養(yǎng)30 min，加入CD34 mAb(FITC)、CD133 mAb(PE)、一抗血管內(nèi)皮細胞生長因子受體2，培養(yǎng)30 min；加入二抗，繼續(xù)培養(yǎng)30 min后應(yīng)用流式細胞儀檢測.

收集80%表達的外周血早期內(nèi)皮祖細胞用于實驗.取1×106個外周血早期內(nèi)皮祖細胞接種于含內(nèi)皮細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基的6孔板中培養(yǎng)7 h，加入濃度為3 μg/mL的DiI-acLDL繼續(xù)培養(yǎng)2 h，棄去培養(yǎng)液；4%多聚甲醛固定10 min，加入濃度為10 mg/L的FITC-UEA-I培養(yǎng)2 h，熒光顯微鏡下觀察到的雙染色陽性的細胞為正在分化的早期內(nèi)皮祖細胞.

1.3.2 RT-PCR檢測β2腎上腺素受體mRNA表達

采用Trizol法提取早期內(nèi)皮祖細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA.β2腎上腺素受體及內(nèi)參GAPDH引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司設(shè)計合成，β2腎上腺素受體引物序列：上游5′-TCCAAGACCTG TACTTAGCG-3′，下游5′-CCTCGTGTTTCGGGAGTT CT-3′；GAPDH引物序列：上游5′-TAGCAGTGGTT GACCCTGCT-3′，下游5′-TCCTTAGGAAGACTGGG TACG-3′.反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40個循環(huán)，延伸72 ℃ 5 min.擴增產(chǎn)物行2%瓊脂糖凝膠電泳，并計算相對表達量.

1.3.3 Western blot檢測β2腎上腺素受體蛋白表達

應(yīng)用RIPA裂解液提取早期內(nèi)皮祖細胞總蛋白，BCA蛋白定量.取50 μg總蛋白行SDS-PAGE凝膠電泳，濕法轉(zhuǎn)至PVDF膜，滴加鼠抗人β2腎上腺素受體單克隆抗體(1∶200稀釋)，鼠抗人GAPDH單克隆抗體(1∶500稀釋)，4 ℃過夜，加入HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG(1∶1 000稀釋)，室溫下靜置2 h，ECL顯色，凝膠成像系統(tǒng)拍照.

1.3.4 Transwell小室檢測早期內(nèi)皮祖細胞遷移能力

取早期內(nèi)皮祖細胞消化、重懸計數(shù)后，向上室中加入3×105個早期內(nèi)皮祖細胞和無血清內(nèi)皮細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基，下室中加入600 μL 10%胎牛血清的內(nèi)皮細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基，孵育24 h后加入40 g/L多聚甲醛固定30 min，洗滌后加入0.1%結(jié)晶紫染色，光學(xué)顯微鏡下隨機選取10個視野計數(shù).

1.3.5 siRNA轉(zhuǎn)染早期內(nèi)皮祖細胞下調(diào)β2腎上腺素受體表達

使用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染siRNA，操作嚴格按試劑說明書進行.將siRNA脂質(zhì)體2000混合液加入含早期內(nèi)皮祖細胞及含10%胎牛血清的內(nèi)皮細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)72 h；培養(yǎng)6～8 h后，將培養(yǎng)孔中含siRNA脂質(zhì)體2000混合液的培養(yǎng)基棄去，更換為新鮮的內(nèi)皮細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng).

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 早期內(nèi)皮祖細胞鑒定

光學(xué)顯微鏡下觀察早期內(nèi)皮祖細胞外形與淋巴細胞相似，呈集落樣生長，細胞核較大，胞質(zhì)偏少.熒光顯微鏡觀察顯示：早期內(nèi)皮祖細胞為貼壁細胞，接種24 h后多數(shù)呈貼壁生長，繼續(xù)培養(yǎng)7 d后培養(yǎng)皿中可見早期內(nèi)皮祖細胞呈梭狀致密單層，需傳代培養(yǎng).見圖1.

a.光學(xué)顯微鏡觀察早期內(nèi)皮祖細胞(×100)；b.熒光顯微鏡觀察早期內(nèi)皮祖細胞DiI-acLDL 和FITC-UEA-I雙染色(×400).圖1 光學(xué)顯微鏡及熒光顯微鏡下觀察早期內(nèi)皮祖細胞Fig.1 Observation of early endothelial progenitor cells under optical microscope and fluorescence microscope

2.2 早期內(nèi)皮祖細胞中β2腎上腺素受體 mRNA和蛋白表達水平

COPD組內(nèi)皮祖細胞中β2腎上腺素受體mRNA和蛋白相對表達量均明顯高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01).見表1、圖2.

表1 兩組早期內(nèi)皮祖細胞中β2腎上腺素受體mRNA和蛋白表達水平Tab.1 β2 adrenoceptor mRNA and protein expression in early endothelial progenitor cells between two groups

A.RT-PCR電泳；B.Western blot電泳.圖2 早期內(nèi)皮祖細胞中β2腎上腺素受體 mRNA和蛋白表達水平Fig.2 Expression level of β2 adrenoceptor mRNA and protein in early endothelial progenitor cells

2.3 不同濃度β2腎上腺素受體拮抗劑對早期內(nèi)皮祖細胞遷移的影響

兩組早期內(nèi)皮祖細胞分別于不同濃度的β2腎上腺素受體拮抗劑孵育24 h后，Transwell遷移實驗顯示：COPD組遷移細胞數(shù)明顯少于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；隨著β2腎上腺素受體拮抗劑濃度的增加，COPD組遷移細胞數(shù)逐漸增多，當(dāng)β2腎上腺素受體拮抗劑濃度為15 nmol/L時，兩組遷移細胞數(shù)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05).見表2.

表2 不同濃度β2腎上腺素受體拮抗劑對早期內(nèi)皮祖細胞遷移的影響Tab.2 Effects of different concentrations of β2 adrenergic receptor antagonists on early migration of endothelial progenitor cells

2.4 不同濃度去甲腎上腺素對早期內(nèi)皮祖細胞遷移的影響

兩組早期內(nèi)皮祖細胞分別于不同濃度的去甲腎上腺素孵育24 h后，Transwell遷移實驗顯示：COPD組遷移細胞數(shù)明顯少于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；隨著去甲腎上腺素濃度的增加，COPD組遷移細胞數(shù)逐漸減少.見表3.

表3 不同濃度去甲腎上腺素對早期內(nèi)皮祖細胞遷移的影響Tab.3 Effects of norepinephrine at different concentrations on migration of early endothelial progenitor cells

2.5 下調(diào)β2腎上腺素受體表達對早期內(nèi)皮祖細胞遷移的影響

siRNA轉(zhuǎn)染早期內(nèi)皮祖細胞72 h后，下室細胞計數(shù)顯示：對照組、COPD組的遷移細胞數(shù)分別為(63.56±10.87)個、(23.31±5.94)個.COPD組遷移細胞數(shù)明顯少于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01).

3 討 論

COPD是一種可防治的呼吸系統(tǒng)常見慢性病，以呼吸道氣流持續(xù)受限為主要特征，病情呈進行性發(fā)展，與肺組織對有害氣體或顆粒的炎癥反應(yīng)有關(guān)[8].有研究[9]發(fā)現(xiàn)：外界有害刺激可減弱血管內(nèi)皮細胞的舒張活性，導(dǎo)致內(nèi)皮功能紊亂，引發(fā)心血管疾病，一氧化氮在其中發(fā)揮重要調(diào)控作用.一氧化氮是人體主要的內(nèi)源性血管舒張因子，在血管張力調(diào)節(jié)、抑制血管平滑肌細胞增生、維持肺血管正常阻力方面發(fā)揮重要作用[10].內(nèi)皮祖細胞是血管內(nèi)皮細胞的前體，具備內(nèi)皮特性[11].內(nèi)皮祖細胞分化的成熟內(nèi)皮細胞能夠補充人體內(nèi)皮細胞的缺失，在維持血管結(jié)構(gòu)、生理功能的完整性方面發(fā)揮重要作用[12]；同時內(nèi)皮祖細胞通過分泌一氧化氮促進血管重構(gòu)，保護血管內(nèi)皮功能[13].內(nèi)皮祖細胞的功能狀態(tài)能夠反映出體內(nèi)血管內(nèi)皮功能，在血管內(nèi)皮功能評價中具有重要的參考價值[14].

目前，關(guān)于內(nèi)皮祖細胞的研究主要集中在對血管內(nèi)皮功能的影響，進而探討與心腦血管疾病發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)性.此外，血管內(nèi)皮功能變化還與COPD病情嚴重程度密切相關(guān)，患者內(nèi)皮細胞修復(fù)功能的強弱直接影響到血管內(nèi)皮功能.但關(guān)于內(nèi)皮祖細胞在COPD患者中的活性變化及調(diào)控途徑的研究仍十分少見.β2腎上腺素受體是一種廣泛存在于人體組織中的腎上腺素能受體，介導(dǎo)體內(nèi)多種生理學(xué)功能[15]；交感神經(jīng)可作用于β2腎上腺素受體對細胞增殖、遷移發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[16].有研究[17-20]發(fā)現(xiàn)：骨髓中CD34+細胞的遷移、歸巢受交感神經(jīng)的調(diào)節(jié)，β2腎上腺素受體在交感神經(jīng)作用下影響細胞遷移，β2腎上腺素受體表達可能會影響COPD患者內(nèi)皮祖細胞的活性.本研究通過分離外周血早期內(nèi)皮祖細胞，在體外進行驗證實驗，旨在探討β2腎上腺素受體表達對COPD患者內(nèi)皮祖細胞活性的影響.

本研究結(jié)果顯示：COPD組早期內(nèi)皮祖細胞中β2腎上腺素受體mRNA和蛋白表達水平明顯高于對照組；COPD組遷移細胞數(shù)明顯少于對照組，使用β2腎上腺素受體拮抗劑干預(yù)后可明顯提升COPD組遷移細胞數(shù)量，去甲腎上腺素干預(yù)后可明顯降低COPD組遷移細胞數(shù)量，且隨著β2腎上腺素受體拮抗劑、去甲腎上腺素的濃度增加而改變逐漸明顯.進一步通過siRNA轉(zhuǎn)染下調(diào)β2腎上腺素受體表達后，COPD患者早期內(nèi)皮祖細胞遷移細胞數(shù)明顯升高.提示COPD患者呼吸系統(tǒng)持續(xù)慢性炎癥反應(yīng)導(dǎo)致肺組織細胞因子增加，外周血早期內(nèi)皮祖細胞進入肺組織后，在肺組織停留時受外源性β2腎上腺素受體激動劑刺激，改變了早期內(nèi)皮祖細胞上β2腎上腺素受體的表達水平，抑制了早期內(nèi)皮祖細胞由肺組織向外周血遷移，進而引發(fā)外周血早期內(nèi)皮祖細胞數(shù)量下降，影響受損血管內(nèi)皮的修復(fù).我們在后續(xù)研究中將進一步探討β2腎上腺素受體改變早期內(nèi)皮祖細胞遷移能力的分子機制.