牛 羚，崔興萌，徐增利，梁玉伏

(北華大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林 吉林 132011)

牙周炎是由多種因素引起的牙齒支持組織的慢性破壞性病變，其發(fā)病機(jī)制是牙菌斑中的細(xì)菌侵犯牙周組織引起的慢性炎癥，與微生物、宿主反應(yīng)密切相關(guān)[1].CD24是一種高度糖基化的多肽，與自體反應(yīng)性T細(xì)胞局部保留有關(guān)[2].Twist屬于高度保守的堿性螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子家族成員，在胚胎發(fā)育過程中具有調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移的作用，并且可以將上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為間充質(zhì)細(xì)胞[3].作為堿性螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子家族成員，Twist2基因?qū)θ搜乐苣らg充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化具有調(diào)節(jié)作用[4-5].據(jù)報(bào)道[6-8]，牙周炎患者血清中含有針對(duì)口腔革蘭陽性細(xì)菌的血清抗體，并且這些抗體可與包括CD24的上皮抗原形成交叉反應(yīng)，而CD24在反應(yīng)性牙周上皮和炎性牙齦附屬組織中高水平表達(dá).有研究[9-10]表明：Twist2也參與調(diào)節(jié)炎癥因子的表達(dá)，但目前對(duì)Twist2調(diào)控基因的研究有限，Twist2與CD24在牙周炎炎癥反應(yīng)中是否具有相關(guān)性，目前尚無相關(guān)研究報(bào)道.本研究通過模擬牙周炎炎性反應(yīng)環(huán)境，檢測(cè)CD24與Twist2的表達(dá)狀況，并初步探討CD24和Twist2在慢性牙周炎病變的作用.

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 細(xì)胞獲取與培養(yǎng)

正畸拔除的健康恒磨牙牙根面經(jīng)過雙抗無菌PBS液反復(fù)沖洗處理，將冠部在75%酒精中浸泡2 min，在無菌條件下刮取牙根面1/3的牙周膜細(xì)胞，置入無菌的PBS 溶液中.將獲取的牙周膜組織剪碎，用Ⅰ型膠原酶在 37 ℃水浴中消化20 min，1 000 r/min離心5 min.移除上清液，加入1 mL α-MEM 培養(yǎng)液(含10%胎牛血清、100 μg/mL抗壞血酸、2 mmol/L谷胺酰胺、0.5 μg/mL青-鏈霉素)，吹勻、接種，置入37 ℃、5 mL/L CO2條件下的恒溫孵箱繼續(xù)培養(yǎng)和傳代.

1.2 LPS模擬體外炎性環(huán)境

將生長(zhǎng)良好的牙周膜上皮細(xì)胞以 2×105個(gè)/mL 的密度接種到α-MEM 培養(yǎng)液六孔板中，37 ℃、5% CO2的標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行培養(yǎng).培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)到80%時(shí)去除原培養(yǎng)液，將其隨機(jī)分成對(duì)照組(用α-MEM 培養(yǎng)液培養(yǎng))、實(shí)驗(yàn)1組(用含1 μg/mL LPS的α-MEM 培養(yǎng)液培養(yǎng))、實(shí)驗(yàn)2組(用含1 μg/mL LPS的α-MEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)，并加入CD24多肽抗體).實(shí)驗(yàn)1組和實(shí)驗(yàn)2組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h用于后續(xù)實(shí)驗(yàn).

1.3 qRT-PCR 檢測(cè)CD24和Twist2的表達(dá)情況

將培養(yǎng)24 h的細(xì)胞于無菌環(huán)境下去除培養(yǎng)基，加入Trizol試劑將細(xì)胞完全裂解，提取總RNA.使用Nano DropRND-1000檢測(cè)RNA濃度和純度，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，將總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行操作.反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用qPCR試劑盒(Takara 公司，北京) 進(jìn)行qRT-PCR 檢測(cè)，以U6為內(nèi)參，引物序列(Invitrogen合成)：GAPDH上游5′-CAGGGCTGCTTTTAACTCTG GT-3′(203 bp)，下游5′-GATTTTGGAGGGATCTCG CT-3′；TWIST2 上游5′- GCAAGAAGTCGAGCGAAGAT-3′(96 bp)，下游5′- GCTCTGCAGC TCCTCGA A-3′；CD24上游5′-CCCACGCAGATTTATTCCAG-3′(254 bp)，下游5′-GACTTCCAGACGCCATTTG-3′.

1.4 Western blot 檢測(cè)Twist2蛋白和CD24表達(dá)

應(yīng)用細(xì)胞裂解液裂解牙周韌帶細(xì)胞，離心收集上清液，再應(yīng)用BCD法測(cè)定蛋白濃度.將樣品蛋白質(zhì)電泳、轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂奶粉溶液室溫封閉2 h，與一抗4 ℃反應(yīng)過夜，PBST洗滌后與二抗在室溫下?lián)u床孵育1 h，再次應(yīng)用PBST進(jìn)行洗滌.在暗室中紅外線下用發(fā)光液進(jìn)行化學(xué)發(fā)光，經(jīng)曝光、顯影、定影后應(yīng)用掃描儀掃描膠片，并對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)條帶進(jìn)行灰度分析.用內(nèi)參蛋白質(zhì)條帶光密度值的百分率表示目標(biāo)蛋白質(zhì)的相對(duì)表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 20.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，選用Graphpad Prism軟件作圖，實(shí)驗(yàn)原始數(shù)據(jù)行兩組獨(dú)立樣本的非參數(shù)秩和檢驗(yàn)，對(duì)于3個(gè)樣本的計(jì)數(shù)資料選用方差分析，以P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié) 果

將兩組牙周細(xì)胞應(yīng)用Trizol法提取總 mRNA，應(yīng)用qRT-PCR法檢測(cè)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)1組中CD24 mRNA、Twist2 mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果顯示：對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)1組中CD24 mRNA表達(dá)水平分別為1.84±0.25、3.96±0.58；經(jīng)LPS處理后的炎性環(huán)境中CD24 mRNA、Twist2 mRNA的表達(dá)量上調(diào)，對(duì)照組CD24 mRNA表達(dá)水平顯著低于實(shí)驗(yàn)1組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=30.02，P<0.05).對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)1組和實(shí)驗(yàn)2組中Twist2 mRNA表達(dá)水平分別為1.62±0.87、3.64±1.02、0.74±0.29，實(shí)驗(yàn)2組中經(jīng)CD24多肽抗體處理后Twist2 mRNA的表達(dá)量降低，低于對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)1組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=282.00，P<0.05).見圖1.

圖1 CD24多肽抗體處理后Twist2 mRNA表達(dá)量Fig.1 Expression level of Twist2 mRNA after treatment with CD24 polypeptide antibody

3 討 論

牙周炎是一種涉及牙周支持組織的慢性傳染病，常常導(dǎo)致牙周組織的炎性破壞.在牙周發(fā)生病變的過程中，除了牙菌斑及其毒素直接破壞牙周組織外，所產(chǎn)生的免疫反應(yīng)還會(huì)對(duì)牙周組織造成嚴(yán)重?fù)p害[1].牙周炎患者自身組織核酸可能作為一類多種損傷相關(guān)模型分子(damage associated mole- cular pattern molecule，DAMP)，通過牙周局部先天免疫應(yīng)答的過度激活誘導(dǎo)炎性牙槽骨吸收[11].CD24在健康反應(yīng)性牙齦的黏附上皮和牙周袋上皮中選擇性地高水平表達(dá)，且與多種 DAMP有關(guān).CD24對(duì)晚期糖基化終產(chǎn)物具有負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用，被認(rèn)為可有效預(yù)防牙周組織損傷[12].對(duì)有害細(xì)菌及其產(chǎn)物的免疫反應(yīng)引起的上皮附著喪失，被認(rèn)為是牙周炎破壞性損傷的主要機(jī)制.有研究[11]發(fā)現(xiàn)：牙周炎患者存在針對(duì)口腔革蘭陽性細(xì)菌的血清抗體，這種抗體可與口腔黏膜上皮抗原(包括CD24)形成交叉反應(yīng).CD24自身反應(yīng)性血清抗體可結(jié)合上皮細(xì)胞表面的CD24抗原，達(dá)到抑制牙周損害的效果.YE P等[9]研究顯示：在人類牙周病組織中幾乎所有輕度炎癥的上皮標(biāo)本細(xì)胞都可與CD24抗體發(fā)生反應(yīng).GUO W等[13]研究顯示：下調(diào)CD24 mRNA的表達(dá)可降低 E- cadherin表達(dá)，并上調(diào)Twist、Snail、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)的表達(dá).

本次研究中，我們通過用含1 μg/mL LPS的α-MEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)生長(zhǎng)良好的牙周膜上皮細(xì)胞，模擬牙周炎的炎性環(huán)境，結(jié)果發(fā)現(xiàn)炎癥環(huán)境下實(shí)驗(yàn)1組較正常培養(yǎng)液培養(yǎng)的對(duì)照組細(xì)胞中Twist2 mRNA表達(dá)水平明顯上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，結(jié)果說明炎癥環(huán)境下可以刺激牙齦上皮細(xì)胞Twist2 mRNA表達(dá)水平.另外，為了研究CD24在牙周炎癥中的作用，我們對(duì)實(shí)驗(yàn)2組牙周膜細(xì)胞培養(yǎng)中添加了CD24多肽抗體，觀察CD24抗體對(duì)牙齦上皮細(xì)胞Twist2 mRNA表達(dá)水平的影響，結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)2組牙齦上皮細(xì)胞Twist2 mRNA表達(dá)水平顯著低于實(shí)驗(yàn)1組及對(duì)照組，提示CD24在調(diào)節(jié)牙周病牙齦上皮細(xì)胞的基因表達(dá)中具有重要作用，CD24抗體反應(yīng)可以負(fù)性調(diào)節(jié)Twist2的表達(dá).其可能的機(jī)制是在炎癥及免疫細(xì)胞及因子的刺激下Twist2表達(dá)上調(diào)，牙周組織中的成骨細(xì)胞受到抑制，而CD24抗體反應(yīng)又抑制Twist2表達(dá)，從而抑制牙槽骨的吸收破壞.但CD24與Twist2在牙周炎中的具體信號(hào)傳導(dǎo)途徑仍需進(jìn)一步探討，二者的作用機(jī)制有待更深入的探究.