段喜鑫，陳秀強(qiáng)，柏智先，李翔宇

(北華大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 吉林 132013)

多巴胺(DA)是大腦中含量最豐富的兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)，為酪氨酸在代謝過程中經(jīng)二羥苯丙氨酸產(chǎn)生的中間產(chǎn)物[1]，在體內(nèi)起著多種調(diào)節(jié)作用，影響著人的情緒，其代謝異常會引起帕金森綜合征、阿爾茨海默病、癲癇等疾病，同時(shí)，DA作為藥物還可以治療缺血性、心源性及感染性休克，以及高血壓和心臟病等[2-3].目前，DA檢測方法(如電化學(xué)分析[4-8]、高效液相色譜法(HPLC)[9]和化學(xué)發(fā)光法[10]等)均涉及復(fù)雜的樣品處理程序，且重現(xiàn)性較差.近年來，顯色免疫分析逐漸受到關(guān)注.該方法無需昂貴的儀器，以及復(fù)雜的樣品處理程序，成本低、實(shí)用性強(qiáng)，分析過程簡便快捷，是一種通過肉眼即可觀察到顏色變化的快速檢測方法[11-15].

在顯色免疫檢測過程中，生物酶很容易受到外界環(huán)境的影響而變性，且制備、儲存耗時(shí)長，價(jià)格昂貴，過程復(fù)雜.與天然酶相比，納米材料具有更好的穩(wěn)定性，其中，金納米粒子在顯色檢測DA領(lǐng)域應(yīng)用較為廣泛[16-19]，銀納米粒子[20]、氧化石墨烯[21]和金屬氧化物[22]等納米材料作為催化劑的研究也越來越受到關(guān)注.目前，已合成了多種具有過氧化物酶、氧化酶活性的納米材料，如Fe3O4、CeO2、Co3O4等[23-25].但所開發(fā)的方法選擇性較低，限制了在實(shí)際中的應(yīng)用.多金屬氧酸鹽(Polyoxometalates，POMs)是一類具有氧化還原性能的金屬氧簇化合物.通過調(diào)控多酸結(jié)構(gòu)、取代金屬種類和數(shù)目可獲得不同氧化性的POMs.WANG等[26]首次報(bào)道了H3PW12O40的過氧化物酶活性，采用POMs/H2O2/TMB體系用于顯色檢測H2O2或者葡萄糖[27-28]，之后該團(tuán)隊(duì)又制備了SiW10Fe2與葉酸復(fù)合的新型多酸催化劑，用于癌細(xì)胞和H2O2的顯色檢測[29].本研究采用不同金屬調(diào)控多酸的氧化性，制備系列Finke型POMs催化劑——PW9M4(M為Co、Cu、Mn和Zn)和P2W15M4(M為Co、Cu和Zn)，開發(fā)在水相中簡單、快速、高選擇性顯色檢測DA的催化體系，研究不同反應(yīng)條件、干擾物質(zhì)對顯色檢測的影響.

1 實(shí)驗(yàn)材料及方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

主要試劑有Na2WO4·2H2O、H3PO4、NH4Cl、KCl、Co(NO3)2、CuCl2、MnSO4、ZnCl2和鹽酸多巴胺等，所有試劑均為分析純.實(shí)驗(yàn)用水為去離子水.

FT-IR采用Shimadzu IR Affinity-1S，樣品與KBr混合壓片，測試范圍為400～4 000 cm-1；通過X射線衍射(XRD)測定催化劑晶體結(jié)構(gòu)，采用Rigaku公司的D/max-2500X型X射線衍射儀，輻射源為Cu-Kα，輻射波長為0.154 2 nm，管電壓40.0 kV，管電流40 mA，測試角度10°～80°，步進(jìn)角度為0.02°，掃描速度為5°/min；UV-Vis為Shimadzu UV-2700紫外-可見分光光度計(jì).

1.2 催化劑制備

P2W15M4(M為Co、Cu和Zn)和PW9M4(M為Co、Cu、Mn和Zn)系列催化劑分別根據(jù)先前報(bào)道方法[30-31]合成.

1.3 實(shí)驗(yàn)過程

顯色檢測DA過程：將一定體積的PW9M4(1.25 mmol/L)或P2W15M4(2.5 mmol/L)分別與適量H2O2(100 mmol/L)溶于1 mL水中，將一定體積DA(8 mmol/L)加入上述的混合溶液中.混合溶液靜置一段時(shí)間，用UV-Vis光譜在波長475 nm處測量溶液吸光度.

2 結(jié)果與討論

2.1 PW9M4結(jié)構(gòu)表征

PW9M4紅外光譜見圖1.由三缺位Dawson型多陰離子構(gòu)筑的Finke型多酸陰離子IR譜圖應(yīng)在1 100～800 cm-1范圍內(nèi)有明顯的特征吸收峰[31]，所制備的多酸催化劑在1 080、985、887、807 cm-1處出現(xiàn)4個(gè)特征峰，分別歸屬磷氧振動(P-Oa)、鎢氧振動(W-Od)和橋氧對稱伸縮振動(W-Ob1-W、W-Ob2-W)，證明PW9M4具有Finke型結(jié)構(gòu).催化劑的XRD見圖2.由圖2可見：2θ在8°、18°、28°和30°都出現(xiàn)了較為突出的X射線衍射峰，這與Finke型多酸化合物的衍射峰位置基本一致[31]，再次證明合成的催化劑具有Finke型結(jié)構(gòu).

圖1 PW9M4紅外光譜Fig.1 FTIR spectra of PW9M4

圖2 PW9M4的XRD譜 Fig.2 XRD patterns of PW9M4

2.2 P2W15M4結(jié)構(gòu)表征

P2W15M4系列多酸催化劑的紅外光譜見圖3.由圖3可見：在1 170、970、950、615 cm-1處均出現(xiàn)4個(gè)特征峰，分別歸屬磷氧振動(P-Oa)、鎢氧振動(W-Od)和橋氧對稱伸縮振動(W-Ob1-W、W-Ob2-W)，與文獻(xiàn)[30]報(bào)道一致，證明P2W15M4保持了Finke型結(jié)構(gòu).圖4為P2W15M4的XRD譜圖.由圖4可見：合成的樣品在2θ為7°、16°、18°和28°的4個(gè)特征峰與Finke型多酸化合物的衍射峰位置基本一致[30]，與IR表征結(jié)果一致.

圖3 P2W15M4紅外光譜Fig.3 FTIR spectra of P2W15M4

圖4 P2W15M4的XRD譜Fig.4 XRD patterns of P2W15M4

反應(yīng)條件：200 μL PW9M4，80 μL DA，40 μL H2O2，15 min.圖5 PW9M4顯色檢測DA結(jié)果 Fig.5 PW9M4 for the detection of DA

2.3 PW9M4顯色檢測DA性能

由于金屬氧化性不同，PW9M4系列催化劑中取代金屬種類對DA顯色檢測結(jié)果具有較大影響.PW9M4顯色檢測DA結(jié)果見圖5.由圖5可見：PW9M4活性順序?yàn)镻W9Cu4>PW9Co4>PW9Mn4>PW9Zn4，其中PW9Cu4顯色檢測DA的催化活性最好.圖6為PW9Cu4顯色檢測DA顏色變化.由圖6可見：沒有加入PW9Cu4時(shí)，反應(yīng)15 min溶液顏色為無色透明(圖6 a)；加入PW9Cu4顯色15 min后，可看到溶液顏色為明顯的橙紅色(圖6 b)，這是由于H2O2可將DA氧化成橙紅色的多巴胺醌類物質(zhì)，其最大吸收波長位于475 nm，因此，可通過測定溶液在475 nm處的吸光度來檢測DA的含量；當(dāng)反應(yīng)時(shí)間超15 min后，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，溶液顏色逐漸變?yōu)楹稚?圖6 c、6 d)，這是因?yàn)槌壬陌坊乜梢灾匦陆M合為5，6-二羥基吲哚(5，6-Dihydroxyindole，DHI)，后者進(jìn)一步被氧化為吲哚5，6-醌(Indole-5，6-quinone，IQ)，最終產(chǎn)生深棕色神經(jīng)黑色素.

反應(yīng)條件：a.DA+H2O2，15 min；b.DA+PW9Cu4+H2O2，15 min；c.DA+PW9Cu4+H2O2，20 min；d.DA+PW9Cu4+H2O2，30 min.圖6 PW9Cu4顯色檢測DA顏色 Fig.6 Detection of DA by PW9Cu4

圖7 a為PW9Cu4用量對DA顯色反應(yīng)的影響.結(jié)果可見：PW9Cu4用量由120 μL增加至240 μL時(shí)，吸光度逐漸增大；PW9Cu4用量為200 μL時(shí)，吸光度達(dá)到最大值；繼續(xù)增加PW9Cu4用量，吸光度反而減小，這是由于PW9Cu4的用量雖然增加了，但整個(gè)反應(yīng)體系的H2O2用量保持不變，且隨著PW9Cu4濃度增大，H2O2濃度降低，溶液吸光度下降.因此，選擇200 μL作為催化劑的最佳用量.

圖7 b為H2O2用量對顯色反應(yīng)的影響.結(jié)果可見：吸光度隨H2O2用量增加而逐漸增大；當(dāng)H2O2用量為40 μL時(shí)，吸光度達(dá)到最大值；繼續(xù)增加H2O2用量，吸光度反而減小.雖然H2O2用量增大，但整個(gè)反應(yīng)體系的PW9Cu4用量保持不變，且隨著H2O2用量增大，單位體積內(nèi)PW9Cu4活性中心減少，溶液吸光度下降.因此，選擇40 μL作為H2O2的最佳用量.

圖7 c為反應(yīng)時(shí)間對顯色反應(yīng)的影響.結(jié)果可見：當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為15 min時(shí)，吸收曲線峰形明顯，吸光度達(dá)到最大值；繼續(xù)增加反應(yīng)時(shí)間，峰形發(fā)生變化，且吸光度增加很小，這主要是由于反應(yīng)時(shí)間延長，橙色的胺基色素重新組合為DHI，后者進(jìn)一步被氧化為褐色I(xiàn)Q，所以選擇15 min為最佳反應(yīng)時(shí)間.

在最佳反應(yīng)條件下檢測DA的線性范圍和檢出限，結(jié)果見圖7 d.結(jié)果可見：當(dāng)DA用量由5 μL增加至80 μL時(shí)，吸光度逐漸增加；DA用量為80 μL時(shí)，吸光度達(dá)到最大.DA的線性范圍3.17×10-5～4.85×10-4mol/L，檢出限為3.17×10-5mol/L.

反應(yīng)條件：a.80 μL DA，40 μL H2O2，15 min；b.200 μL PW9Cu4，80 μL DA，15 min；c.200 μL PW9Cu4，80 μL DA，40 μL H2O2；d.200 μL PW9Cu4，40 μL H2O2，15 min.圖7 PW9Cu4顯色檢測DA的最佳檢測條件Fig.7 Optimum reaction condition for colorimetric detection of DA by PW9Cu4

2.4 P2W15M4顯色檢測DA性能

在P2W15M4系列催化劑對DA顯色檢測性能測試中，僅有P2W15Cu4對DA具有顯色檢測效果.顯色15 min，溶液顏色由無色變?yōu)槊黠@的橙色(圖8 b)，隨著顯色時(shí)間的增加，溶液吸光度逐漸增加；反應(yīng)時(shí)間增加至40 min，溶液顏色仍為穩(wěn)定的橙色(圖8 c)，且溶液吸收光譜峰形沒有發(fā)生變化(圖9 c).文獻(xiàn)[32]報(bào)道的SiW9Co3和本研究中使用的PW9Cu4催化劑最佳顯色時(shí)間分別為10 min和15 min，P2W15Cu4顯色檢測DA的時(shí)間沒有明顯增長(15 min)，且延長反應(yīng)時(shí)間后，SiW9Co3和PW9Cu4顯色的溶液顏色均呈現(xiàn)深褐色，不但吸收光譜峰形變差，而且吸光度變化不明顯.P2W15Cu4在顯色檢測40 min時(shí)溶液顏色和峰形均沒有發(fā)生明顯變化，證明P2W15Cu4溫和的氧化性對DA顯色檢測具有良好的顯色穩(wěn)定性.

反應(yīng)條件：a.DA+H2O2，15 min；b.DA+P2W15Cu4+H2O2，15 min；c.DA+P2W15Cu4+H2O2，40 min；d.DA+P2W15Cu4+H2O2，60 min.圖8 P2W15Cu4顯色檢測DA的顏色Fig.8 Photographs of detection of DA by P2W15Cu4

在P2W15Cu4顯色檢測DA性能測試中，研究了催化劑用量(圖9 a)、H2O2用量(圖9 b)、反應(yīng)時(shí)間(圖9 c)對DA顯色反應(yīng)的影響.結(jié)果表明：當(dāng)DA用量為50 μL時(shí)，H2O2的最佳用量為140 μL，P2W15Cu4的最佳用量為200 μL，15 min為最佳反應(yīng)時(shí)間.在最佳反應(yīng)條件下，顯色檢測DA的線性范圍和檢出限見圖9 d.結(jié)果顯示：線性范圍為3.68×10-5～2.96×10-4mol/L，檢出限為3.68×10-5mol/L.上述結(jié)果表明：P2W15Cu4催化劑在中性介質(zhì)中對顯色檢測DA具有較高的靈敏度.

反應(yīng)條件：a.200 μL P2W15Cu4，50 μL DA，15 min；b.50 μL DA，140 μL H2O2，15 min；c.200 μL P2W15Cu4，50 μL DA，140 μL H2O2；d.200 μL P2W15Cu4，140 μL H2O2，15 min.圖9 P2W15Cu4顯色檢測DA的最佳檢測條件Fig.9 Optimum detection condition for colorimetric detection of DA by P2W15Cu4

PW9Cu4顯色檢測DA反應(yīng)條件：80 μL干擾 (8 mmol/L)，200 μL PW9Cu4，80 μL DA，40 μL H2O2，顯色時(shí)間15 min；P2W15Cu4顯色檢測DA反應(yīng)條件：50 μL干擾 (8 mmol/L)，200 μL P2W15Cu4，50 μL DA，140 μL H2O2，15 min.圖10 干擾物質(zhì)對顯色檢測的影響Fig.10 Effect of interferences on colorimetric detection of DA

2.5 干擾物質(zhì)對多巴胺顯色檢測的影響

由于DA結(jié)構(gòu)中存在氨基，而氨基是與催化劑發(fā)生顯色的主要基團(tuán)，為消除其結(jié)構(gòu)對顯色反應(yīng)的影響，選擇尿素、葡萄糖、丙氨酸、甘氨酸、Vc為干擾物質(zhì)測試催化劑對DA顯色檢測的特異性，結(jié)果見圖10.結(jié)果表明：干擾物質(zhì)的加入沒有導(dǎo)致溶液吸光度增高，干擾物質(zhì)與多酸沒有發(fā)生顯色反應(yīng)，說明兩種催化劑對DA檢測均具有特異性.

3 結(jié) 論

本次研究制備了不同金屬取代的Finke型鎢系多酸催化劑PW9M4(M為Co、Cu、Mn和Zn)和P2W15M4(M為Co、Cu和Zn)，采用FT-IR和XRD表征催化劑結(jié)構(gòu)，用UV-Vis定量檢測DA.結(jié)果表明：PW9Cu4和P2W15Cu4顯色檢測DA的催化活性最好.干擾物質(zhì)(如尿素、葡萄糖、丙氨酸、甘氨酸、Vc等)的加入沒有使待測溶液吸光度增大，表明PW9Cu4和P2W15Cu4對DA顯色檢測具有特異性；PW9Cu4顯色檢測DA線性范圍為3.17×10-5～4.85×10-4mol/L，檢出限為3.17×10-5mol/L；P2W15Cu4顯色檢測DA線性范圍為3.68×10-5～2.96×10-4mol/L，檢出限為3.68×10-5mol/L，該催化劑具有更高的顯色穩(wěn)定性.綜上所述，PW9Cu4和P2W15Cu4對顯色檢測DA具有較高靈敏度和選擇性，顯色反應(yīng)可在中性介質(zhì)中進(jìn)行，分析過程簡便快捷，具有潛在、廣泛的應(yīng)用價(jià)值.