宋立強(qiáng)，張博淼，薛偉男，崔濱濱

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院結(jié)直腸外科，哈爾濱150081

結(jié)腸癌是消化道常見惡性腫瘤，2018年統(tǒng)計(jì)顯示，我國結(jié)腸癌發(fā)病率居惡性腫瘤第3位，新發(fā)病例達(dá)37.6萬例［1］。目前結(jié)腸癌發(fā)病機(jī)制尚不完全明確，唯一可治愈的手段為根治性手術(shù)切除，但大多數(shù)患者確診時(shí)已達(dá)中晚期，即使可進(jìn)行手術(shù)治療，也易出現(xiàn)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移［2］。因此，亟需尋找潛在診治靶點(diǎn)。微小RNA（miRNA）是一種進(jìn)化上高度保守的單鏈非編碼小分子RNA，可通過調(diào)控靶基因表達(dá)參與腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲等生物學(xué)過程［3］。miR-129-5p為miR-129成熟產(chǎn)物，miR-129-5p在喉癌中呈高表達(dá)［4］，但在乳腺癌、結(jié)腸癌中呈低表達(dá)［5-6］。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）是一種神經(jīng)營養(yǎng)物質(zhì)，可促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞分化、生長、修復(fù)等。近年研究報(bào)道，BDNF與包括結(jié)腸癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤發(fā)生密切相關(guān)，參與腫瘤轉(zhuǎn)移、血管新生等過程［7］。miR-129-5p和BDNF在結(jié)腸癌中表達(dá)異常，在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，但關(guān)于兩者與結(jié)腸癌臨床病理特征和預(yù)后關(guān)系的研究較少。本研究對此做了探討。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2015年1月—2017年12月本院收治的結(jié)腸癌患者118例，男70例，女48例；年齡34～76（53.11 ± 10.54）歲；腫瘤直徑＞5 cm 53例，≤5 cm 65例；腫瘤分化程度：高中分化71例，低分化47例；TNM分期［8］：Ⅰ、Ⅱ期64例，Ⅲ期54例；浸潤深度：T1、263例，T3、455例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移56例。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)病理檢查確診為原發(fā)性結(jié)腸癌；初次確診，未接受任何治療；臨床病理資料完整；接受根治性或姑息性手術(shù)。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他部位腫瘤；嚴(yán)重心、肝、腎等臟器疾??；全身感染性疾病；血液系統(tǒng)疾病。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)；患者及家屬均知情同意。

1.2 組織中miR-129-5p、BDNFmRNA表達(dá)檢測 采用qRT-PCR。取術(shù)中切除的結(jié)腸癌組織及癌旁組織（距離腫瘤組織邊緣≥5 cm）。TRIzol總RNA抽提試劑盒（北京艾德萊生物科技有限公司）提取組織中總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，Qiagen逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（上海易匯生物科技有限公司）合成cDNA，加入miR-129-5p、BDNF引物，miR-129-5p正向引物5'-GTCGTATGCTAGCGTGCTTG-3'，反 向 引 物 5'-CAAATATCCGCCCAGTATTG-3'；U6 正 向 引 物 5'-GTCCTATATGGTCATTCCGA-3'，反 向 引 物 5'-ATACGACATTTTCGGCATGG-3'；BDNF正向引物5'-TTAGCGAGTGGGTCACAGCG-3'，反向引物 5'-ATTGGGTAGTTCGGCATTGC-3'；β-actin正向引物 5'-CACGATCGAGGCCGACTATC-3'，反向引物5'-TAATGACGAGATGCAACAGT-3'。分別以U6、β-actin為內(nèi)參校正，進(jìn)行qRT-PCR檢測。反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex TaqⅡ 12.5 μL、上游引物2 μL、下游引物2μL、DNA 模板 2μL、dH2O 8.5μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s循環(huán)40次。用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對表達(dá)量。

1.3 隨訪 患者出院后均通過門診或電話方式隨訪，隨訪至2020年12月，統(tǒng)計(jì)3年總生存率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS26.0統(tǒng)計(jì)軟件。偏態(tài)分布或方差不齊的計(jì)量資料以中位數(shù)（上四分位數(shù)，下四分位數(shù)）［M（QL，QU）］表示，比較采用Z檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)法；繪制Kaplan-Meier法生存曲線，生存率比較采用Log-rank檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)腸癌及癌旁組織中miR-129-5p、BDNFmRNA表達(dá)比較 結(jié)腸癌及癌旁組織中miR-129-5p相對表 達(dá) 量 分 別 為 0.67（0.54，0.83）、1.02（0.83，1.24），BDNF相對表達(dá)量分別為2.58（1.97，3.11）、1.66（1.49，1.79）。與癌旁組織比較，結(jié)腸癌組織中miR-129-5p相對表達(dá)量低，BDNF相對表達(dá)量高（P均＜0.05）。

2.2 miR-129-5p、BDNF mRNA表達(dá)與結(jié)腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系 miR-129-5p、BDNFmRNA表達(dá)與結(jié)腸癌分化程度、TNM分期、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P均＜0.05），與患者性別、年齡、腫瘤直徑無關(guān)（P均＞0.05）。見表1。

表1 miR-129-5p、BDNF mRNA表達(dá)與結(jié)腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系

2.3 結(jié)腸癌組織中miR-129-5p表達(dá)與BDNFmRNA表達(dá)的相關(guān)性 Spearman相關(guān)性分析顯示，結(jié)腸癌組織中miR-129-5p表達(dá)與BDNF mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（rs=-5.174，P＜0.05）。

2.4 miR-129-5p、BDNF mRNA表達(dá)與結(jié)腸癌患者預(yù)后的關(guān)系 隨訪3～36個(gè)月，中位隨訪時(shí)間16個(gè)月，無失訪病例，存活69例，總生存率為58.47%（69/118）。 以 結(jié) 腸 癌 組 織 中 miR-129-5p、BDNF mRNA表達(dá)的中位數(shù)為基準(zhǔn)，將結(jié)腸癌患者分為高、低表達(dá)組。miR-129-5p高表達(dá)組3年總生存率為79.03%（49/62），miR-129-5p低表達(dá)組3年總生存率為37.50%（21/56）；BDNF高表達(dá)組3年總生存率為39.62%（21/53），BDNF低表達(dá)組3年總生存率為73.85%（48/65）。miR-129-5p高表達(dá)組3年總生存率高于miR-129-5p低表達(dá)組，BDNF高表達(dá)組3年總生存率低于BDNF低表達(dá)組（P均＜0.05）。

3 討論

我國是結(jié)腸癌新發(fā)病例和死亡病例數(shù)最多的國家，已嚴(yán)重影響和威脅居民生命健康。早期結(jié)腸癌主要臨床表現(xiàn)為大便性狀改變、排便習(xí)慣改變、腹部腫塊、腹痛或不適等，多不具備典型特征，未能引起患者注意。因此，大多確診時(shí)已達(dá)中晚期，失去最佳治療時(shí)機(jī)［9］。結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展是多因素、多基因參與的復(fù)雜過程，亟需了解其分子機(jī)制，以尋找理想的診斷標(biāo)志物和特異性治療靶點(diǎn)。

隨著基因組測序技術(shù)的快速發(fā)展，近年來越來越多無蛋白質(zhì)編碼功能的RNA被發(fā)現(xiàn)。miRNA是一類長19～25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼小RNA，具備轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)功能，多位于腫瘤相關(guān)的脆性位點(diǎn)或基因區(qū)域，廣泛參與腫瘤病理生理過程［10-11］。miR-129-5p為miR-129-1和miR-129-2共同轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，近年研究報(bào)道其在多種惡性腫瘤中發(fā)揮重要作用。如miR-129-5p在肺癌組織中表達(dá)顯著下調(diào)，可通過靶向抑制血管內(nèi)皮生長因子抑制癌細(xì)胞遷移和侵襲能力［12］。miR-129-5p在肝癌組織中表達(dá)下調(diào)，上調(diào)其表達(dá)可通過調(diào)節(jié)鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶4抑制癌細(xì)胞增殖、遷移、入侵［13］。但在喉癌組織中miR-129-5p表達(dá)顯著上調(diào)，可通過靶向含WW結(jié)構(gòu)域的E3泛素蛋白連接酶1促進(jìn)癌細(xì)胞增殖和入侵［4］。提示miR-129-5p可通過調(diào)控下游靶基因發(fā)揮促癌或抑癌基因作用。本研究結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組織中miR-129-5p表達(dá)明顯低于癌旁組織，與腫瘤分化程度、TNM分期、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。說明miR-129-5p可能參與調(diào)控結(jié)腸癌分化、侵襲、轉(zhuǎn)移等生物功能，具有抑癌基因作用。本研究結(jié)果還顯示，miR-129-5p高表達(dá)組術(shù)后3年總生存率高于miR-129-5p低表達(dá)組，說明miR-129-5p可能成為評估結(jié)腸癌預(yù)后的生物標(biāo)志物。胡俊華等［14］將miR-129-5p轉(zhuǎn)染至結(jié)腸癌藥細(xì)胞株LoVo/5-氟尿嘧啶，發(fā)現(xiàn)miR-129-5p可通過靶定胸苷酸合成酶增加癌細(xì)胞對5-氟尿嘧啶的敏感性，提升5-氟尿嘧啶抗腫瘤作用，細(xì)胞毒性檢測也顯示，轉(zhuǎn)染細(xì)胞半數(shù)致死濃度從（1 089.70±5.86）μg/L降至（261.40±6.81）μg/L，進(jìn)一步說明miR-129-5p可能成為結(jié)腸癌新的治療靶點(diǎn)。

BDNF為神經(jīng)營養(yǎng)因子家族一員，主要分布于內(nèi)分泌系統(tǒng)、外周神經(jīng)系統(tǒng)、大腦中樞神經(jīng)系統(tǒng)，定位于細(xì)胞質(zhì)，可通過結(jié)合其配體酪氨酸激酶受體B，維持腦細(xì)胞正常生理功能［15］。近年研究發(fā)現(xiàn)，多種惡性腫瘤中可檢測到BDNF高表達(dá)，提示BDNF與腫瘤惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)。如非小細(xì)胞肺癌組織中BDNF表達(dá)顯著上調(diào)，可通過PI3K/Akt信號通路促進(jìn)癌細(xì)胞增殖［16］。肝癌組織中BDNF表達(dá)顯著上調(diào)，可通過抑制miR-584表達(dá)促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、侵襲、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移［17］。本研究結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組織中BDNF表達(dá)明顯高于癌旁組織，與分化程度、TNM分期、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，說明BDNF可能參與結(jié)腸癌分化、侵襲、轉(zhuǎn)移等生物功能，具有促癌基因作用，但關(guān)于其作用機(jī)制尚不明確。Ras/MAPK和PI3K/Akt信號通路異常與細(xì)胞生存、增殖、惡性轉(zhuǎn)變等過程相關(guān)，也參與了結(jié)腸癌進(jìn)程［18］。研究表明，BDNF可通過Ras/MAPK和PI3K/Akt信號通路為腫瘤增殖和存活提供正向刺激信號［7］。因此推測BDNF可能通過Ras/MAPK和PI3K/Akt信號通路參與結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展，這有待進(jìn)一步研究證實(shí)。本研究結(jié)果顯示，BDNF高表達(dá)組總生存率明顯低于BDNF低表達(dá)組，說明BDNF可能成為評估結(jié)腸癌預(yù)后的生物標(biāo)志物。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌組織中miR-129-5p、BDNF表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，提示在結(jié)腸癌中miR-129-5p與BDNF可能存在靶向調(diào)控關(guān)系，共同影響結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展。近期研究報(bào)道，多發(fā)性骨髓瘤中過表達(dá)miR-129-5p能抑制RPMI8226細(xì)胞增殖，與BDNF表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，miR-129-5p與BDNF存在結(jié)合位點(diǎn)，雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證兩者存在靶向關(guān)系［19］。但對于miR-129-5p是否能靶向負(fù)向調(diào)控結(jié)腸癌BDNF表達(dá)發(fā)揮作用尚不明確，還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，結(jié)腸癌組織中miR-129-5p低表達(dá)，BDNF高表達(dá)，二者表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，與結(jié)腸癌分化、侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)，有望成為結(jié)腸癌診斷和預(yù)后評估的標(biāo)志物。但本研究樣本量較少，隨訪時(shí)間較短，還需大樣本研究進(jìn)一步分析miR-129-5p與BDNF的關(guān)系。