陳廣，魏東，蘇琨，雷學芬，王滔，洪茂林，房立銳

1昆明醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院肝膽胰外科，昆明650000；2昆明醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院腫瘤科

原發(fā)性膽囊癌是一種起源于膽囊黏膜上皮的惡性腫瘤，在全世界范圍內(nèi)其發(fā)病率居消化道腫瘤的第六位［1］。全球不同地區(qū)發(fā)病率有較大差異，發(fā)達國家發(fā)病率低，發(fā)展中國家發(fā)病率高，甚至有些種族和地區(qū)達到了流行病水平［2-3］。膽囊結(jié)石、慢性膽囊炎、膽囊息肉、肥胖等是膽囊癌的主要病因［4］。由于膽囊癌早期癥狀不明顯，且缺乏常規(guī)的敏感篩查測試，膽囊癌早期診斷困難，超過50%的膽管癌和膽囊癌在晚期才被診斷，大多數(shù)患者已經(jīng)出現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，失去了最佳手術(shù)機會，只有小部分患者能進行根治手術(shù)［5-6］，患者5年總生存率僅為5%［7］。膽囊癌的復(fù)發(fā)、侵襲、轉(zhuǎn)移仍是患者的主要致死原因。因此，加強膽囊癌相關(guān)分子機制的研究具有十分重要的臨床意義。WWOX基因是2000年Bednarek等通過鳥槍基因測序技術(shù)鑒定和克隆出來的一種新的抑癌基因。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，WWOX通過上調(diào)p53家族轉(zhuǎn)錄因子、p53上調(diào)凋亡調(diào)節(jié)因子的表達誘導膽囊癌細胞凋亡，然而WWOX對膽囊癌細胞遷移、侵襲的調(diào)控作用及機制仍不明確。2019年6月—2020年1月，本研究對此做了探討。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑及儀器 膽囊癌細胞系GBC-SD購自中國科學院昆明動物所細胞庫。WWOX慢病毒質(zhì)粒EX-S0456-Lv201購于廣州Genecopoeia公司。胎牛血清購自美國Gibco Life Technologies公司，EDTA-胰酶購自美國Millipore公司，Matrigel基質(zhì)膠、Transwell小室購自美國Corning公司。WWOX、轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）一抗分別購自美國Proteintech group公司、英國Abcam公司。ELISA試劑盒購自欣博盛生物科技有限公司。恒溫細胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司，qRT-PCR儀購自美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，熒光顯微鏡購自美國Gibco Life Technologies公司。

1.2 細胞培養(yǎng) 將GBC-SD細胞快速復(fù)蘇后加入5～6 mL含有10%FBS和1%青鏈霉素雙抗的DMEM完全培養(yǎng)基，搖勻后置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，次日更換1次培養(yǎng)液后繼續(xù)培養(yǎng)，2～3 d更換1次培養(yǎng)液。待細胞生長匯合度80%～90%時，用胰酶進行消化傳代。

1.3 慢病毒包裝及滴度測定 WWOXX慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，按照Endo-Free midi Plasmid Kit試劑盒說明書進行質(zhì)粒抽提，收集擴增的質(zhì)粒樣品并用分光光度計測定濃度。按照Lenti-PacTMHIV慢病毒包裝試劑盒說明書對重組慢病毒進行包裝濃縮，收集WWOX過表達慢病毒，并通過絕對定量qRT-PCR檢測慢病毒滴度。

1.4 轉(zhuǎn)染 將GBC-SD細胞隨機分為三組，按2.0×105/孔接種在6孔板中，在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，細胞貼壁。每孔加入60μL的重組慢病毒感染GBC-SD細胞，三組分別加入等量的WWOX過表達慢病毒（WWOX組）、陰性對照慢病毒（NEG組）、完全培養(yǎng)液（GBC-SD組）。加入6μg/mL的聚凝胺，提高病毒的轉(zhuǎn)染效率。感染后12 h，用DMEM完全培養(yǎng)液更換舊的培養(yǎng)基，并放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，加入含3μg/mL嘌呤霉素的新鮮完全培養(yǎng)基，殺死未成功轉(zhuǎn)染的細胞，進行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株篩選。每隔2 d換液1次，至細胞感染陽性率80%以上，將篩選出的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞傳代擴大培養(yǎng)，收集細胞進行后續(xù)實驗。

1.5 GBC-SD細胞內(nèi)WWOX、TGF-β1mRNA表達檢測 采用qRT-PCR。GBC-SD細胞匯合度生長至80%左右時，用胰酶消化細胞并收集，每孔加入TRIzol裂解液1 mL充分裂解細胞。每孔加入氯仿200μL，充分振蕩混勻約15 s，按照RNA提取試劑盒的標準步驟操作提取細胞的總RNA，加入50μL RNase-Free ddH2O充分溶解RNA。根據(jù)GeneBank的WWOX、TGF-β1核苷酸序列設(shè)計引物，內(nèi)參基因為GAPDH。WWOX正向引物5'-ATAATCCGACCAAGCCAACC-3'，反向引物5'-TGCCATTCTTCTAAAATGCG-3'。 TGF- β1的 正 向 引 物 5'-TGGAAACCCACAACGAAATCTA-3'，反向引物 5'-TGGAAACCCACAACGAAATCTA-3'。GAPDH 的 正 向引物 5'-CGCTGAGTACGTCGTGGAGTC-3'，反向引物：5'-GCTGATGATCTTGAGGCTGTTGTC-3'。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，-80℃保存，以防止降解。按照SYBR?Green qPCR試劑盒說明書進行qRT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系：SYBR Green/ROX qRT-PCR Master Mix（2×）10 μL ，PCR Forward Primer 1 μL，PCR Reverse Primer 1 μL，2 μL Template DNA，添加Nuclease-free Water使總體積為20μL。PCR擴增參數(shù)：95℃ 10 min，95℃ 10 s、60 ℃ 20 s、72 ℃ 30 s共循環(huán)40次。用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。

1.6 GBC-SD細胞內(nèi)WWOX、TGF-β1蛋白表達檢測 采用Western blotting法。取生長良好的GBCSD細胞，用胰酶消化，離心棄上清，加入RIPA蛋白裂解液，4℃12 000 r/min離心10 min，收集上清液，按照BCA蛋白定量試劑盒說明書測定蛋白濃度。根據(jù)蛋白分子量大小，配置分離膠和壓縮膠，取40μL提取蛋白和10μL蛋白上樣緩沖液混合物上樣，聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜，含5%脫脂奶粉TBST溶液進行封閉，用WWOX、TGF-β1（稀釋比例1∶1 000）一抗4℃孵育過夜，二抗室溫孵育1.5 h。然后TBST洗膜，每次5 min，洗滌6次。將PVDF膜包好置于暗盒中，ECL發(fā)光檢測，根據(jù)蛋白灰度值分析表達情況。蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值。

1.7 GBC-SD細胞遷移能力檢測 采用劃痕實驗。用標記筆在6孔板的背面畫3條長的直線，分別橫穿過3個孔。將細胞按2×105/mL接種在6孔板中，每組設(shè)置3個復(fù)孔，加入DMEM完全培養(yǎng)液。將6孔板置于37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)至細胞匯合度80%～90%，用無菌200μL槍頭沿著直尺畫垂直于6孔板背后的黑色劃線的劃痕。用PBS漂洗細胞3次，盡量洗去劃掉的不貼壁細胞，加入FBS。將6孔板置于37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別培養(yǎng)0、24 h在顯微鏡下拍照相同位置的劃痕。用Image J軟件分析各組細胞不同時間段的照片，比較GBC-SD細胞遷移的速度和愈合度。細胞劃痕愈合度=（0 h劃痕面積-24 h劃痕面積）/0 h劃痕面積。

1.8 GBC-SD細胞侵襲能力檢測 采用Transwell侵襲實驗。在Transwell小室上室中加入50μL基質(zhì)膠（該基質(zhì)膠由濃度為20.23 mg/mL的matrigel和無血清培養(yǎng)液按照1∶12混合），在4℃冰箱放置10 min，然后放在37℃培養(yǎng)箱中孵育2 h使基質(zhì)膠凝固。分別取200μL細胞懸液（細胞濃度為2×105/mL）添加到Transwell上室，在24孔板中（下室）添加500μL含10%FBS的完全培養(yǎng)基，細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)36 h，取出Transwell小室并用槍頭吸出小室中的培養(yǎng)液，放入干凈的6孔板中，用PBS漂洗2次，然后用棉簽輕輕擦除上室中的matrigel基質(zhì)膠和殘留細胞，然后再用PBS漂洗2次，再用4%多聚甲醛室溫下固定30 min，PBS洗3次，用0.2%結(jié)晶紫染色20 min后，倒立放置等待其自然風干。將小室置于顯微鏡下隨機選3個視野拍照（×200高倍鏡下），然后計數(shù)細胞，取平均數(shù)。

1.9 GBC-SD細胞上清液中TGF-β1胞外分泌量檢測 采用ELISA法。培養(yǎng)48 h后收集GBC-SD細胞的上清液，把稀釋后的標準品100μL加到標準品孔中，再把樣品100μL加到樣品孔中，室溫孵育90 min，設(shè)置空白對照孔。每孔加入生物素化抗體工作液100μL，室溫孵育60 min，洗板5次，每個孔再加入 HRP-Conjugate工作液100μL，室溫避光孵育30 min。用洗滌液洗滌3次。干燥后，每孔加入TMB顯色底物100μL，室溫孵育15 min。最后每個孔加入終止液100μL，終止反應(yīng)（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。立即測量各孔在450 nm波長下的吸光度值。

1.10 統(tǒng)計學方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件。計量資料用±s表示，多組比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 WWOX過表達的慢病毒包裝及滴度 將WWOX的慢病毒質(zhì)粒與Lenti-PacTMHIV混合包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞，48 h后，在熒光顯微鏡下觀察，可見大量綠色熒光蛋白表達，轉(zhuǎn)染效率大于80%，細胞生長狀態(tài)良好，提示W(wǎng)WOX過表達的慢病毒包裝成功。將包裝成功的慢病毒顆粒進行滴度測定，結(jié)果為5.10×107IU/mL。

2.2 各組細胞WWOX表達比較 與NEG組、GBCSD組比較，WWOX組細胞WWOX mRNA及蛋白相對表達量均高（P均＜0.05）；NEG組、GBC-SD組細胞WWOX mRNA及蛋白相對表達量比較差異均無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05）。見表1。

表1 各組細胞WWOX表達情況（±s）

表1 各組細胞WWOX表達情況（±s）

組別WWOX組NEG組GBC-SD組WWOX mRNA 1.56±0.13 0.82±0.03 0.94±0.01蛋白1.15±0.11 0.50±0.05 0.54±0.05

2.3 各組細胞劃痕愈合度、細胞侵襲數(shù)比較 與NEG組、GBC-SD組比較，WWOX組細胞劃痕愈合度低、細胞侵襲數(shù)少（P均＜0.05），NEG組、GBC-SD組細胞劃痕愈合度、細胞侵襲數(shù)比較差異無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05）。見表2。

表2 各組細胞劃痕愈合度、細胞侵襲數(shù)（±s）

表2 各組細胞劃痕愈合度、細胞侵襲數(shù)（±s）

組別WWOX組NEG組GBC-SD組細胞劃痕愈合度（%）28.67±3.63 44.70±3.28 46.93±2.44細胞侵襲數(shù)（個）68.00± 4.36 184.33± 9.45 179.00±15.72

2.4 各組TGF-β1表達比較 與NEG組、GBC-SD組比較，WWOX組細胞內(nèi)TGF-β1mRNA、蛋白相對表達量低，細胞上清液中TGF-β1水平低（P均＜0.05）；NEG組、GBC-SD組細胞內(nèi)TGF-β1mRNA、蛋白相對表達量及細胞上清液中TGF-β1水平比較差異均無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05）。見表3。

表3 各組TGF-β1表達情況（-x± s）

3 討論

WWOX是位于16號染色體q23.3～24.1區(qū)域的脆性位點抑癌基因，-NH2末端含有2個WW結(jié)構(gòu)域，-COOH末端含有1個短鏈脫氫還原酶結(jié)構(gòu)域.WWOX 蛋 白 通 過 與 Jun、P53、p73、Ap2α、ErbB4、RUNXs等蛋白結(jié)合實現(xiàn)其功能［8］。WWOX在骨肉瘤［9］、鼻咽癌［10］、宮頸癌［11］、卵巢癌［12］、乳腺癌［13］等多種腫瘤組織或細胞中表達降低甚至缺失，并與腫瘤的增殖、凋亡和侵襲、遷移密切相關(guān)。WWOX過表達可抑制OS、HOS和LM-7等骨肉瘤細胞的遷移和侵襲，且WWOX在確定骨肉瘤細胞侵襲性表型中起關(guān)鍵作用［14］。QU等［9］的研究也證實，WWOX過表達可抑制骨肉瘤細胞增殖、遷移和侵襲，敲低WWOX可增強骨肉瘤細胞的增殖、遷移和侵襲。WWOX過表達顯著抑制鼻咽癌細胞CNE2的增殖及侵襲和遷移［15］。WWOX過表達可下調(diào)卵巢癌細胞（HO8910、SKOV3）中上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)蛋白的表達，并抑制腫瘤細胞的遷移和侵襲［16］。WWOX失活與晚期三陰性乳腺癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，WWOX表達陰性的腫瘤細胞中WWOX的異位恢復(fù)可抑制轉(zhuǎn)移，而WWOX表達陽性的腫瘤細胞中的WWOX耗竭則促進轉(zhuǎn)移［17］。WWOX可能通過調(diào)節(jié)乳腺癌細胞干性和EMT在化療藥物抗性、腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)中起關(guān)鍵作用［18］。上述研究結(jié)果提示，WWOX可能是一個廣譜抑癌基因，參與腫瘤的侵襲遷移過程。本研究旨在探討WWOX在膽囊癌細胞侵襲遷移過程中的作用及其可能的機制。為明確WWOX作為膽囊癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因子提供理論依據(jù)，為膽囊癌的靶向治療提供新的思路。

我們前期研究發(fā)現(xiàn)，WWOX在膽囊癌組織中呈低表達或缺失狀態(tài)，并且與腫瘤TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。本研究將WWOX過表達的慢病毒質(zhì)粒包裝構(gòu)建成慢病毒顆粒，以便取得更好的轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染后，WWOX組GBC-SD細胞中WWOX mRNA和蛋白表達均明顯高于對照組，這表明轉(zhuǎn)染成功，并在細胞內(nèi)實現(xiàn)轉(zhuǎn)錄和翻譯。過表達WWOX抑制GBC-SD膽囊癌細胞的遷移、侵襲，與之前的報道一致。

TGF-β是生長因子家族中的成員，是相對分子質(zhì)量為25 kD的二聚體蛋白，可調(diào)節(jié)細胞的生長、分化。TGF-β 有 3 種亞型，分別為 TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3，目前研究最多的是 TGF-β1。TGF-β1是一種多功能細胞因子，廣泛分布于多種組織細胞內(nèi)，可誘導腫瘤細胞EMT，并對細胞侵襲、遷移等惡性生物學行為有促進作用［19-21］。CHOU 等［22］發(fā)現(xiàn)，外源性TGF-β輔助WWOX表達陰性的細胞共同向前遷移，并與WWOX表達陽性的細胞融合。轉(zhuǎn)移性WWOX表達陰性的腫瘤細胞常分泌高水平的TGF-β。YANG等［23］發(fā)現(xiàn)，在人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞系U251中過表達WWOX，可以降低細胞內(nèi)凋亡相關(guān)因子配體和TGF-β表達。本研究結(jié)果表明，過表達WWOX可降低GBC-SD膽囊癌細胞中TGF-β1mRNA和蛋白表達，并且抑制其胞外分泌。

綜上所述，WWOX能夠抑制膽囊癌細胞的遷移、侵襲，其作用機制可能與下調(diào)TGF-β1表達、胞外分泌有關(guān)。這一實驗結(jié)果豐富了膽囊癌侵襲、遷移的分子機制，也為臨床晚期膽囊癌的治療提供了理論基礎(chǔ)。