祁占花，張建業(yè)，楊世榮

1青海省交通醫(yī)院麻醉科，西寧810000；2青海省交通醫(yī)院普外科；3青海省第五人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科

胃癌是臨床常見的消化道惡性腫瘤，特指產(chǎn)生于胃黏膜上皮的惡性腫瘤。胃癌在全球范圍內(nèi)的發(fā)病率和病死率均較高［1-2］。我國胃癌的發(fā)病率顯著高于世界平均水平；且隨我國老齡化進(jìn)程的加快，胃癌發(fā)病率還將持續(xù)增長(zhǎng)［3］。因此，尋找有效治療方法具有重要意義，而目前手術(shù)仍是胃癌治療的常見手段，但術(shù)后易發(fā)生腫瘤擴(kuò)散、遷移等，患者病死率仍較高［4-6］。近年來有研究顯示，丙泊酚作為一種麻醉藥物，常被用于各類惡性腫瘤手術(shù)。丙泊酚能夠抑制乳腺癌、肝癌、食管癌細(xì)胞的侵襲和遷移［7-9］，且這一過程可能通過調(diào)控細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）/血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。2019年6月—2020年8月，本研究主要基于ERK/VEGF信號(hào)通路探討丙泊酚對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、侵襲及遷移的影響，為胃癌的臨床治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、材料及儀器 人胃癌細(xì)胞株MGC-803由中國科學(xué)院提供。丙泊酚、DMSO、MTT試劑、甲醇均購自美國默克Sigma公司；PBS緩沖液購自北京百奧萊博科技有限公司；兔源ERK一抗、兔源VEGF一抗、β-actin一抗、山羊抗兔lgG二抗均購自英國Abcam公司；Transwell小室購自美國Corning公司；MR-96A型酶標(biāo)儀購自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)、分組及干預(yù) 將細(xì)胞株放置在含10%胎牛血清、青霉素及鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，在溫度37℃、空氣濕度95%、5%CO2的環(huán)境下進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，隔天換液，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的胃癌細(xì)胞隨機(jī)分為0、2、4、8 μg/L丙泊酚組，2、4、8 μg/L丙泊酚組分別加入相應(yīng)濃度的丙泊酚溶液處理72 h。0μg/L丙泊酚組作為對(duì)照組。

1.3 細(xì)胞增殖能力檢測(cè) 采用MTT法。將各組細(xì)胞分別接種于96孔板，每組設(shè)置3個(gè)平行樣本，每孔加入MTT溶液20μL，遮光培養(yǎng)4 h后加入DMSO溶液200μL，振蕩溶解。充分溶解后用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)處的吸光度，計(jì)算細(xì)胞存活率（%），細(xì)胞存活率=（實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞吸光度/對(duì)照組細(xì)胞吸光度）×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 細(xì)胞侵襲能力檢測(cè) 采用Transwell小室實(shí)驗(yàn)。將各組細(xì)胞懸濁液分別接種于小室的上室，把含血清的培養(yǎng)基放于下室，將細(xì)胞放入溫度37℃、空氣濕度95%、5%CO2的環(huán)境下常規(guī)培養(yǎng)48 h，取出小室后擦去上室中未侵襲的細(xì)胞，用甲醇固定10 min后用結(jié)晶紫染色，高倍鏡（×100）觀察下室細(xì)胞數(shù)，隨機(jī)抽取3處視野計(jì)算細(xì)胞數(shù)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 細(xì)胞遷移能力檢測(cè) 采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)。將各組細(xì)胞分別接種于6孔板，待細(xì)胞融合至90%，讓細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h。用1 mL槍頭小心地劃傷單層細(xì)胞，棄培養(yǎng)基，用PBS洗凈劃傷細(xì)胞，將細(xì)胞放置在無血清培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，在高倍鏡下觀察并拍照記錄0、24 h的劃痕寬度。計(jì)算細(xì)胞劃痕愈合率，劃痕愈合率（%）=（0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度）/0 h劃痕寬度×100%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 細(xì)胞ERK、VEGF蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting法。根據(jù)蛋白提取試劑盒要求分別提取各組細(xì)胞的總蛋白，各取蛋白樣品30μg用SDSPAGE膠進(jìn)行電泳，蛋白分離后用濕法將蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用5%脫脂奶粉在室溫條件下封閉1 h，然后加入稀釋過的一抗（1∶1 000），在4℃環(huán)境下培養(yǎng)過夜，用PBS清洗3遍后加入稀釋過的二抗（1∶10 000），室溫培育1 h，再次用PBS緩沖液清洗3遍，顯色顯影后進(jìn)行分析。目的蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用±s表示，多組比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 丙泊酚對(duì)胃癌細(xì)胞增殖能力的影響 對(duì)照組、2μg/mL丙泊酚組、4μg/mL丙泊酚組、8μg/mL丙泊酚組細(xì)胞存活率分別為100%、（87.63±9.52）%、（72.21±7.84）%、（57.38±8.29）%。與對(duì)照組比較，各丙泊酚組細(xì)胞存活率低（P均＜0.05），且隨丙泊酚濃度增加，細(xì)胞存活率逐漸降低（P＜0.05）。

2.2 丙泊酚對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲能力的影響 對(duì)照組、2μg/mL丙泊酚組、4μg/mL丙泊酚組、8μg/mL丙泊酚組侵襲至小室下室的細(xì)胞數(shù)目分別為（456.28± 44.34）、（378.91 ± 53.83）、（238.39 ± 52.19）、（169.39±47.87）個(gè)。與對(duì)照組比較，各丙泊酚組侵襲至小室下室的細(xì)胞數(shù)目少（P均＜0.05），且隨丙泊酚濃度增加，侵襲至小室下室的細(xì)胞數(shù)目逐漸減少（P＜0.05）。

2.3 丙泊酚對(duì)胃癌細(xì)胞遷移能力的影響 對(duì)照組、2μg/mL丙泊酚組、4μg/mL丙泊酚組、8μg/mL丙泊酚組細(xì)胞劃痕愈合率分別為（41.38±4.38）%、（34.84 ± 3.91）% 、（26.35 ± 3.17）% 、（11.76 ±3.74）%。與對(duì)照組比較，各丙泊酚組細(xì)胞劃痕愈合率低（P均＜0.05），且隨丙泊酚濃度增加，細(xì)胞劃痕愈合率逐漸降低（P＜0.05）。

2.4 丙泊酚對(duì)胃癌細(xì)胞ERK、VEGF蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，各丙泊酚組ERK、VEGF蛋白表達(dá)低（P均＜0.05），且隨丙泊酚濃度的增加，胃癌細(xì)胞ERK、VEGF蛋白表達(dá)逐漸降低（P均＜0.05）。見表1。

表1 各組細(xì)胞ERK、VEGF蛋白表達(dá)比較（±s）

表1 各組細(xì)胞ERK、VEGF蛋白表達(dá)比較（±s）

組別對(duì)照組2μg/mL丙泊酚組4μg/mL丙泊酚組8μg/mL丙泊酚組FP ERK蛋白1.176±0.414 0.883±0.231 0.626±0.302 0.207±0.175 22.499＜0.05 VEGF蛋白1.617±0.309 1.299±0.238 0.701±0.168 0.336±0.153 66.209＜0.05

3 討論

丙泊酚是一種臨床常用麻醉劑，起效迅速、不良反應(yīng)小，被廣泛應(yīng)用于多種手術(shù)的靜脈麻醉。但近年來關(guān)于丙泊酚的研究逐漸傾向于其對(duì)惡性腫瘤細(xì)胞的抑制作用［10-12］。關(guān)于丙泊酚在胃癌方面的研究，張志發(fā)等［13］發(fā)現(xiàn)，丙泊酚能夠抑制胃癌細(xì)胞的侵襲和遷移，這一過程可能與黏附分子CD44v6和基質(zhì)金屬蛋白酶7（MMP-7）的表達(dá)受到抑制有關(guān)。張冰等［14］用不同濃度的丙泊酚處理胃癌細(xì)胞，并對(duì)胃癌細(xì)胞周期和某些蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示丙泊酚能夠顯著抑制胃癌細(xì)胞增殖，這可能與半胱氨酸蛋白酶3、9水平升高及B淋巴細(xì)胞瘤2水平下降有關(guān)。馬浩文等［15］對(duì)胃癌細(xì)胞HGC-27進(jìn)行研究，結(jié)果顯示丙泊酚能夠顯著抑制胃癌細(xì)胞的侵襲，且隨著丙泊酚濃度的增加，蛋白激酶B（Akt）的磷酸化水平、MMP-7表達(dá)量均降低，推測(cè)丙泊酚可能通過調(diào)控Akt信號(hào)通路抑制胃癌細(xì)胞的侵襲。從以上研究可以看出，丙泊酚通過對(duì)多種信號(hào)通路的調(diào)節(jié)發(fā)揮抑癌作用。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，經(jīng)丙泊酚處理的各組細(xì)胞增殖、侵襲及遷移能力均低，且隨丙泊酚濃度增加，胃癌細(xì)胞受到的抑制作用越強(qiáng)，說明丙泊酚能夠抑制胃癌細(xì)胞的侵襲遷移能力，且丙泊酚的濃度越大，抑制作用越強(qiáng)。

VEGF是一種內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，能夠刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移，是目前已知的在多種惡性腫瘤中均廣泛存在的重要促癌因子［16-18］。有研究顯示，VEGF在胃癌細(xì)胞中呈高表達(dá)，且能促進(jìn)淋巴細(xì)胞生成［19］。ERK屬于絲裂原活化蛋白激酶中的一種類型，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、周期等多種功能，在癌細(xì)胞的發(fā)展過程中也起重要作用。研究顯示，ERK能夠促進(jìn)VEGF的表達(dá)［20］，由此推測(cè)ERK能夠通過促進(jìn)VEGF的表達(dá)發(fā)揮促癌作用。與對(duì)照組相比，經(jīng)丙泊酚處理的各組胃癌細(xì)胞ERK、VEGF蛋白表達(dá)低，且隨丙泊酚濃度的增加，胃癌細(xì)胞ERK、VEGF蛋白表達(dá)逐漸降低。說明丙泊酚對(duì)ERK/VEGF信號(hào)通路有抑制作用。

綜上所述，丙泊酚能夠抑制胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移，這可能通過調(diào)控ERK/VEGF信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。關(guān)于丙泊酚的抑癌作用，也有研究提示丙泊酚對(duì)癌細(xì)胞具有雙重作用［21］，可能是丙泊酚濃度和細(xì)胞類型不同導(dǎo)致的。因此需擴(kuò)大丙泊酚濃度范圍和胃癌細(xì)胞類型進(jìn)一步驗(yàn)證丙泊酚對(duì)胃癌細(xì)胞的調(diào)控作用。