王博，劉勇，任冰冰，付思齊，姚志偉，孫大慶

天津醫(yī)科大學總醫(yī)院兒外科，天津300052

功能性便秘是最常見的消化道疾病，表現(xiàn)為腸道傳輸時間變慢，糞便干硬，排便次數(shù)減少［1］。慢性傳輸型便秘（STC）作為最常見的功能性便秘，是多種因素（炎癥、分泌功能障礙、消化道神經支配的改變）相互作用的結果［2］。研究發(fā)現(xiàn)，腸道微生物和短鏈脂肪酸失衡可能是STC發(fā)病的另一危險因素［3］。STC一般治療包括增加運動量、高纖維飲食以及藥物干預。除了高纖維飲食和瀉藥干預外，益生菌也可以作為STC的替代治療藥物［4］。手術被認為是頑固性STC最后的治療手段。吡非尼酮（PFD）是目前被歐盟批準的治療特發(fā)性肺纖維化的兩種藥物之一。PFD可改善輕中度肺纖維化患者的肺功能，降低患者病死率，延長無進展生存期［5-6］。PFD通過多種機制發(fā)揮抗纖維化的作用，包括下調轉化生長因子β（TGF-β）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）表達，抑制炎癥反應，降低肌成纖維細胞的活化［7-8］。PFD還是活性氧（ROS）清除劑，可下調氧化相關基因的表達，減少過氧化氫和ROS的產生［9］。研究發(fā)現(xiàn)，STC的結腸組織中存在氧化應激損傷［10］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，STC患者骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（BMP2）蛋白表達升高。2020年9月—2021年3月，本研究探究PFD對STC小鼠的治療作用及機制。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑及儀器 SPF級雄性BALB/c小鼠50只，6～8周齡，體質量（20±2）g，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司（合格證號：No.370726201100859673），并于山東大學生命科學院實驗動物中心飼養(yǎng)，符合動物倫理學標準。PFD購自大連美侖生物技術有限公司，純度＞98.5%。洛哌丁胺購自美國Sigma公司；TNF-α抗體購自美國Abcam公司；HE染色試劑盒購自中國南京BioChannel公司；TNF-α抗體、蛋白基因產物（PGP）9.5抗體購自武漢三鷹生物技術有限公司。

1.2 動物分組及模型制備 小鼠適應性喂養(yǎng)1周后，將其隨機分為對照組、STC組及1、10、100 mg/kg治療組，各10只。STC組、各治療組給予10 mg/kg洛派丁胺溶液（美國Sigma公司）灌胃，對照組給予等量生理鹽水灌胃，均2次/日，持續(xù)2周。自造模第8天，各治療組在洛哌丁胺灌胃3 h后分別給予1、10、100 mg/kg的PFD灌胃，1次/日，持續(xù)1周。

1.3 小鼠一般情況及糞便參數(shù)記錄 每天對小鼠的體質量、飲水量、攝食量進行監(jiān)測。實驗結束后，采集糞便樣本進一步分析。給藥14 d后，將小鼠禁食16 h，給予100 g/L活性炭混懸液2 mL灌胃處理。記錄各組第1顆黑色糞便排出時間，測量單只小鼠每小時排便次數(shù)，并計算糞便含水量，糞便含水量=（糞便濕重-糞便干重）/糞便濕重×100%。

1.4 結腸組織形態(tài)學變化觀察 干預完成后將小鼠頸椎脫臼處死取結腸段組織，用生理鹽水沖洗結腸內容物，剪取新鮮結腸1 cm，用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋后切片，切片厚度5μm。組織切片經二甲苯脫蠟和梯度乙醇脫水后，用HE染色試劑盒染色，中性樹脂封片后，在光學顯微鏡（×10）下觀察結腸組織形態(tài)。剝離小鼠結腸肌層，采用肌間神經元全層鋪片，用PGP9.5神經元特異性指標染色。剪取遠端結腸段（2～3 cm）置于含氧磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）中，沿腸系膜邊緣切開，清除其內容物，最大限度地拉伸并剝離肌層，用4%多聚甲醛固定過夜。37℃條件下，將肌層用5%山羊血清封閉30 min。孵育PGP9.5抗體（14730-1-AP，1∶100），并在4℃條件下孵育過夜，PBS清洗一抗后，加入二抗并在37℃下孵育1 d。蔡司激光共聚焦顯微鏡LSM880（×20）觀察結腸肌層神經元形態(tài)變化。用抗TNF-α抗體進行免疫組化染色評估結腸組織中炎癥反應發(fā)生的位置及程度。方法：結腸組織石蠟切片經二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，將切片浸入檸檬酸鈉抗原修復液中煮20 min，取出切片自然冷卻致室溫，用0.3%過氧化氫溶液阻斷內源性過氧化物酶10 min，5%山羊血清封閉10 min，滴加TNF-α抗體（1∶100稀釋），4℃孵育過夜，清洗一抗后，二抗室溫孵育30 min，滴加DAB顯色液于光學顯微鏡（×20）下觀察，著色為棕色特異性區(qū)域既存在TNF-α表達。用Image J軟件統(tǒng)計TNF-α陽性面積百分比，值越高則炎性反應程度越高。

1.5 結腸組織中BMP2、Smad同源物1（Smad 1）mRNA表達檢測 采用定量PCR法。小鼠結腸標本保存于RNAlater溶液（廣州大匯生物技術有限公司）中。提取RNA，逆轉錄獲得互補cDNA。采用特異性引物，β-actin上游引物5'-CCACCATGTACCCAGGCATT-3'，下游引物 5'-CGGACTCATCGTACTCCTGC-3'；BMP2 上 游 引 物 5'-CTCCGGGCTATCATGCCTTT-3'，下游引物 5'-ACAACATGGAGATTGCGCTG-3'；Smad1 上游引物 5'-AATACTTCACTGAGGCGGGC-3'，下 游 引 物 5'-CAGTGAGCACATCTGTCCGT-3'。反應體系中PrimeScript酶液1.0μL、引物各1.0 μL、5×PrimerScript buffer2 4.0μL、無菌蒸餾水14μL、cDNA模板10μL。擴增條件：95℃起始10 min，95℃ 10 s、60 ℃ 30 s共40個循環(huán)。以β-actin 為內參基因，用 2-ΔΔCt法［11］計算目的基因相對表達量。每個樣本重復實驗3次。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS25.0統(tǒng)計軟件。計量資料用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 PFD對小鼠排便的影響 與對照組比較，STC組第1顆黑色糞便排出時間長、排便頻率低（P均＜0.05）。1、10 mg/kg治療組第1顆黑色糞便排出時間、排便頻率與STC組比較差異無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05）；與STC組及1.10 mg/kg治療組比較，100 mg/kg治療組第1顆黑色糞便排出時間短、排便頻率高（P均＜0.05）。后續(xù)實驗選擇100 mg/kg治療組進行觀察。見表1。

表1 各組排便情況比較（±s）

表1 各組排便情況比較（±s）

注：與對照組比較，#P＜0.05；與100 mg/kg治療組比較，*P＜0.05。

組別對照組STC組1 mg/kg治療組10 mg/kg治療組100 mg/kg治療組n 10 10 10 10 10第1顆黑色糞便排出時間（min）83.3±13.4 196.7±63.8#*200.0±69.0*177.3±70.1*98.5± 4.5*排便頻率（次/小時）8.43±1.73 2.68±1.33#3.18±1.21 3.22±1.23 5.66±1.82*糞便含水量（%）68.59±15.36 47.50± 9.35#49.22± 5.23 52.32± 6.32 60.88± 2.60*

2.2 PFD對小鼠一般情況的影響 與對照組比較，STC組體質量低，攝食量、飲水量少（P均＜0.05）。與STC組比較，100 mg/kg治療組體質量高，攝食量、飲水量多（P均＜0.05）。見表2。

表2 各組一般生理狀態(tài)比較（±s）

表2 各組一般生理狀態(tài)比較（±s）

注：與對照組比較，#P＜0.05；與STC組比較，*P＜0.05。

組別對照組STC組100 mg/kg治療組n 10 10 10體質量（g）23.12±0.65 19.15±0.98#21.25±0.74*攝水量（mL）9.02±1.92 5.39±0.65#6.54±1.06*攝食量（g）4.13±1.12 1.99±0.61#2.98±0.55*

2.3 PFD對小鼠腸道組織形態(tài)的影響 對照組腸壁結構完整，腸絨毛分布均勻，腸管壁較厚；STC組結腸腸壁組織較薄，肌層變薄明顯，可見少許炎癥細胞浸潤；100 mg/kg治療組治療1周后小腸腸壁明顯增厚，結腸腸黏膜發(fā)育良好，腸絨毛豐厚，排列緊密，炎癥細胞浸潤減少，組織形態(tài)結構正常，未見明顯組織病理損傷。對照組、STC組、100 mg/kg治療組TNF-α陽性面積百分比分別為（0.82±0.25）%、（10.12 ± 0.98）%、（3.12 ± 0.65）%，均在結腸肌層。與對照組比較，STC組TNF-α陽性面積百分比高（P＜0.05）；與STC組比較，100 mg/kg治療組TNF-α陽性面積百分比低（P＜0.05）。STC組結腸肌間神經分布稀疏，神經纖維變細，胞體減少；而100 mg/kg治療組神經元的以上變化發(fā)生逆轉。

2.4 PFD對小鼠結腸組織中BMP2、Smad1 mRNA表達的影響 與對照組比較，STC組結腸組織中BMP2、Smad1 mRNA相對表達量高（P均＜0.05）；與STC組比較，100 mg/kg治療組結腸組織中BMP2、Smad1 mRNA相對表達量低（P均＜0.05）。見表3。

表3 各組結腸組織中BMP2、Smad1 mRNA表達比較（±s）

表3 各組結腸組織中BMP2、Smad1 mRNA表達比較（±s）

注：與對照組比較，#P＜0.05；與STC組比較，*P＜0.05。

組別對照組STC組100 mg/kg治療組n 10 10 10 BMP2 mRNA 1.01±0.16 3.12±0.12#1.08±0.03*Smad1 mRNA 1.04±0.11 2.75±0.18#1.08±0.04*

3 討論

STC是一種常見的功能性便秘，其特點是結腸運動緩慢，腸道傳輸時間延長，排便次數(shù)顯著減少甚至不排便，糞便干硬及水分減少。該病為慢性、復發(fā)率高，常影響患者的日常生活［12］。研究表明，結腸腫瘤、帕金森病、兒童相關多動癥、自閉癥及慢性腎臟疾病均與便秘有關［2］。對慢性便秘特別是STC的研究在了解疾病的發(fā)生機制及治療中有重要作用。STC的正常治療包括飲食控制、運動、使用瀉藥等。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，慢性便秘患者的結腸存在慢性炎癥反應與氧化應激損傷，抗炎抗氧化應激治療也越來越多被應用在便秘患者的治療中。PFD作為一種新的抗炎抗氧化應激損傷的藥物，是否可以用來治療便秘，其作用方式及潛在的藥物靶點尚不清楚。本研究通過PFD治療洛哌丁胺誘導的STC小鼠，觀察便秘相關參數(shù)證明PFD對STC的治療作用。

通過PFD的臨床特點與羅馬Ⅳ診斷標準，本研究設計了第1顆黑色糞便排出的時間來觀察腸道傳輸時間，以每小時糞便顆粒數(shù)作為排便頻率，并統(tǒng)計糞便含水量。在STC小鼠模型中，PFD可增加糞便含水量，減少第1顆黑色糞便排出時間，增加排便頻率，同時減少炎癥細胞浸潤，增加結腸肌層厚度，增強腸道動力。BMP2-Smad1調節(jié)通路可以調節(jié)腸神經元的發(fā)生與重塑，同時BMP2升高可增加腸道硝基能神經元，從而增加抑制性神經遞質一氧化氮（NO）產生，NO抑制腸道收縮導致腸道傳輸功能異常。BMP2高表達會導致腸神經元結構與功能異常。本研究顯示，PFD可下調STC小鼠結腸BMP2、Smad1基因表達，通過抑制BMP2-Smad1信號軸減少腸道神經元的重塑，逆轉腸神經結構變化與腸道調節(jié)功能的失常。TNF-α是最常見的周圍炎癥反應介質，其在慢性與急性炎癥反應中水平均升高，在神經性疾病中亦合成增加。STC小鼠模型結腸肌層組織中TNF-α與對照組相比明顯升高，且表達位置與腸道神經元存在共定位。說明STC小鼠結腸肌層組織中的腸神經元存在炎癥損傷，PFD可減少STC小鼠結腸肌層中的TNF-α表達來發(fā)揮抗炎與神經保護作用。

隨著對PFD研究的深入，PFD在消化系統(tǒng)中的作用逐漸被發(fā)現(xiàn)。PFD可呈劑量依賴性抑制人類腸道纖維細胞的增殖和遷移，但不導致其死亡，從而有效抑制炎癥性腸病中腸纖維化的發(fā)生發(fā)展［13］。PFD可通過抑制氧化應激、巨噬細胞的浸潤和炎癥小體依賴性的NLRP3途徑誘導的炎癥，來減輕急性腎損傷［14］。PFD可抑制克隆恩病患者腸道源性成纖維細胞增殖和基質金屬蛋白酶的產生，且呈劑量依賴性［15］。這些研究均從PFD對于腸道的免疫調節(jié)入手，通過體內與體外實驗證明了PFD的抑制腸道炎癥的作用。本研究不僅證明了PFD可以有效降低腸道炎癥反應，同時發(fā)現(xiàn)了PFD可以通過BMP2-SMAD1通路調節(jié)腸道神經元的結構與功能，具有神經保護作用。由此可見PFD作為一個常規(guī)的抗肺纖維化藥物的同時，可通過抗炎作用在多種急性慢性疾病中發(fā)揮作用。

本研究中PFD不僅能改善便秘，還能糾正洛哌丁胺誘導便秘導致的小鼠體質量丟失與結腸組織病理的改變。盡管目前有很多植物提取物、多糖、小分子化合物、中草藥被用來研究對于便秘的改善作用，但是很少有藥物能在100 mg/kg的劑量下，單獨處理STC模型小鼠中驗證其通便作用，PFD相較于其他通便藥物具有較低的起效濃度，并且未出現(xiàn)明顯的不良反應，安全性高。接下來的研究中，我們將進一步探索PFD對腸道微生物及其代謝產物的調控作用。

綜上所述，本研究驗證了PFD在STC的腸道運動中起重要的調節(jié)作用。其作用機制可能為PFD能夠通過調控BMP2-Smad1信號軸減輕腸神經的損傷，抑制腸道炎癥反應，逆轉腸道微生物多樣性改變，從而直接或間接改善了便秘癥狀。