成 欣，韓鑫龍，譚曉梅，湯慶發(fā)，陳飛龍，楊加順，唐 玲＊＊

（1.南方醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院 廣州 510515；2.廣東省中藥制劑重點實驗室/廣東省中藥制劑技術(shù)工程實驗室廣州 510515；3.大連大學生命科學與技術(shù)學院 大連 116622；4.南方醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院 廣州 510630）

肝癌的死亡率為為8.2%，是全球范圍內(nèi)死亡率較高的癌癥之一，也是男性中死亡率僅次于胃癌的癌癥，2018年新增約84萬病例[1]。我國是肝病大國，有67萬的肝癌患者，占2015年的新增癌癥病人數(shù)的10.86%。就死亡率而言，肝癌在我國僅次于肺癌和胃癌[2]，目前已成為發(fā)病率與死亡率居我國前列的疾病。因此攻克肝癌是我國亟待解決的公共健康課題。原發(fā)性肝癌包括肝細胞癌、肝內(nèi)膽管癌以及其它罕見腫瘤，主要為肝母細胞瘤和纖維層狀癌[3]。目前常用的臨床治療方式有肝移植、手術(shù)切除、化療、放療及靶向治療，肝癌早期治療以肝移植和手術(shù)切除為主，術(shù)后5年生存率僅為50%左右，而復發(fā)率卻高達70%[4]。肝細胞癌是肝癌中常見的惡性腫瘤，其起病隱匿，且預后比較差。索拉非尼對于不適合手術(shù)切除或肝介入治療的肝癌患者進行靶向治療的效果不理想[5]。

據(jù)文獻報道，中國約80%肝癌患者在不同程度上接受過中醫(yī)藥的治療［6-7］。并且中醫(yī)藥在預防和降低肝癌復發(fā)及轉(zhuǎn)移率、改善癥狀、提高免疫能力、提高患者生存質(zhì)量，甚至延長患者生存時間方面具有獨特的優(yōu)勢［6-7］。有隨機對照、多中心臨床試驗證明，服用相應的現(xiàn)代中藥制劑可使肝癌術(shù)后復發(fā)的風險顯著降低［8］。如果可以從分子、細胞水平闡明中醫(yī)藥抑制肝癌進展的機制，將更有助于中醫(yī)藥在肝癌治療中發(fā)揮作用，促進臨床療效的改善與提升。

癌性發(fā)熱的原因之一是由于腫瘤迅速生長從而造成的局部缺氧缺血引發(fā)壞死進而激發(fā)炎癥反應，導致發(fā)熱，這與腫瘤的代謝方式息息相關。腫瘤表現(xiàn)出可促進癌癥進展的重新編程的代謝活動，腫瘤細胞由于特殊的能量與物質(zhì)需求，會采用和正常細胞完全不同的代謝方式。因此研究抑制腫瘤代謝方式的手段可使腫瘤患者受益。而目前關于血漿中的物質(zhì)作為腫瘤標志物及其動態(tài)變化在疾病在診斷中起到至關重要的作用，血液樣本可以整體的反映機體生理或病理狀態(tài)下的重要信息。而肝臟作為重要的代謝器官，是人類的代謝中心。很多營養(yǎng)物質(zhì)、藥物、血液及肝細胞內(nèi)物質(zhì)被小腸吸收后至少會通過一次肝臟，它能夠調(diào)節(jié)機體眾多代謝物的表達水平，因此肝臟的病變必然引起代謝的變化。這使得代謝組學分析方法特別適用于肝癌的研究。

青蒿鱉甲湯作為清虛熱的代表性方劑，出自溫病學家吳鞠通的《溫病條辨》。目前該方在臨床應用于內(nèi)科、外科、婦科、兒科、血液、皮膚、腫瘤等各個方面，在治療原因不明的發(fā)熱上有良好效果[9]。吳鞠通在《溫病條辨·下焦篇》中說： “夜熱早涼，熱退無汗，熱自陰來者，青蒿鱉甲湯主之?！?吳氏自釋該方的藥物配伍時說： “此方有先入后出之妙，青蒿不能直入陰分，有鱉甲領之入也；鱉甲不能獨出陽分，有青蒿領之出也” 。隨著腫瘤不斷生長，機體能量不斷消耗，抵抗能力愈來愈差，久而久之則出現(xiàn)陰虛熱結(jié)之證，出現(xiàn)手足心熱、口燥咽干、潮熱盜汗等癌熱現(xiàn)象。青蒿鱉甲湯作為清虛熱代表方劑，臨床對多種腫瘤產(chǎn)生的癌熱有效，因此首次選用青蒿鱉甲湯作為改善肝癌癌熱的中藥復方，在提高對實體瘤的緩解率的同時減輕癌熱。

本實驗利用液相色譜質(zhì)譜（UHPLC-Q-Exactive）聯(lián)用技術(shù)及多元統(tǒng)計分析，從生物學角度出發(fā)研究青蒿鱉甲湯干預后肝癌小鼠血漿中代謝物的變化并進行相關代謝通路分析，探討青蒿鱉甲湯改善肝癌后期發(fā)熱可能參與的代謝途徑，初步闡釋青蒿鱉甲湯改善肝癌及發(fā)熱的作用機制，為肝癌的輔助治療提供新思路。通過分析肝癌模型組與青蒿鱉甲湯治療后的代謝輪廓，利用標志性的代謝物對代謝途徑進行探索，分析這些代謝物所涉及的代謝通路，能更整體地闡述肝癌的代謝水平及它們的前后對比關系，對中藥復方改善肝癌的臨床癥狀很有參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

從南方醫(yī)科大學實驗動物中心購買C57小鼠21只，體質(zhì)量16-22 g，6-8周齡，雄性，保證全部動物在SPF級實驗室進行飼養(yǎng)與操作，實驗動物合格證號：SCXK（粵）2016-0041。

1.1.2 實驗瘤株

鼠源肝癌細胞株H22，由南方醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院分子生物學重點實驗室贈送。

1.1.3 藥物與試劑

藥材：青蒿飲片、鱉甲飲片、生地飲片、知母飲片、丹皮飲片均購自康美藥業(yè)。

試劑：乙醇；LCMS Methanol、LCMS Acetonitrile、

LCMSFormic Acid、LCMSWATER、2-Propanol（Fisher Chemical）。

1.1.4 主要儀器設備

電子分析天平CPA225D SARTORIUS（德國賽多利斯十萬分之一電子天平）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀EYELA（上海愛朗儀器有限公司）；凍干機（北京賽歐華創(chuàng)科技有限公司）；超聲波清洗器JP-080ST（深圳市潔盟清洗設備有限公司）；臺式快速離心濃縮干燥器LNG-T88（太倉市華美生化儀器廠）；手動單道移液器（Eppendorf）；電凝止血器（廣州寶匯生物科技有限公司）；BD胰島素注射器（北京潤澤康生物科技有限公司）；冷凍離心機（Eppendorf）；試管垂直旋轉(zhuǎn)搖床QB-210（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；恒溫混勻儀TMR（TMR）；氮氣吹掃儀JXDC-20（上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司）；Vanquish Horizon UHPLC液相色譜系統(tǒng)、Q-Exactive system質(zhì)譜儀（Thermo Scientific）。

1.2 藥物制備

取青蒿鱉甲湯原方三倍量（青蒿30 g、鱉甲45 g、生地36 g、知母18 g、丹皮27 g）藥材置于6倍量的75%乙醇中浸泡12h過夜，次日超聲提取2次，每次1 h。減壓濃縮得到浸膏，后凍干保存。

1.3 動物造模

1.4 分組給藥

模型驗證成功后開始給藥，正常組與模型組分別按10 mL·kg-1給予生理鹽水，青蒿鱉甲湯組按照19.728 g·kg-1進行灌胃給藥，所有小鼠按1天1次灌胃給藥，連續(xù)給藥14天。

1.5 檢測指標與取材

造模完成后，每隔1天稱量各組小鼠體質(zhì)量，每隔1天測量瘤體積的變化。小鼠末次給藥后禁食不禁水，24 h內(nèi)稱小鼠體質(zhì)量，眼眶靜脈采血，斷頸處死，收集血液，剝離腫瘤分析天平稱重，計算抑瘤率。

瘤體積=（1/2*L*W2，L：長，W：寬)

抑瘤率=［1-（給藥組平均瘤重/模型組平均瘤重）］×100%

1.6 血漿非靶向代謝組學

1.6.1 血漿樣品采集與制備

將眼眶靜脈采血收集到的血液樣本置于抗凝管后于室溫靜置30 min，于4℃、≤1300×g離心10 min，待血細胞完全沉降后，取上層血漿置于另一離心管中，-80℃冷凍保存；上機前取100μL樣品于1.5 mL離心管中，再加入400μL提取液(乙腈∶甲醇=1∶1)；30 s渦旋混勻后，用低溫超聲提取30 min(5℃，40 KHz)；樣品靜置于-20℃30 min后離心15 min(13000 g，4℃)，再吸取上清液，用氮氣吹干；樣品用100μL溶液(乙腈∶水=1∶1)復溶，低溫超聲萃取5 min(5℃，40 KHz)；離心5 min（13000 g，4℃），取上清液上機分析；分別于每個樣本移取20 uL上清液，混勻后作為質(zhì)控樣本（QC）。

1.6.2 LC-MS條件

本實驗所使用的儀器平臺為Thermo Fisher Scientific超高效液相色譜串聯(lián)傅里葉變換質(zhì)譜UPLC-Q-Exactive系統(tǒng)。色譜柱為BEH C18柱（100 mm×2.1 mm i.d.，1.7μm；Waters，Milford，USA）；流動相A為乙腈/異丙醇（1/1）（含0.1%甲酸），流動相B為水（含0.1%甲酸）；分離梯度：0-3 min，5%-20%A；3-9 min，20%-95%A；9-13 min，95%A；13.0-13.1 min，95%-5%A；13.1-16 min，5%A。進樣量2μL，流速為0.40 mL·min-1，柱溫為40℃。采集樣品質(zhì)譜信號為正負離子全掃描模式，質(zhì)量掃描范圍（m/z）：50-1000。離子化電壓：正離子電壓3500 V，負離子電壓-2800 V，輔助加熱氣10 psi，鞘氣40 psi，離子源加熱溫度500℃，循環(huán)碰撞能20-60 V。

1.6.3 數(shù)據(jù)預處理

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)，安培力實際上是導體中自由電荷在運動時，受到洛倫茲力分力的總和，并不是洛倫茲力的合力。因此，可說安培力的微觀是洛倫茲力，但是不能說洛倫茲力的宏觀是安培力。洛倫茲力不做功，而安培力是要做功的，也可以說洛倫茲力分力的在宏觀上是要做功的，且安培力在做負功時會等于其產(chǎn)生的焦耳熱，而前提則是導體回路中有動生電動勢產(chǎn)生。通過對兩力之間的深層次的討論，可以讓高中生對二者力理解得更加透徹，在處理問題的過程中，也會更加容易掌握解題的思路。

將所得的原始數(shù)據(jù)導入代謝組學處理軟件Progenesis QI(Waters Corporation，Milford，USA)，進行基線過濾、峰識別、峰對齊、保留時間校正、積分后，可獲得一個含保留時間、質(zhì)荷比與峰強度的原始數(shù)據(jù)矩陣。使用Progenesis QI代謝組學處理軟件進行搜庫鑒定，將MS所得的質(zhì)譜信息與代謝數(shù)據(jù)庫（http://www.hmdb.ca/；https://metlin.scripps.edu/）進行匹配。然后再進行數(shù)據(jù)預處理：首先去除所有樣本中缺失值大于80%的變量；用原始矩陣中位數(shù)進行補缺；再總峰歸一化處理，同時刪除質(zhì)控樣本相對標準偏差（RSD）≥30%的變量；最后經(jīng)過log10轉(zhuǎn)換，獲得最終用于進行后續(xù)分析的數(shù)據(jù)矩陣。

1.6.4 統(tǒng)計分析方法

藥效指標等實驗數(shù)據(jù)均用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件做統(tǒng)計學處理，結(jié)果以±s表示，兩組間定量資料的比較用兩獨立樣本t檢驗，P<0.05為有顯著性差異。應用美吉生物云平臺（https://cloud.majorbio.com/index）進行代謝組學數(shù)據(jù)分析，組間模式識別采用主成分分析（PCA）和正交-偏最小二乘判別分析（OPLS-DA），根據(jù)分析結(jié)果構(gòu)建相應的得分圖。差異代謝物的篩選采用正交-偏最小二乘判別分析方法，根據(jù)OPLS-DA模型的VIP（第一主成分變量重要性）值，結(jié)合兩樣本t檢驗所得的P值，以VIP值>1且P<0.05為標準找尋差異代謝物。根據(jù)不同組間代謝物對應化學位移處的峰面積平均值比值，即差異倍數(shù)（foldchange，F(xiàn)C）來判斷給藥前后血漿代謝物含量的變化，F(xiàn)C>1表示此位移處的代謝物含量升高，相反，則表示此位移處代謝物含量下降。然后通過KEGG檢索各種差異代謝物信息，再進行代謝通路的分析，選擇重要性得分排名前三的代謝通路進行深入分析探討。

2 結(jié)果

2.1 對H22荷瘤模型中腫瘤生長的影響

與模型組比較，青蒿鱉甲湯給藥組的瘤質(zhì)量呈降低趨勢，有顯著性差異(P<0.05)，抑瘤率為15.01%，瘤體積顯著減小，而體質(zhì)量無明顯變化（圖1）。

圖1 青蒿鱉甲湯對H22荷瘤小鼠模型中腫瘤生長的影響圖

2.2 LC-MS結(jié)果

3組小鼠LC-MS樣本的離子流圖TIC如圖2所示。將TIC導入代謝數(shù)據(jù)庫后選擇出匹配度較好的內(nèi)源性代謝物進行后續(xù)的多元統(tǒng)計分析。

圖2 不同組小鼠血漿代謝的TIC圖

2.3 模式識別

經(jīng)匹配后提取出的數(shù)據(jù)進行預處理后，先對樣品進行模式識別，通過PCA分析后，得到相應的得分圖，見圖3。樣本經(jīng)降維分析后，在主成分p1，p2上出現(xiàn)相對應得坐標點，各個坐標點的距離表示了樣本間聚集和離散程度，距離越近說明樣本間相似度越高，距離越遠說明樣本間差異度越大。PCA得分圖顯示3組之間的樣本有交叉點，但是仍能從分布上看出是分開的，說明分離程度較好。使用OPLS-DA模型進行分析，去除與樣品分類無關的信息后對血漿全譜進行分析，發(fā)現(xiàn)在正負離子模式下，正常對照組與模型組，模型組與青蒿鱉甲湯給藥組樣本均能得到明顯分離，表明各組血漿中內(nèi)源性物質(zhì)的代謝模式存在差異，該模型能夠解釋樣本間代謝差異，見圖4。另外，質(zhì)控樣品出現(xiàn)聚簇，表明分析系統(tǒng)穩(wěn)定，QC重復性良好，在分析過程中儀器穩(wěn)定性良好。

圖3 各組血漿樣本的PCA得分圖

圖4 各組血漿樣本的OPLS-DA得分圖

2.4 差異代謝物篩選

為了獲得青蒿鱉甲湯給藥后肝癌模型小鼠的代謝相關物質(zhì)基礎，將青蒿鱉甲湯組與模型組進行比較，根據(jù)OPLS-DA分析結(jié)果，篩選符合VIP>1.0且P<0.05條件的差異變量，最終通過定性分析獲得86個差異代謝物。根據(jù)所尋找的差異代謝物在KEGG數(shù)據(jù)庫進行對比歸屬，最終初步確定了以膽酸、溶血磷脂酰膽堿（LPC）、磷酸鞘氨醇、9，10，13-三羥基十八碳烯酸為主的15種具有顯著差異的代謝物（表1）。

表1 青蒿鱉甲湯給藥組與模型組小鼠血漿標志差異代謝物

2.5 通路分析

將上述15個通過條件篩選出來的具有顯著差異的代謝物進行KEGG通路富集分析，以此作為青蒿鱉甲湯對肝癌模型小鼠血漿代謝組學中的相關代謝途徑。通路富集結(jié)果以富集因子、代謝物個數(shù)、FDR作為參考標準，結(jié)果顯示這些差異代謝物的關鍵代謝途徑主要富集于膽汁分泌、鞘脂代謝、類固醇激素生物合成代謝（圖5）。

圖5 KEGG通路富集分析圖（QBD-MX）

3 討論

青蒿鱉甲湯經(jīng)典的原方組成為：青蒿、鱉甲、細生地、知母、牡丹皮。主治溫病后期、陰液已傷、而余邪深伏陰分，癥見熱退無汗、夜熱早涼、脈細數(shù)、舌紅苔少[10]。青蒿清熱透絡，引邪外出，有抗瘧、抗寄生蟲、解熱抗炎、抗腫瘤及調(diào)節(jié)免疫等功能[11]；鱉甲滋陰退熱，入絡搜邪，有一定抗疲勞和促進免疫功能的作用，還可抗肝纖維化和抑制腫瘤[12]；知母滋陰降火，有一定降血糖、抗炎解熱及抗腫瘤作用[13]；生地滋陰涼血，具有止血、抗腫瘤等作用[14]；丹皮瀉血中伏火，能抗菌消炎及抗腫瘤，對免疫系統(tǒng)有一定影響[15]。本次研究從代謝組學角度闡述青蒿鱉甲湯對肝癌模型小鼠的內(nèi)源性代謝物的調(diào)控作用，改善肝癌及后期發(fā)熱可能參與的代謝途徑。

由于癌癥具有多階段性、多基因改變，發(fā)病過程極其復雜等特點，所以探究癌癥需要從更加整體和宏觀的角度作為出發(fā)點，而代謝組學作為一種較好的研究方法能同時進行定量測定和定性分析機體或機體某一組織包含的所有低分子量代謝產(chǎn)物，監(jiān)測代謝物的波動情況，研究其在外界干預或病理生理條件下的動態(tài)變化規(guī)律。組學技術(shù)能全面地研究機體在病理狀態(tài)下體內(nèi)代謝紊亂情況，其研究方法與中醫(yī)學的整體觀相吻合。疾病會導致機體病理過程的變化，最終引起代謝產(chǎn)物出現(xiàn)相應的改變，代謝物是機體生化反應過程的最終產(chǎn)物，其濃度對遺傳和環(huán)境變化極為敏感[16]，所以該技術(shù)在疾病的預測診斷，機制研究等方面具有重要作用。

3.1 膽汁分泌

膽汁由肝臟生成和分泌。肝細胞生成的膽汁能促進脂質(zhì)的消化和吸收，調(diào)節(jié)膽固醇代謝，清除機體產(chǎn)生的代謝廢物等[17]。本實驗研究發(fā)現(xiàn)青蒿鱉甲湯可以促進膽汁分泌通路中膽酸的含量增加，膽酸是由肝臟中的膽固醇合成的，并在膽汁分泌之前與?；撬峄蚋拾彼峤Y(jié)合成為膽汁酸。而膽酸作為一種有效的信號分子，可作為弱的FXR激動劑，導致膽汁酸合成減少和膽固醇平行增加。細胞核受體FXR對膽汁酸的親和力較高，其相互協(xié)調(diào)作用以維持膽汁酸水平相對穩(wěn)定，形成一個有效的防御機制，能夠抑制膽汁酸的致癌性。有研究發(fā)現(xiàn)膽酸可改善脂溶性維生素的吸收并改善膽汁酸合成缺陷的許多臨床特征，包括改善血清轉(zhuǎn)氨酶水平，降低膽紅素和黃疸以及改善總體健康和生長[18]，從而緩解肝癌小鼠肝功能異常的情況。本研究也發(fā)現(xiàn)青蒿鱉甲湯有上調(diào)左旋肉堿的作用，左旋肉堿具有促進脂肪酸氧化，調(diào)節(jié)機體脂質(zhì)代謝，抗炎抗氧化的功能，可以通過提高抗炎能力從而減輕脂多糖誘導的小鼠肝損傷[19]。

3.2 鞘脂代謝

鞘脂在細胞膜結(jié)構(gòu)、信號傳導和能量提供方面發(fā)揮著重要作用，鞘脂代謝主要通過以鞘氨醇為基礎化合物的復雜反應，調(diào)控細胞生長、分化及凋亡過程，若代謝失常則會導致腫瘤、炎癥、免疫性疾病、心血管等疾病的發(fā)生。許多抗腫瘤藥物、細胞因子能通過影響鞘磷脂的降解而增加內(nèi)源性神經(jīng)酰胺的含量，并抑制S1P的生成，從而引起腫瘤細胞的凋亡，發(fā)揮抗腫瘤作用。近年來有研究發(fā)現(xiàn)鞘脂代謝參與了肝細胞癌（HCC）的發(fā)生與發(fā)展過程，1-磷酸鞘氨醇（S1P）可促進腫瘤增殖、遷移、轉(zhuǎn)化、血管生成[20]。Jung-Chien Cheng等[21]研究結(jié)果顯示，S1P可以作為Hippo途徑的上游阻遏物，從而誘發(fā)HCC細胞中YAP的活化，導致了HCC的發(fā)生。各種病因引起的鞘脂代謝網(wǎng)絡紊亂，包括神經(jīng)酰胺的生成減少或降解增多，S1P生成增多，代謝失衡導致的肝細胞增殖失控，都會促進HCC的發(fā)生、生長、轉(zhuǎn)移和侵襲[20]。本實驗發(fā)現(xiàn)給予青蒿鱉甲湯后肝癌小鼠的1-磷酸鞘氨醇（S1P）和1-磷酸-二氫神經(jīng)鞘氨醇等有下調(diào)趨勢，從而對HCC細胞產(chǎn)生生長抑制，減緩肝癌的發(fā)展進程，表明青蒿鱉甲湯可能通過調(diào)節(jié)鞘脂代謝途徑發(fā)揮肝癌抑制的作用。

3.3 類固醇激素生物合成

類固醇激素又稱為甾體激素，在維持生命、機體生長發(fā)育、能量代謝、免疫調(diào)節(jié)等方面有重要的影響。氫化可的松能增加血管的緊張性，降低毛細血管的通透性，因此減輕滲出、水腫癥狀；通過抑制炎癥細胞在炎癥部位的聚集，并抑制吞噬細胞的功能，穩(wěn)定溶酶體膜，阻止補體參與炎癥反應及炎癥化學中介物的合成與釋放，緩解紅、腫、痛等癥狀，也能提高機體對有害刺激的應激能力。薛成俊等[22]研究表明氫化可的松可促進IL-15活化的NK細胞的增殖，在適合濃度下能增強對胰腺癌SW1990細胞殺傷活性；Jung Kyo Lee等[23]研究發(fā)現(xiàn)氫化可的松能抑制腫瘤的生長且與肝素合用效果更佳。本實驗中氫化可的松上調(diào)說明青蒿鱉甲湯給藥后可通過影響皮質(zhì)激素代謝來改善炎癥反應，從而緩解腫瘤的生長速度，同時減輕癌熱癥狀。

本研究結(jié)果顯示，青蒿鱉甲湯可能通過調(diào)節(jié)體內(nèi)鞘酯代謝、膽汁分泌、類固醇激素生物合成、色氨酸代謝、α-亞麻酸代謝、花生四烯酸代謝、甘油磷脂代謝、賴氨酸降解、亞油酸代謝等代謝通路中的相關代謝產(chǎn)物的表達，抑制肝癌模型小鼠的腫瘤生長的同時減輕癌熱，緩解肝功能異常情況，改善總體健康。