劉昌順，夏 婷，魏小涵，陳飛龍，譚曉梅

（南方醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院廣東省中藥制劑重點實驗室廣東省中藥制劑技術工程實驗室 廣州 510515）

葛根芩連湯（Gegen Qinlian Decoction，GQD）為《傷寒論》經典方劑，具解表清里、升清止利之功，治療協(xié)熱下利證，臨床上對感染性腹瀉療效突出。研究表明GQD具解熱、抗炎、抗菌和止瀉等作用[1]，其藥效物質主要為黃酮類和生物堿類成分[2]。前期研究發(fā)現(xiàn)GQD部分功效成分在腹瀉和正常小型豬體內藥動學存在差異[3]，推測這可能與腹瀉腸道改變對藥物的處置有關，然而這種差異是否會隨著治療持續(xù)和機體康復而逐漸消失，仍不清晰。短鏈脂肪酸（Short-chain fatty acids，SCFAs）是腸道菌群代謝產物，能促進腸道水和電解質的吸收，維持腸道生理和穩(wěn)態(tài)，調節(jié)免疫等作用[4]，是反映機體整體代謝輪廓和腸道健康狀態(tài)的重要指標，已成為腹瀉診斷的重要生物標志物，其含量變化可反映藥物對腹瀉機體的療效進程[5]。本文通過研究GQD給藥期間其主要功效成分在腹瀉小型豬體內藥動學的變化過程及其對血清SCFAs的影響，從機體對藥物的反應及腹瀉標志物水平變化的角度，動態(tài)揭示GQD對腹瀉的作用。

1 儀器與試劑

1.1 實驗材料

UPLC-MS/MS儀（Agilent1290 Infinity-G6410美國安捷倫公司），GC-MS儀（TRACE1300-ISQ美國賽默飛公司），HC-3018R型高速冷凍離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司），超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），BP211D型十萬分之一天平（德國Sartorius）。

1.2 試劑

葛 根（Puerarialobata(Willd.)Ohwi；批 號171000721，產地安徽），黃芩（Scutellaria baicalensisGeorgi；批號171003251，產地河北），黃連（Coptis chinensis Franch.；批號171103221，產地四川）和炙甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.；批號161108681，產地內蒙古）購于康美藥業(yè)股份有限公司，以上藥材由南方醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院晁志教授鑒定。葛根素，大豆苷，大豆苷元，黃芩苷，黃芩素，漢黃芩苷，漢黃芩素，鹽酸小檗堿，鹽酸巴馬汀，鹽酸黃連堿，柚皮苷（GQD成分檢測內標，IS），乙酸，丙酸，丁酸和2-乙基丁酸（SCFAs檢測IS）對照品，均購于中國藥品生物制品檢定所。色譜級別甲醇和乙腈購于德國默克公司，水，甲酸，以及其他試劑均為分析純。

1.3 實驗動物

2 試驗方法

2.1 GQD水煎液的制備

參考課題組前期研究制備GQD水煎液[6-7]，稱取15 g葛根，在400 mL冷水中浸泡30 min后，加熱保持微沸20 min，隨后加入9 g黃連，9 g黃芩和6 g甘草一起煎煮10 min，2層紗布過濾后，藥渣加入300 mL水再次煮沸30 min，藥液2層紗布過濾后與第1次水煎液合并。將水煎液濃縮至0.3 g·mL-1生藥量。水煎液適量稀釋后對其主要功效成分進行含量檢測，得到如下分析結果：7.05 mg·mL-1葛根素，0.90 mg·mL-1大豆苷，0.01 mg·mL-1大豆苷元，1.03 mg·mL-1黃芩苷，0.04 mg·mL-1黃芩素，0.77 mg·mL-1漢黃芩苷，0.02 mg·mL-1漢黃芩素，0.18 mg·mL-1小 檗 堿，0.04 mg·mL-1巴 馬 汀 和0.10 mg·mL-1黃連堿。

2.2 動物實驗

實驗動物適應性喂養(yǎng)3天后，隨機分為正常組和模型組（n=6），每組雌雄各半。按本課題前期研究進行造模[6-7]，模型組乳豬灌胃大腸桿菌液（E-coli；109CFU·kg-1），若連續(xù)腹瀉超過6 h，且糞便E-coli含量大于1011CFU·g-1濕便，說明造模成功。動物實驗前12 h禁食不禁水。動物均口服GQD（1.22 g·kg-1）。分別于0 h、24 h、48 h和72h給予GQD，然后分別于3 h、12 h、24 h、27 h、36 h、48 h、51 h、60 h、72 h、75 h、84 h和96 h在小型豬前腔靜脈采血0.75 mL各2份，一份用肝素鈉抗凝后離心（4℃，5000 rpm，10 min）得到血漿，另1份直接離心獲得血清，-20℃保存待測，其中在24 h、48 h和72 h這3個時間點采血完成立即進行給藥。

2.3 樣品處理

2.3.1 GQD成分檢測樣品處理

取血漿樣品100μL，精密移取IS工作溶液20μL加入血漿樣品，震蕩30 s，加入100μL 0.2%稀鹽酸，震蕩30 s，加入800μL乙酸乙酯-正丁醇（2∶1，v/v）溶液，震蕩3 min，離心（4℃，15000 rpm，10 min），分取上層溶液，再以800μL乙酸乙酯-正丁醇（2∶1，v/v）溶液重復萃取一次，合并上層溶液，氮氣流下吹干。殘留物用200μL甲醇復溶，震蕩2 min，離心（4℃，15000 rpm，10 min），取上清液進行UPLC-MS/MS檢測分析。

2.3.2 SCFAs檢測樣品處理

取血清樣品50μL，加100μL甲醇，震蕩2 min，離心（4℃，15000 rpm，10 min），取上清液100μL，加入IS工作液20μL（60μg·mL-1），取上清液進行GC-MS分析。

2.4 UPLC-MS/MS分析條件

2.4.1 色譜條件

色譜柱：ACE Excel 3-C18column（2.1×100 mm，3μm）；流動相：0.1%的甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫，洗脫條件如下：0 min-2.5 min：15%-30%B，2.5 min-3.5 min：30%-35%B，3.5 min-5 min：35%-40%B，5 min-9 min：40%-60%B，9 min-11 min：15%-60%B。流速：0.4 mL·min-1；柱溫：25℃；進樣量：10μL。

2.4.2 質譜條件

為了能夠實行印尼華人民族語言文化教育，熱愛華文教育的老前輩們想方設法地興辦多種形式的華語教育機構。不過，由于華語只能作為語言課程，在學校其他主要課程中無法發(fā)揮教學用語的作用，華文教育的中華文化傳承功能受到嚴重制約。

離子源：ESI源；毛細管電壓：4000 V，霧化器壓力：30 psi；干燥氣流溫度：350℃；干燥氣流速度：8.0 L·min-1；碰撞氣微高純氮氣。采集模式：多反應監(jiān)測（Multiple reaction monitoring，MRM）模式。通過前期研究分別采用全掃描、選擇性離子掃描和子離子掃描模式，確定各化合物的母離子和子離子，得到成分及IS的最優(yōu)MRM參數(shù)[8]。

2.5 血漿GQD成分測定方法學

2.5.1 對照品溶液的制備

分別精密稱取得10種GQD功效成分對照品適量，甲醇溶解，配制濃度為1.0 mg·mL-1的儲備液。配制對照品混合溶液，稀釋后得到系列濃度的對照品梯度溶液，用空白血漿制備標準曲線和質量控制樣本。

2.5.2 方法學考察

分別進行血漿樣品的專屬性、線性、精密度、回收率、基質效應和穩(wěn)定性試驗，確認分析方法的可行性。分別以空白血漿液，含有對照品的血漿液和實驗樣品進行方法的專屬性考察。精密移取對照品混合溶液，以分析物濃度為橫坐標，各分析物和IS峰面積比值為縱坐標，通過回歸運算繪制標準曲線。以高、中、低濃度的質控樣品液，日內連續(xù)進樣6次，日間連續(xù)進樣3天，以RSD%計算精密度。質控樣品進樣后所得峰面積與空白血漿液處理后加相應對照品進樣所得峰面積相比，計算回收率。質控樣品進樣后所得峰面積為分子，對應濃度的對照品溶液直接進樣后所得峰面積為分母進行計算，計算基質效應。樣品保存24 h后，以RSD%評價樣品測定的穩(wěn)定性。

2.6 GC-MS檢測血清SCFAs

GC-MS檢測出的血清SCFAs主要為乙酸、丙酸和丁酸色譜峰。所用毛細管柱為DB-FFAP122-3232，30 m×0.25 mm×0.25μm，載氣為氮氣，流速1.2 mL·min-1。初始溫度80℃，保持1 min，以10℃·min-1升溫至170℃，后以20℃·min-1升溫至200℃，保留2 min。檢測器和進樣口溫度分別為230℃和200℃，氫氣、空氣、氮氣流速分別為30 mL·min-1、300 mL·min-1、30 mL·min-1。進樣量為1μL，分析時間為12 min。根據(jù)SCFAs檢測的專屬性試驗結果，繪制標準曲線分析血清SCFAs含量。

2.7 數(shù)據(jù)處理

梯形法計算GQD功效成分各時間段的藥時曲線下面積（Area under curve，AUC）。SPSS20.0軟件中的t-test或者ANOVA進行組間的差異分析（P<0.05具有統(tǒng)計學意義）。

3 試驗結果

3.1 GQD治療對腹瀉小型豬的影響

給藥GQD后小型豬腹瀉癥狀有所緩解，在48 h腹瀉癥狀基本消失，0 h-96 h，腹瀉小型豬糞便含水量從91.5%±0.9%下降至66.9%±3.5%（P<0.01），與正常組小型豬糞便含水量（64.5%±5.9%）無顯著差異。糞便E.coli數(shù)量從1012.5CFU·g-1濕便下降至1010.2CFU·g-1，而梭菌的數(shù)量則從103.2CFU·g-1濕便提高至106.7CFU·g-1，給藥GQD前后腹瀉小型豬糞便兩種關鍵菌落的變化具有顯著性差異。

3.2 GQD主要功效成分在血漿樣品的含量測定

專屬性試驗表明空白血漿對各成分出峰時間干擾小，分析物在血漿樣品出峰時間合適、峰型良好、分離度恰當（圖1）。各分析物在相應范圍內線性關系良好（R2>0.99），且定量下限滿足樣品含量檢測要求（表1）。各成分在低、中、高3種濃度水平質控樣品的精密度RSD小于15.0%，說明方法檢測準確可靠（表2）?；厥章试?8.9%和107.2%之間，基質效應在82.9%和106.2%之間，提示方法準確度良好，且檢測過程不受離子效應干擾。穩(wěn)定性試驗結果表明RSD（<15%）符合實驗要求。經驗證，該方法符合小型豬血漿樣品中10種GQD功效成分的檢測要求，可用于小型豬的藥動學研究。

表1 GQD功效成分在血漿中標準曲線的繪制

表2 GQD功效成分在血漿中精密度、回收率、基質效應和穩(wěn)定性試驗結果

圖1 GQD功效成分在血漿中專屬性試驗結果

3.3 GQD給藥期間主要功效成分藥動學研究

藥動學研究表明，給藥GQD后，發(fā)現(xiàn)其主要功效成分在正常和模型小型豬體內的藥動學行為存在顯著差異（圖2）。在0 h-48 h，葛根素、大豆苷元、黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素在腹瀉小型豬體內的血藥水平顯著高于正常組（P<0.05），在48 h-96 h，這些成分在生理病理機體的AUC值無顯著差異。0 h-96 h，葛根素、大豆苷、大豆苷元、黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷和漢黃芩素在腹瀉小型豬體內每天的最大血藥濃度呈現(xiàn)遞減趨勢，正常組則無此現(xiàn)象（表3）。

圖2 連續(xù)給藥GQD后其功效成分在腹瀉和正常小型豬體內的藥時曲線（n=6）

3.4 GQD給藥對小型豬血清SCFAs的影響

血清SCFAs中，乙酸含量最高，丙酸次之，丁酸最低（圖3）。腹瀉小型豬血清SCFAs顯著低于正常組。隨著給藥GQD時間的延長，腹瀉小型豬血清中乙酸、丙酸和丁酸的含量逐漸提高，丙酸和丁酸在72 h恢復至正常水平（P>0.05），乙酸在96 h恢復至正常。GQD對正常小型豬血清SCFAs含量無顯著影響。

圖3 GQD給藥對腹瀉和正常小型豬血清SCFAs濃度的影響

4 討論

4.1 GQD功效成分的藥動學特征

前期發(fā)現(xiàn)GQD給藥腹瀉小型豬后3-4天內可止瀉，觀察至7天沒有反彈現(xiàn)象[6]，因此本文選擇研究GQD連續(xù)給藥4天內的藥動學行為。實驗過程中24 h、48 h和72 h采血與給藥時間重合，為保證前一天的血藥濃度不受后一天給藥干擾，采用先采血后立即給藥的方法進行操作。第24 h中黃芩素在模型組的血藥濃度高于正常組，第48 h中黃芩苷在模型組的含量高于正常組，該結果與AUC結果相一致，即連續(xù)給藥GQD后，在0 h-48 h，發(fā)現(xiàn)其部分功效成分在腹瀉小型豬體內的血藥水平高于正常組（表3），與前期單次給藥結果一致[3]。血藥水平升高的成分主要為黃酮類成分，由于影響藥物體內處置的因素較多，造成這些成分血藥水平提高的原因復雜，就本研究而言，這可能與腹瀉改變GQD功效成分的腸道處置有關[9]。前期研究表明，腹瀉腸道可以增加葛根素跨膜轉運的滲透性，促進其腸道吸收[10]。黃芩苷可以通過大腸桿菌分泌的糖苷酶代謝為苷元黃芩素，吸收后再轉化為原型吸收入血，從而提高黃芩苷和黃芩素血藥濃度[11]。前期發(fā)現(xiàn)腹瀉腸道菌群可以加速GQD糖苷類成分轉化為苷元，且腸桿菌是加速其成分轉化的關鍵菌落之一[7]，與本文結果一致。該證據(jù)同樣部分解釋了腹瀉機體提高大豆苷元和漢黃芩素血藥水平的原因。48 h-96 h，糞便含水量和E.coli數(shù)量顯著下降，GQD成分在生理病理機體內的AUC值無顯著差異，可能與給藥后小型豬腹瀉癥狀得到改善，腸道微生態(tài)逐漸趨于正常有關。

表3 連續(xù)給藥后GQD功效成分的AUC值（h·μg·mL-1）

4.2 GQD給藥對血清SCFAs的影響

針對本文細菌感染性腹瀉模型，腸黏膜炎癥反應及其腸黏膜屏障損傷是其主要病理過程，SCFAs作為調整腸道微生態(tài)的關鍵生物標志物，分子量小易于吸收入血，通過檢測其血內含量可以間接觀察方藥對腸道局部的作用。本文結果表明，GQD給藥在減輕小型豬腹瀉癥狀的同時，提高了血清SCFAs含量，推測這與GQD調整腸道菌群結構，提高腸道SCFAs水平相關[6]。SCFAs主要由結腸梭菌類細菌所產生[12]，本研究表明GQD能提高腸道梭菌含量，降低E.coli數(shù)目，這與血清SCFAs檢測結果一致[13]，推測GQD給藥抑制條件致病菌E.coli繁殖，從而提高梭菌類細菌的豐度及其在腸道的定植，促進SCFAs的產生，局部改善腸道免疫調節(jié)和吸收入血發(fā)揮整體抗炎作用[13]。作為腹瀉生物標志物，檢測血中SCFAs水平可為臨床腹瀉的診斷提供參考[5]。研究已證實腸道菌群紊亂是致瀉的關鍵病因[14]，其代謝產物SCFAs的變化水平可反映腸道菌群乃至腸道的健康狀態(tài)。本文通過血中SCFAs的研究，揭示了GQD對腹瀉的作用及其可能的作用機制，即通過調節(jié)腸道菌群發(fā)揮止瀉作用。

4.3 GQD成分體內過程與SCFAs的聯(lián)系

本研究表明0 h-48 h內，GQD中小檗堿血藥水平在腹瀉小型豬體內有增加趨勢，但前期組織分布研究發(fā)現(xiàn)GQD生物堿類成分主要分布于腸道組織，吸收進入體內的含量較低[8]，提示這類成分口服后有利于緩解腹瀉腸道黏膜炎癥反應，推測其發(fā)揮藥效的靶點場所可能在腸道，并非吸收入血。課題組前期發(fā)現(xiàn)GQD調節(jié)腹瀉小型豬腸道菌群結構的主要功效成分可能與生物堿相關[6]，以上分析與前期報道相一致[15]：GQD功效成分小檗堿可以調節(jié)腸道菌群結構，促進產SCFAs細菌的繁殖，調節(jié)淋巴細胞Th17和Treg的平衡，減輕腸道黏膜免疫炎癥。因此，生物堿類成分可能是GQD提高腹瀉小型豬體內SCFAs含量的重要功效成分。此外，鑒于黃芩苷等黃酮類成分良好的抗炎作用[16]，且這類成分在腸道組織同樣具有較高濃度[8]，提示其發(fā)揮藥效的途徑是多環(huán)節(jié)的，即除了吸收入血解熱抗炎之外，還滯留于腸道組織緩解黏膜炎癥反應，腹瀉腸道微生態(tài)的調整可以間接促進產SCFAs細菌在腸道黏膜表面的定植。綜上所述，GQD提高腹瀉小型豬體內SCFAs含量可能是其功效成分群綜合作用的結果，然而方藥中具體哪些成分與SCFAs相關還有待進一步研究。