劉昌順，胡艷楠，夏 婷，羅振業(yè)，陳飛龍，譚曉梅

（南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院廣東省中藥制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室廣東省中藥制劑技術(shù)工程實(shí)驗(yàn)室 廣州 510515）

香連丸（Xianglian Pill，XLP）源于《太平惠民和劑局方》，由萸黃連（按黃連與吳茱萸10∶1質(zhì)量比炮制）和木香組成，具有清熱燥濕、行氣止痛之功效，方證相應(yīng)，主治大腸濕熱證，臨床對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎、腸易激綜合征等消化道疾病療效顯著[1]。近年來(lái)對(duì)XLP的研究報(bào)道主要集中于藥理藥效方面，發(fā)現(xiàn)XLP可以減輕腸道黏膜炎癥，緩解腸道痙攣性疼痛，發(fā)揮藥理效應(yīng)的成分主要為生物堿類和內(nèi)酯類[2,3]。目前XLP成分的體外解析工作已有相關(guān)報(bào)道，檢測(cè)成分包括小檗堿、藥根堿、黃連堿、巴馬汀、木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯等，然而這些成分口服后在體內(nèi)的處置過程如何，至今研究報(bào)道甚少[4]。鑒于XLP多成分多藥理途徑改善大腸濕熱證的作用，推測(cè)方藥口服后其不同效應(yīng)成分經(jīng)過腸道滯留、吸收入血、代謝轉(zhuǎn)化等體內(nèi)不同處置過程，分布蓄積于不同臟器組織，從而整體發(fā)揮方藥藥效。因此本研究基于XLP成分的藥理效應(yīng)和含量及儀器檢測(cè)靈敏度的考慮，選擇君藥萸黃連中小檗堿、黃連堿、吳茱萸堿等6個(gè)生物堿類成分，臣藥木香中木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯2個(gè)內(nèi)酯類成分，UPLC-MS/MS檢測(cè)上述8種成分的組織濃度，研究其體內(nèi)分布特征，為XLP作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試劑

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

G6410型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子源和MassHunter B.04.00數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，（美國(guó)Agilent公司）；Agilent1290超高效液相色譜系統(tǒng)（美國(guó)Agilent公司）；HC-3018R型高速冷凍離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；KQ5200D超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；BP211D型十萬(wàn)分之一天平（德國(guó)Sartorius）。

1.2 試劑

黃連（批號(hào)H3668231，產(chǎn)地四川）、吳茱萸（批號(hào)W2519813，產(chǎn)地湖南）、木香（批號(hào)M3819311，產(chǎn)地四川）購(gòu)于廣東省藥材公司中藥飲片廠。香連丸，實(shí)驗(yàn)室自制。鹽酸小檗堿，鹽酸黃連堿，鹽酸巴馬汀，鹽酸藥根堿，吳茱萸堿，吳茱萸次堿，木香烴內(nèi)酯，去氫木香內(nèi)酯和聯(lián)苯雙酯（內(nèi)標(biāo)物，IS）對(duì)照品（純度>97%），均購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所。色譜級(jí)別甲醇和乙腈購(gòu)于德國(guó)默克公司，水，甲酸，以及其他試劑均為分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

（20±2）g的Kunming小鼠24只，購(gòu)于南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（SCXK（粵）2016-0041）。

2 試驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)3天后，隨機(jī)分為4組（n=6）。小鼠灌胃給予XLP（1.6 g·kg-1，相當(dāng)于56.58 mg·kg-1黃連堿、201.48 mg·kg-1小檗堿、20.24 mg·kg-1藥根堿、42.14 mg·kg-1巴 馬 汀、0.80 mg·kg-1吳 茱 萸 堿、0.55 mg·kg-1吳茱萸次堿、5.72 mg·kg-1木香烴內(nèi)酯、8.58 mg·kg-1去氫木香內(nèi)酯）。分別于給藥后0.5 h、2.0 h、4.0 h、8.0 h處死小鼠，取小腸、大腸、肝、心、肺和腎，生理鹽水沖洗干凈后-80℃保存待測(cè)。

2.2 樣品處理

稱重組織樣品0.2 g，加入4倍量甲醇勻漿，4℃下4500 rpm離心10 min，取上清液，精密加入內(nèi)標(biāo)工作溶液（1μg·mL-1聯(lián)苯雙酯甲醇溶液）20μL，震蕩30 s，氮?dú)饬飨麓蹈?。殘留物?00μL乙腈復(fù)溶，震蕩2 min，4℃下15000 rpm離心10 min，取上清液進(jìn)行UPLCMS/MS檢測(cè)分析。

2.3 儀器分析條件

2.3.1 色譜條件

通過UPLC-MS/MS對(duì)XLP中8種活性成分進(jìn)行分析，使用ACE Excel 3 C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，3μm）和流動(dòng)相0.1%（v/v）甲酸水（A）和乙腈（B）進(jìn)行洗脫，0.0 min-3.0 min：25%-30%B；3.0 min-5.0 min：30%-40%B；5.0 min-7.5 min：40%-45%B；7.5 min-8.0 min：45%-25%，流速0.3 mL·min-1，柱溫：25℃；進(jìn)樣量：10μL。

2.3.2 質(zhì)譜條件

離子源：ESI源；毛細(xì)管電壓：4000 V，霧化器壓力：30 psi；干燥氣流溫度：350℃；干燥氣流速度：8.0 L·min-1；碰撞氣微高純氮?dú)?。采集模式：多反?yīng)監(jiān)測(cè)（Multiple reaction monitoring，MRM）模式。分別采用全掃描、選擇性離子掃描和子離子掃描模式，確定各化合物的母離子和子離子，得到待測(cè)成分及IS的最優(yōu)MRM參數(shù)（表1）。

表1 香連丸中8種功效成分及內(nèi)標(biāo)物的MRM參數(shù)。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱取8種XLP功效成分對(duì)照品適量，甲醇溶解，配制質(zhì)量濃度為1.0 mg·mL-1的儲(chǔ)備液。配制對(duì)照品混合溶液，稀釋后得到系列濃度的對(duì)照品梯度溶液，用空白肝組織勻漿液制備標(biāo)準(zhǔn)曲線和質(zhì)量控制樣本。

2.4.2 方法學(xué)考察

以肝組織勻漿液為代表性基質(zhì)，分別進(jìn)行樣品專屬性，標(biāo)準(zhǔn)曲線，精密度，準(zhǔn)確度，回收率，基質(zhì)效應(yīng)和穩(wěn)定性試驗(yàn)，確認(rèn)分析方法的可行性。分別以空白組織勻漿液，含有對(duì)照品組織勻漿液和實(shí)驗(yàn)樣品進(jìn)行方法的專屬性考察。精密移取對(duì)照品混合溶液，以分析物濃度為橫坐標(biāo)（X），各分析物與IS峰面積比值為縱坐標(biāo)（Y），以1/X作為權(quán)重，用加權(quán)最小二乘法線性回歸運(yùn)算繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以高、中、低濃度的質(zhì)控樣品液，日內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣6次，日間連續(xù)進(jìn)樣3天，以RSD%計(jì)算精密度，以RE%計(jì)算準(zhǔn)確度。質(zhì)控樣品進(jìn)樣后所得峰面積與空白組織勻漿液處理后加相應(yīng)對(duì)照品進(jìn)樣所得峰面積相比，計(jì)算回收率。質(zhì)控樣品進(jìn)樣后所得峰面積為分子，對(duì)應(yīng)濃度的對(duì)照品溶液直接進(jìn)樣后所得峰面積為分母進(jìn)行計(jì)算，計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)。樣品保存24 h后，以RSD%評(píng)價(jià)樣品測(cè)定的穩(wěn)定性。

2.5 數(shù)據(jù)處理

使用DAS3.0軟件計(jì)算XLP功效成分在各時(shí)間段的藥時(shí)曲線下面積（Area under the curve，AUC）。通過成分在單一組織AUC值與全部組織總AUC值的比值計(jì)算分布百分比（Distribution percentage，DP）。SPSS20.0軟件中ANOVA分析各成分在不同組織間的分布差異（P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義）。

3 試驗(yàn)結(jié)果

3.1 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)表明空白組織勻漿夜對(duì)各成分出峰時(shí)間干擾小，分析物在樣品出峰時(shí)間合適，峰型良好，分離度恰當(dāng)（圖1）。各分析物在相應(yīng)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（R>0.99），且定量下限滿足樣品含量檢測(cè)要求（表2）。各成分在低、中、高3種濃度水平質(zhì)控樣品精密度RSD小于11.0%，準(zhǔn)確度RE范圍為-5.7%-11.6%，說(shuō)明方法檢測(cè)準(zhǔn)確可靠?；厥章史秶鸀?9.8%-102.1%，基質(zhì)效應(yīng)范圍為91.2%-101.6%，提示方法準(zhǔn)確度良好，且檢測(cè)過程不受離子效應(yīng)干擾。穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果表明RSD（<6%）符合實(shí)驗(yàn)要求。經(jīng)驗(yàn)證，該方法符合小鼠組織勻漿液中8種XLP功效成分的檢測(cè)要求，可用于小鼠組織分布研究（表3）。

表2 香連丸功效成分在組織勻漿液中的線性關(guān)系考察。

表3 香連丸功效成分在組織勻漿液中精密度、準(zhǔn)確度、回收率、基質(zhì)效應(yīng)和穩(wěn)定性考察（n=6）

圖1 香連丸組織勻漿液的UPLC-MS/MS專屬性考察。

3.2 組織分布研究

小鼠口服XLP后，其主要功效成分廣泛分布于體內(nèi)組織，其中黃連生物堿類成分是方藥中高濃度成分，在各組織中具有較高的AUC值（圖2、表4）。XLP成分在小腸組織具有較高濃度，DP值>25%。小檗堿、黃連堿、巴馬汀和藥根堿在小腸的DP值分別為48.5%、30.3%、28.3%和29.3%，顯著高于其他組織。其次小檗堿在肝組織，黃連堿在心組織，巴馬汀和藥根堿在腎組織具有較高分布。木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯在肺和小腸組織具有高濃度，其在肺部DP值分別高達(dá)40.6%和47.5%，在小腸的DP值分別為28.1%和25.6%。吳茱萸堿和吳茱萸次堿在結(jié)腸和小腸具有較高濃度，其在結(jié)腸的DP值分別為32.7%和27.5%，在小腸為26.8%和27.9%（表5）。

表4 小鼠口服香連丸后8種主要功效成分在各組織中的AUC0 h-8 h（n=6，h·μg·g-1）

表5 小鼠口服香連丸后8種主要功效成分在各組織中的分布百分比（n=6，%）

圖2 小鼠口服香連丸后8種功效成分的組織分布特征（n=6）。

4 討論

4.1 XLP功效成分的組織分布特征分析

研究結(jié)果表明，小鼠口服XLP后其主要功效成分廣泛分布于體內(nèi)組織，4種黃連生物堿成分的組織濃度最高，其次為2種木香內(nèi)酯成分，2種吳茱萸內(nèi)酯含量最低，這種現(xiàn)象主要以方藥本身的藥味配伍劑量有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)XLP功效成分在小腸的DP值大于25%，提示其在小腸組織的濃度較高?？v觀全身組織臟器，各類成分的分布特征存在差異，具體主要與其理化性質(zhì)及腸道吸收特征有關(guān)：①君藥黃連中小檗堿、黃連堿、巴馬汀和藥根堿在小腸的DP值分別為48.5%、30.3%、28.3%和29.3%，表明黃連生物堿類成分難以吸收入血，主要滯留于小腸組織。前期研究證實(shí)這4種黃連生物堿具有相同的母核結(jié)構(gòu)，屬于異喹啉類生物堿，極性較大，腸道跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)能力較差，吸收進(jìn)入腸細(xì)胞后還存在P-糖蛋白介導(dǎo)的外排現(xiàn)象，這些低吸收特征限制了XLP中生物堿類成分腸道吸收入血[5-6]；②臣藥木香中木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯，除了在腸道組織具有高濃度外，其在肺部組織的DP值分別高達(dá)40.6%和47.5%，提示該類成分易于吸收入血而高比例分布于肺組織。木香成分內(nèi)酯結(jié)構(gòu)極性較小，生物膜透過性良好，主要以被動(dòng)擴(kuò)散的形式被腸道吸收，因此這類成分吸收入血后在肺部組織具有高分布，與前期報(bào)道一致[7]；③吳茱萸堿和吳茱萸次堿屬于佐使藥吳茱萸的主要成分，兩者同時(shí)高分布于腸道組織，可能與其水溶性差有關(guān)[8]，從而低濃度分布于其他臟器組織。吳茱萸堿和吳茱萸次堿在結(jié)腸的分布與小腸相當(dāng)，提示兩者在腸道吸收窗口無(wú)選擇性，前期報(bào)道兩者在小腸和結(jié)腸具有類似的吸收速率常數(shù)和有效滲透系數(shù)[9]，本研究與前期報(bào)道相符。

此外，XLP中巴馬汀在腎臟組織濃度與小腸組織相當(dāng)，木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯在肺部組織顯著高于小腸組織，以上現(xiàn)象排除了腸組織樣品處理操作不當(dāng)，藥物粘附腸壁的可能。盡管小腸部位腸絨毛豐富，皺褶較多，是藥物吸收的主要部位，但并不代表藥物高分布于腸組織，以上分析提示XLP功效成分組織分布特征是其理化性質(zhì)與機(jī)體綜合作用的結(jié)果。

4.2 XLP功效成分組織分布與其藥效的相關(guān)性分析

腸道炎癥和痙攣性腹痛是潰瘍性結(jié)腸炎主要臨床癥狀，XLP中黃連清熱燥濕，瀉火解毒，吳茱萸炮制能引藥入肝，增加黃連疏肝止痛之功，木香行氣止痛，全方對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎的臨床癥狀具有良好的改善作用，其功效成分組織分布特征有助于解釋其良好的臨床治療效果。董艷[10-11]發(fā)現(xiàn)，XLP給藥可以通過調(diào)節(jié)IL-6/STAT3通路抑制潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠的腸黏膜STAT3活化，促進(jìn)炎癥細(xì)胞的凋亡；提高Bcl-2 mRNA水平，降低Bax mRNA表達(dá)，改善結(jié)腸黏膜損傷，減少上皮細(xì)胞凋亡，多途徑緩解腸道炎癥，這些作用途徑與黃連生物堿抗炎和免疫調(diào)節(jié)藥理活性相一致[12-13]。相比于其他功效成分，黃連生物堿是XLP口服后在腸道組織高濃度長(zhǎng)時(shí)間滯留的組分，推測(cè)這類成分是XLP發(fā)揮抗炎作用的主要成分（表4）。除抗炎作用之外，黃連生物堿可以抑制腸上皮細(xì)胞屏障功能障礙，對(duì)腸道黏膜損傷具有良好的預(yù)防和修復(fù)作用[14-15]，進(jìn)一步佐證其多成分多靶點(diǎn)藥理作用。

木香中內(nèi)酯類成分木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯在腸道組織具有較高濃度，這2種成分是木香改善胃腸道痙攣?zhàn)饔玫闹饕煞郑浒l(fā)揮藥理作用的機(jī)理涉及到抑制毒蕈堿受體、血清素受體和鈣離子外排等途徑，這提示XLP臨床改善潰瘍性結(jié)腸炎患者腹痛癥狀可能與木香內(nèi)酯成分腸道高濃度滯留有關(guān)[16]。2種木香內(nèi)酯成分在肺部組織具有高分布，藥理研究表明其可以通過調(diào)控MAPK信號(hào)通路和/或抑制巨噬細(xì)胞的激活等途徑減輕肺部炎癥損傷[17-19]，對(duì)改善肺纖維化同樣具有良好的生物活性[20]。木香辛苦而溫，能升降諸氣，其功效成分在肺部組織的分布推測(cè)有利于調(diào)整肺部生理功能。XLP中木香作為臣藥配伍使用發(fā)揮行氣化滯止痛之功，然而這種臨床效應(yīng)機(jī)制是否與肺部功能的調(diào)整作用有關(guān)，仍需進(jìn)一步的探討。

吳茱萸堿和吳茱萸次堿具有抗炎和鎮(zhèn)痛作用，可以協(xié)同黃連生物堿在腸道抗炎，還能通過抑制疼痛介質(zhì)釋放、過氧化損傷及一氧化氮損傷，協(xié)同木香內(nèi)酯發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用[21]，在方藥中發(fā)揮佐使藥的功效，整體加強(qiáng)方藥改善潰瘍性結(jié)腸炎的炎癥和腹痛的作用。此外，本文推測(cè)XLP體內(nèi)組織分布特征可能是全方配伍成分相互作用的結(jié)果。前期發(fā)現(xiàn)吳茱萸配伍可增加黃連生物堿的肝臟分布，降低其在肺部比例[22]，研究還發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象，肝DP值>16%，肺部DP值<10%，這有利于解釋XLP中黃連萸制發(fā)揮引藥入肝，增加疏肝散寒止痛的作用，然而這種分布趨勢(shì)與方藥配伍的聯(lián)系，有待于進(jìn)一步系統(tǒng)研究。