陳中怡，李 蕓，周張杰，吳婷婷，付淑娟，鐘 薏＊＊，楊 銘，陳 健，王治英

（1.上海市虹口區(qū)歐陽路街道社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心 上海 200081；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)研究生院 上海 201203；3.上海市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 上海 200082；4.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院 上海 200032；5.天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院 天津 301617）

結(jié)腸癌是是常見的惡性腫瘤之一。2018年的全球癌癥數(shù)據(jù)報(bào)告[1]顯示，結(jié)腸癌已成為發(fā)病率前三的癌癥之一，其死亡率排名第二。由于基因表達(dá)模式多變，很多調(diào)控機(jī)制尚有待研究，西醫(yī)并未明確結(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)制。目前已有三種學(xué)說：腺瘤-癌變學(xué)說、腫瘤干細(xì)胞假說和炎癥學(xué)說。對于未轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌，主要通過外科手術(shù)治療；無法手術(shù)的則采用內(nèi)科放化療或放化療結(jié)合手術(shù)治療、基因治療、分子靶向藥物治療、生物免疫學(xué)治療等。但西醫(yī)治療仍有一定局限性，許多患者無法耐受在療效收益同時(shí)帶來的不良反應(yīng)。

中醫(yī)古籍中并未確切提到結(jié)腸癌這一名詞，但在古籍中能找到大量與現(xiàn)代大腸癌癥狀體征、病因病機(jī)類似的病名，早在《黃帝內(nèi)經(jīng)》中就有相關(guān)記載，如《靈樞·刺節(jié)真邪篇》中云： “有所結(jié)，氣歸之，衛(wèi)氣留之，不得反，津液久留，合而為腸溜” ?，F(xiàn)代將大腸癌歸屬于中 醫(yī) “便血” “腸風(fēng)” “積聚” “臟毒” “腸蕈” “鎖肛 痔” 等范疇?，F(xiàn)代中醫(yī)在古人的基礎(chǔ)上，在治療結(jié)腸癌以及改善結(jié)腸癌伴有的便秘、腹瀉、腹痛、便血等癥狀上取得了長足發(fā)展，提高了患者的生存質(zhì)量。祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)治療結(jié)腸癌的寶庫亟待發(fā)掘。

健脾固腸方是上海市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院鐘薏主任在臨床治療結(jié)腸癌中總結(jié)出的經(jīng)驗(yàn)方。健脾固腸方的 “前身” 扶正健脾方已經(jīng)通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)能夠降低PI3K、AKT蛋白的表達(dá)，抑制PI3K-AKT信號(hào)通路，從而減少腸癌侵襲及轉(zhuǎn)移微環(huán)境的形成，減少結(jié)腸癌復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的可能性[2]。前期關(guān)于健脾固腸方的臨床研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)，健脾固腸方能夠減少腸道粘膜通透性、抑制腸道炎性反應(yīng)[3]、保護(hù)腸道屏障[4]、調(diào)節(jié)腸道免疫平衡[5]，能改善結(jié)腸癌引起的不適主訴，減少結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)，提高結(jié)腸癌患者的長期生活質(zhì)量。

由于健脾固腸方組成藥物多、成分復(fù)雜，其治療結(jié)腸癌的作用機(jī)制尚不完全明確。而網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一門通過設(shè)立信號(hào)節(jié)點(diǎn)搭建網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)一步分析網(wǎng)絡(luò)闡述疾病過程與藥物對機(jī)體作用，從而研究藥物作用機(jī)制的新興學(xué)科。近年來網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)在篩選中藥活性化合物、預(yù)測中藥作用靶點(diǎn)、闡述方藥作用機(jī)制等中醫(yī)藥研究中起著重要作用。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究，嘗試探討健脾固腸方治療結(jié)腸癌的作用機(jī)制。PI3K是健脾固腸方的前身扶正健脾方的作用靶點(diǎn)，同時(shí)是PI3K-AKT信號(hào)通路的上游，且前期發(fā)現(xiàn)能夠能減輕腸道炎癥[3]，故通過體外實(shí)驗(yàn)研究驗(yàn)證健脾固腸方及其關(guān)聯(lián)度最高的潛在活性化合物棕櫚酸對PI3K、AKT蛋白與IL-6炎性因子的影響，為健脾固腸方的臨床應(yīng)用、新適應(yīng)癥開發(fā)以及治療結(jié)腸癌的新藥研發(fā)提供一定思路。

1 材料與方法

1.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)部分

1.1.1 篩選活性成分和靶蛋白

本研究通過檢索CINTMED、TCMID、TCMSP、HIT、STITCH數(shù)據(jù)庫，以QED大于0.2[6]作為篩選原則，通過TCMSP、PubChem、ChEMBL數(shù)據(jù)庫以及查閱相關(guān)文獻(xiàn)得到化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

通過TCMID、TCMSP、HIT、STITCH數(shù)據(jù)庫進(jìn)行活性化合物的靶點(diǎn)預(yù)測。TCMID、HIT以RV大于0.8作為篩選指標(biāo)，TCMSP以RFA大于0.8、AVM大于0.7作為篩選指標(biāo)，STITCH以Medium confidence 0.400作為篩選指標(biāo)[7]。

1.1.2 結(jié)腸癌的相關(guān)靶點(diǎn)搜集

通過檢索MalaCards、HGMD、OMIM、TTD、DrugBank以及查閱相關(guān)文獻(xiàn)，整理得到結(jié)腸癌的疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫。

1.1.3 中藥-化合物-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將復(fù)方潛在作用靶點(diǎn)和結(jié)腸癌靶點(diǎn)信息分別導(dǎo)入STRING構(gòu)建PPIN。并利用Cytoscape 3.7.2[8]建立健脾固腸方中藥-化合物-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖。

1.1.4 構(gòu)建靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)

通過Network Analyzer對其進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析，先以Degree的2倍中位數(shù)篩選出核心網(wǎng)絡(luò)，再根據(jù)Degree中位數(shù)、Closeness中位數(shù)、Betweenness中位數(shù)篩選出結(jié)腸癌關(guān)鍵靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)[9]，再利用Merge將兩者合并，篩選出健脾固腸方結(jié)腸癌共同關(guān)鍵靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)。

1.1.5 KEGG信號(hào)通路和GO生物過程富集分析

將采集篩選得到的健脾固腸方潛在作用靶點(diǎn)分別導(dǎo)入GO、KEGG數(shù)據(jù)庫，采用超幾何分布模型P值評估GeneSet與基因本體是否顯著關(guān)聯(lián)，并使用Bonferroni Corrected[10]調(diào)整的P值（P.adjust）反映靶點(diǎn)與基因本體的關(guān)聯(lián)強(qiáng)度，以P.adjust<0.01為顯著關(guān)聯(lián)，得到GO富集及KEGG信號(hào)通路。

1.2 實(shí)驗(yàn)部分

1.2.1 藥物制備與試劑

健脾固腸方顆粒劑（江陰天江藥業(yè)有限公司，批號(hào)：1709320）；棕櫚酸（Sigma，批號(hào)：SLBM8964N）；氫氧化鈉（Richjoint，批號(hào)：20190310JN）；脫脂牛血清白蛋 白（Bio-Light Biotech，批 號(hào)：BSA081022）；PBS（Basal Media，批號(hào)：C210702764）；0.4%臺(tái)盼藍(lán)染液（Noblebio，批號(hào)：2019070500）；DMEM培養(yǎng)基（Giboc，批號(hào)：2120374）；胎牛血清FBS（Giboc，批號(hào)：1828728）；CCK8試劑盒（Sangon Biotech，批號(hào)：E606335-0500）；EDTA胰酶（Giboc，批號(hào)：25200-072）；PI3 Kinase p110βRabbit mAb（CST，批 號(hào)：3011S）；Phospho-PI3 Kinase ClassⅢ（Ser249）Antibody（CST，批號(hào)：13857S）；Goat Anti-Rabbit IgG二抗HRP（Abbkine，批號(hào)：A21020）；Goat Anti-Mouse IgG（Abbkine，批 號(hào)：A21010）；Anti-β-Actin Mouse Monoclonal Antibody（Abbkine，批號(hào)：A01010）等。

將10只SD大鼠隨機(jī)分成空白組和中藥組，空白組2只，中藥組8只。中藥組按相當(dāng)于70 kg成年人105 g中藥的劑量，即9.45 g·kg-1劑量對大鼠灌胃，空白組大鼠按重量灌胃等體積的超純水，每天灌胃1次，連續(xù)灌胃10日。在第10日灌胃后2 h，對大鼠進(jìn)行心臟取血，以4℃、2000 rpm離心10 min后提取血清，除菌后以-80℃冷凍存放。所有SD大鼠購買于上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)碼：SCXK（滬）2018-0006，合格證編號(hào)：20180006008347，飼養(yǎng)于上海市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院脈管病研究所。

1.2.2 分組和藥物干預(yù)

分為健脾固腸方含藥血清組、空白血清組和棕櫚酸組。含藥血清組和空白血清組分別再設(shè)20%組、15%組、10%組和5%組[11]。棕櫚酸組再設(shè)500μM組、250μM組、125μM組、62.5μM組、31.25μM組、15.63 μM組、7.81μM組、3.91μM組、1.95μM組和0μM組[12]，并另設(shè)對照組和空白對照組。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)傳代

SW480細(xì)胞由上海中醫(yī)藥大學(xué)科技實(shí)驗(yàn)中心分子生物與藥理實(shí)驗(yàn)室吳中華老師惠贈(zèng)。將細(xì)胞懸液加入10 cm皿中，同時(shí)加入8 mL培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，直至檢測細(xì)胞密度達(dá)到80%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.4 CCK8法

在96孔板上以每孔5×103個(gè)細(xì)胞接種，設(shè)4個(gè)復(fù)孔，按照2.4分組和藥物進(jìn)行干預(yù)。在每個(gè)復(fù)孔中加入10μLCCK8試劑，將孔板放入培養(yǎng)箱中孵育45 min，用酶標(biāo)儀在450 nm波長處測定光密度（Optical density，OD）值。

1.2.5 Western Blot法

測定蛋白濃度并計(jì)算蛋白上樣量。將蛋白樣品分別加入10%和5%的凝膠中電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶于室溫條件下?lián)u床封閉2 h，按照1∶1000加入一抗，4℃孵育過夜。第2日1×TBST充分洗膜（5 min×3），加入二抗（1∶2000），1×TBST充分洗膜（5 min×3），ECL發(fā)光顯影。

1.2.6 化學(xué)發(fā)光法

收集細(xì)胞上清液，將上清液和生物素標(biāo)記抗體，三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記抗體加入一次性反應(yīng)杯，37℃孵育10 min。加入聯(lián)袂親和素包被的磁珠，37℃孵育10 min。加入三丙胺激發(fā)緩沖液，檢測相對光子強(qiáng)度（Relative light units，RLU）。通過標(biāo)準(zhǔn)品的RLU簡歷標(biāo)準(zhǔn)曲線，定量測出IL-6的含量。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 27.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，當(dāng)Levene方差齊性檢驗(yàn)顯示方差齊時(shí)，采用LSD法進(jìn)行兩兩比較，以P值小于0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)部分

2.1.1 健脾固腸方候選化合物和對應(yīng)人類靶點(diǎn)篩選結(jié)果

健脾固腸方8味中藥中，黃芪有36個(gè)活性化合物，黨參有30個(gè)活性化合物，茯苓有7個(gè)活性化合物，白術(shù)21個(gè)活性化合物，土茯苓有20個(gè)活性化合物，菝葜有13個(gè)活性化合物，預(yù)知子有3個(gè)活性化合物，藤梨根有2個(gè)活性化合物，共有102個(gè)潛在活性化合物，30個(gè)活性化合物在不同中藥中重疊。通過Network Analyzer對其進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析，表1展示了結(jié)果中Degree值大于1的部分，通過分析可得全方關(guān)聯(lián)最多潛在活性化合物為棕櫚酸（palmitic acid，c175）。

表1 健脾固腸方中藥-活性化合物網(wǎng)絡(luò)分析及其拓?fù)鋵W(xué)特征

2.1.2 構(gòu)建中藥-活性化合物-潛在作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)及蛋白質(zhì)互相作用網(wǎng)絡(luò)

健脾固腸方共得到潛在作用靶點(diǎn)481個(gè)，將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2通過Network Analyzer對其進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析，篩選出關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)51個(gè)（表2、圖1）。

表2 健脾固腸方關(guān)鍵靶點(diǎn)及其拓?fù)鋵W(xué)特征

2.1.3 人結(jié)腸癌蛋白質(zhì)互相作用網(wǎng)絡(luò)

共篩選出572個(gè)結(jié)腸癌疾病靶點(diǎn)，去重合并整理后共得到517個(gè)疾病靶點(diǎn)（圖2）。將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2通過Network Analyzer對其進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析，篩選出關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)25個(gè)（表3）。

表3 結(jié)腸癌關(guān)鍵靶點(diǎn)

圖2 結(jié)腸癌靶點(diǎn)互相作用網(wǎng)絡(luò)

2.1.4 健脾固腸方-結(jié)腸癌互相作用網(wǎng)絡(luò)

建立復(fù)方-疾病共同PPIN（圖3）。利用Cytoscape 3.7.2中Merge得到疾病與復(fù)方4個(gè)共同關(guān)鍵靶點(diǎn)（表4）。

圖3 結(jié)腸癌與健脾固腸方靶點(diǎn)互相作用網(wǎng)絡(luò)

表4 結(jié)腸癌與健脾固腸方共同關(guān)鍵靶點(diǎn)

2.1.5 GO富集分析

共富集得到基于MF 153條疾病GO途徑和176條復(fù)方GO途徑，基于BP 2479條疾病GO途徑（圖4）和2318條復(fù)方GO途徑（圖5），基于CC 82條疾病GO途徑和98條復(fù)方GO途徑（圖6）。綜合GO富集分析顯示，健脾固腸方潛在作用靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)在GO水平上顯示出共關(guān)聯(lián)性，復(fù)方與疾病基因共關(guān)聯(lián)GO相似度達(dá)61.57%，主要與細(xì)胞的增殖、分化和凋亡、轉(zhuǎn)錄、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、跨膜運(yùn)輸?shù)扔嘘P(guān)。

2.1.6 KEGG信號(hào)通路富集分析

分析得到復(fù)方與疾病共關(guān)聯(lián)信號(hào)通路54條（圖7），其中PI3K-AKT信號(hào)通路（圖8）、腫瘤壞死因子信號(hào)通路（圖9）、細(xì)胞凋亡（圖10）與3個(gè)共關(guān)聯(lián)靶點(diǎn)有關(guān)。復(fù)方與疾病基因共關(guān)聯(lián)KEGG信號(hào)通路相似度72.00%。

圖9 腫瘤壞死因子信號(hào)通路

圖10 細(xì)胞凋亡

2.2 實(shí)驗(yàn)部分

2.2.1 健脾固腸方含藥血清及棕櫚酸對SW480細(xì)胞增殖的影響

研究結(jié)果表明，健脾固腸方含藥血清干預(yù)24 h，在5%低濃度范圍時(shí)，能夠促進(jìn)SW480細(xì)胞增殖（圖11）；在10%到20%較高濃度范圍時(shí)，能夠抑制SW480細(xì)胞增殖，且呈濃度依賴性，通過單因素方差分析比較不同濃度含藥血清與同濃度空白血清OD值發(fā)現(xiàn)（圖12），15%濃度含藥血清與同濃度的空白血清相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；20%濃度含藥血清與同濃度的空白血清相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。

圖12 不同濃度含藥血清、空白血清、培養(yǎng)基干預(yù)24 h的OD值

研究結(jié)果表（圖13-圖14）明，棕櫚酸干預(yù)24 h，在0μM-62.5μM低濃度范圍內(nèi)能夠促進(jìn)SW480細(xì)胞增殖；在125μM-500μM高濃度范圍內(nèi)能夠抑制SW480細(xì)胞增殖。棕櫚酸干預(yù)48 h，在0μM-62.5μM低濃度范圍內(nèi)同樣能夠促進(jìn)SW480細(xì)胞增殖，在125μM-500μM高濃度范圍內(nèi)能夠抑制SW480細(xì)胞增殖。

圖13 不同濃度棕櫚酸分別干預(yù)24 h、48 h對SW480細(xì)胞的抑制率

圖14 不同濃度棕櫚酸分別干預(yù)24 h、48 h的OD值

2.2.2 健脾固腸方含藥血清和棕櫚酸干預(yù)SW480細(xì)胞后PI3K和AKT蛋白的表達(dá)

研究結(jié)果表明（圖15-圖16），與對照組相比，含藥血清組和棕櫚酸組能降低SW480細(xì)胞中PI3K的蛋白表達(dá)，但與對照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；空白血清組中PI3K蛋白表達(dá)升高，但與對照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與空白血清組相比，含藥血清組能降低PI3K蛋白的磷酸化，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與對照組相比，棕櫚酸組能降低PI3K蛋白的磷酸化，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

圖15 各組藥物干預(yù)24 h對SW480細(xì)胞中PI3K蛋白的表達(dá)

圖16 各組藥物干預(yù)24 h對SW480細(xì)胞中p-PI3K蛋白的表達(dá)

研究結(jié)果表明（圖17），與空白血清組相比，含藥血清組能降低AKT總蛋白的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與對照組相比，棕櫚酸組能降低AKT總蛋白的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。與空白血清組相比，含藥血清組能降低AKT蛋白的磷酸化，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與對照組相比，棕櫚酸組能降低AKT蛋白的磷酸化，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。

圖17 各組藥物干預(yù)24 h對SW480細(xì)胞中AKT、p-AKT蛋白的表達(dá)

2.2.3 健脾固腸方含藥血清和棕櫚酸干預(yù)SW480細(xì)胞后對IL-6含量的影響

研究結(jié)果表明（圖18），與空白血清組相比，含藥血清組能降低SW480細(xì)胞中IL-6濃度，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與對照組相比，含藥血清組能升高IL-6濃度，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與對照組相比，棕櫚酸組能升高SW480細(xì)胞中IL-6濃度，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與對照組相比，空白血清組中IL-6濃度升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。

圖18 各組藥物干預(yù)24 h SW480細(xì)胞中IL-6的濃度

3 討論

結(jié)腸癌臨床表現(xiàn)通常有便秘、腹瀉、腹痛、腹脹、不思飲食、惡心嘔吐、精神倦怠、寡言少語等，通過大量臨床病例的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)，以四君子湯為基礎(chǔ)，擬出的健脾固腸方[13]，全方共黃芪、黨參、茯苓、白術(shù)、土茯苓、菝葜、預(yù)知子、藤梨根8味藥。全方以黃芪補(bǔ)氣益衛(wèi)、固表止汗、托瘡生肌、利水消腫，能夠促進(jìn)腸道粘膜修復(fù)、減輕腸道炎癥反應(yīng)[14]，黨參、茯苓、白術(shù)共同作用，加強(qiáng)補(bǔ)益脾胃正氣，健脾和胃，減少對腸道粘膜的刺激，修復(fù)腸道粘膜的損傷[15-17]，土茯苓、菝葜、藤梨根化濕解毒[18-20]，預(yù)知子疏肝理氣、和胃調(diào)中、活血化瘀、軟堅(jiān)散結(jié)、抑癌扶正[21]。健脾固腸方全方用藥平和，溫涼兼?zhèn)?、補(bǔ)瀉兼施，補(bǔ)以補(bǔ)氣健脾，瀉以化濕化瘀，補(bǔ)中有瀉，瀉中有補(bǔ)，調(diào)和陰陽。前期臨床研究已經(jīng)表明，健脾固腸方能夠通過抑制腸道粘膜通透性、腸道炎性反應(yīng)，達(dá)到保護(hù)腸道屏障、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫的功能，還能改善結(jié)腸癌引起的不適主訴，減少結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移或者復(fù)發(fā)的幾率，提高結(jié)腸癌患病后的長期生活質(zhì)量[4]。

通過Cytoscape 3.7.2軟件分析健脾固腸方藥物-活性化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，得到健脾固腸方8味中藥按網(wǎng)絡(luò)中心性高低排序依次為黃芪、黨參、白術(shù)、土茯苓、菝葜，基本符合君臣佐使的配伍原則，茯苓的網(wǎng)絡(luò)中心度結(jié)果與其作為臣藥的配伍規(guī)律不盡相符，可能需要今后進(jìn)一步試驗(yàn)研究加以明確。

通過Cytoscape 3.7.2軟件分析出健脾固腸方關(guān)聯(lián)性最高的活性化合物為棕櫚酸（palmitic acid，c175），可能是健脾固腸方治療結(jié)腸癌最重要的物質(zhì)基礎(chǔ)，主要來自黃芪、黨參、白術(shù)，表明黃芪、黨參、白術(shù)在該方中具有不可撼動(dòng)的地位。同時(shí)土茯苓、預(yù)知子、茯苓、菝葜、黨參、黃芪、白術(shù)7味中藥中均有棕櫚酸，探索有效成分可以為進(jìn)一步研究健脾固腸方的作用療效提供新的方法，并且為優(yōu)化方劑、開發(fā)新藥提供方向。

通過PPIN分析，健脾固腸方關(guān)鍵靶點(diǎn)51個(gè)，結(jié)腸癌關(guān)鍵靶點(diǎn)25個(gè)，健脾固腸方與結(jié)腸癌共同關(guān)鍵靶點(diǎn)4個(gè)，分別為TP53、TNF、AKT1、IL6，棕櫚酸對4個(gè)靶點(diǎn)均有作用。健脾固腸方活性化合物可能通過上調(diào)TP53表達(dá)，下調(diào)TNF、AKT1、IL-6表達(dá)達(dá)到治療結(jié)腸癌的作用。

本次研究以人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞為研究對象，采用CCK8法探討健脾固腸方含藥血清和有效單體棕櫚酸對SW480細(xì)胞的增殖作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了含藥血清和棕櫚酸在不同濃度下對人結(jié)腸癌細(xì)胞有增殖和抑制兩種相反作用，濃度決定了作用的傾向性。中藥中有效成分的濃度高低影響細(xì)胞生物學(xué)行為，如關(guān)于經(jīng)方血府逐瘀湯的研究表明，低濃度（<10%）含藥血清能促進(jìn)大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖和遷移、侵襲，反之高濃度（>10%）含藥血清則有抑制作用，其作用可能與上清液的NO含量水平有關(guān)[22]。健脾固腸方含藥血清也表現(xiàn)了相同的趨勢，在低濃度時(shí)有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖的作用，而在高濃度時(shí)具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用，可能與血清中的含藥成分濃度高低有關(guān)。而低濃度棕櫚酸對腫瘤有促進(jìn)作用，高濃度對腫瘤有抑制作用，與文獻(xiàn)查閱結(jié)果基本一致[23-26]。作用傾向取決于濃度的現(xiàn)象，可能提示了臨床上健脾固腸方宜濃煎服用。

由于健脾固腸方前身 “扶正健脾方” 能顯著抑制PI3K和AKT的表達(dá)，故此次選擇PI3K和AKT作為靶蛋白驗(yàn)證。在選擇抑制腫瘤細(xì)胞增殖的半抑制濃度后，發(fā)現(xiàn)含藥血清和棕櫚酸都降低SW480細(xì)胞中PI3K蛋白和AKT蛋白的磷酸化表達(dá)，結(jié)腸癌是一種由多因素導(dǎo)致、多基因參與、多階段發(fā)生的疾病，結(jié)腸腫瘤細(xì)胞的活動(dòng)與信號(hào)通路中蛋白質(zhì)異常磷酸化有關(guān)[27]。

在選擇抑制腫瘤細(xì)胞增殖的半抑制濃度后，發(fā)現(xiàn)空白血清、含藥血清及棕櫚酸均能升高SW480細(xì)胞中IL-6的濃度?？紤]原因可能是大鼠血清和人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞為異體血清，誘發(fā)了炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致IL-6濃度升高；含藥血清較空白血清能降低IL-6濃度，說明健脾固腸方可能通過下調(diào)IL-6濃度，抑制PI3KAKT信號(hào)通路，從而減少腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移與侵襲[28]；棕櫚酸較空白血清能升高IL-6濃度的原因尚不明確，初步考慮可能與高脂環(huán)境誘發(fā)細(xì)胞炎癥以及IL-6具有雙向調(diào)節(jié)作用有關(guān)[29]，今后將進(jìn)一步研究。此外，健脾固腸方中黨參、茯苓、白術(shù)、土茯苓、菝葜都對醇溶性浸出物有檢測要求，今后可進(jìn)一步行質(zhì)譜分析了解復(fù)方中棕櫚酸及其催化反應(yīng)中間產(chǎn)物、代謝產(chǎn)物的含量。