陳玉花 肖田梅 白梅榮 白迎春 包桂花

1.內(nèi)蒙古民族大學(xué)化學(xué)與材料學(xué)院，內(nèi)蒙古通遼 028007；2.內(nèi)蒙古民族大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院，內(nèi)蒙古通遼 028007

蜀葵花是蒙醫(yī)臨床常用于治療各種水腫的蒙藥材，為錦葵科蜀葵（Althaea rosea L.）Cavan.的干燥花，異名哈魯其其格、哈魯莫德格、炮扎木[1]。該藥味咸、甘，性寒；具有利尿，消腫，清腎和膀胱熱，固精，調(diào)經(jīng)等功效；主要用于水腫腎熱、膀胱熱、遺精、月經(jīng)不調(diào)等癥[2]。收載于《內(nèi)蒙古蒙藥材標(biāo)準(zhǔn)》（1987年版），據(jù)研究資料顯示，木犀草素、山奈素及槲皮素等黃酮類成分是蜀葵花發(fā)揮其利水作用的功效成分。但目前，對蜀葵花含量測定及鑒定研究報(bào)道較少見[3-4]，尤其未見采用脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）條形碼技術(shù)進(jìn)行鑒定的相關(guān)報(bào)道。DNA條形碼分子鑒定技術(shù)是利用一個(gè)或幾個(gè)標(biāo)準(zhǔn)DNA序列實(shí)現(xiàn)對物種的分類與鑒別[5-8]的近年來新興的技術(shù)。該方法由于其簡便、通用性高、穩(wěn)定性好、不受生長環(huán)境和生長發(fā)育階段的限制等特點(diǎn)被廣泛用于分子系統(tǒng)學(xué)和物種鑒定[9-12]、生物多樣性和生態(tài)學(xué)等研究，是傳統(tǒng)鑒定方法的有效補(bǔ)充[13]，這為錦葵科蜀葵植物的快速鑒定提供了可能。因此，本實(shí)驗(yàn)采用DNA條形碼分子鑒定技術(shù)對進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增并測定標(biāo)記（matK） 序列的同時(shí)應(yīng)用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）法測定蜀葵花功效組分槲皮素、木犀草素和山柰素的含量，以期為蜀葵花的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供依據(jù)。

1 儀器與材料

JY200C型電泳儀（北京六一生物科技有限公司，批號：DYCZ-24DN）、JY-SPC型電泳槽（北京六一生物科技有限公司，批號：DYCZ-24DN）、Multigene Gradient PCR儀（北京信眾和科技有限公司，批號：20162228）、QUANTUM凝膠成像系統(tǒng)（北京五洲東方科技發(fā)展有限公司，批號20162224）、SIGMA 3K15高速冷凍離心機(jī)（上海盧相儀離心機(jī)有限公司，批號：TGL-16M）、明澈-D超純水機(jī)（山東新瑞分析儀器有限公司，批號：RU1804133）、高效液相色譜儀（LC-20AT輸液泵，SPD-M20A檢測器，CBM-20A工作站，CTO-22A柱溫箱）（安捷倫科技有限公司，批號：G7129A）；離心柱型植物基因組DNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）、Taq Master Mix（Dye）（上海西雷生物科技有限公司，批號：20190228）、matK引物（北京天根生化科技有限公司，181019-004G10）、Trans5k DNA Marker（北京天根生化科技有限公司，20190228）、瓊脂糖（北京天根生化科技有限公司，批號：021-67285083）、EB（北京天根生化科技有限公司）槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品（批號：111541-201605）、木犀草素批號（批號：111520-200201）、山柰素標(biāo)準(zhǔn)品（批號：111520-200504）、其余試劑均為分析純；本實(shí)驗(yàn)所用11批蜀葵花均經(jīng)內(nèi)蒙古民族大學(xué)包桂花教授鑒定，見表1。

表1 蜀葵花采集分布

2 方法與結(jié)果

2.1 matK序列測定

2.1.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)文獻(xiàn)[5]選擇通用引物進(jìn)行matK序列擴(kuò)增，3F_KIM5'-CGTACAGTACTTTTGTGTTTACGAG-3；IR_KIM：5'-ACCCAGTCCATCTGGAAATCTTGGTTC-3'。委托上海生工生物工程有限公司進(jìn)行合成，PCR產(chǎn)物擴(kuò)增條帶明亮、清晰。

2.1.2 總DNA提取 取11批蜀葵花新鮮組織適量，加液氮充分研磨，迅速轉(zhuǎn)移到預(yù)先裝有700 μl 65℃預(yù)熱的緩沖液GP1的離心管中（試驗(yàn)前在預(yù)熱的GP1中加入0.1%β-巰基乙醇），在水浴加熱20 min，加入700 μl氯仿，充分混勻，12000 rpm離心5 min；將溶液轉(zhuǎn)入另一個(gè)離心管中，加入700 μl緩沖液GP2，充分混勻，混勻的液體轉(zhuǎn)入吸附柱CB3中，12000 rpm離心30 s，棄掉廢液，吸附柱CB3中加入500 μl緩沖液GD，12000 rpm離心30 s，倒掉廢液，把吸附柱CB3放入收集管中，加入600 μl漂洗液PW，12000 rpm 離心30 s，倒掉廢液（本步驟重復(fù)操作），吸附柱CB3放入收集管中，12000 rpm 離心2 min，棄去廢液后置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附柱材料中殘余的漂洗液，并且吸附柱CB3轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加100 μl洗脫緩沖液TE，室溫放置2 min，12000 rpm離心2 min，將溶液收集到離心管中備用[6]。

2.1.3 PCR擴(kuò)增及電泳檢測[7-8]PCR反應(yīng)體積為 50 μl，體系內(nèi)含樣品中總 DNA4 μl，2×Es Taq Master Mix（Dye）25 μl，ddH2O 17 μl，正反向引物各2 μl，PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為變性溫度94℃ 1 min，進(jìn)行35個(gè)次循環(huán)，94℃變性溫度30 s，退火溫度52℃、20 s，延伸溫度 72℃、50 s，最后再延伸 72℃、5 min。取5 μl反應(yīng)液經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，其PCR產(chǎn)物檢測結(jié)果見圖1。

圖1 PCR凝膠電泳圖

2.1.4 matK序列分析 matK 序列委托華大基因公司測序完成。所測得序列用CodonCode Aligner 17.0、DNDMAN和MEGA 7.0軟件進(jìn)行分析，結(jié)果見表2～3。

表2 蜀葵花matK序列堿基長度及G+C含量

2.2 功效組分含量測定[9-10]

2.2.1 色譜條件 Welchrom Column C18（4.6 mm×300 mm，5 μm）色譜柱，流動相為甲醇：0.1%磷酸溶液（55∶ 45），流速為 1.0 ml/min，柱溫為 35℃，檢測波長為365 nm，進(jìn)樣量10 μl。

2.2.2 對照品溶液的制備 由于蜀葵花的主要成分為槲皮素、木犀草素和山柰素，故對該藥材中的上述3個(gè)成分進(jìn)行HPLC含量測定，即精密稱取槲皮素、木犀草素和山柰素對照品適量，分別制成0.031 mg/ml、0.036 mg/ml、0.080 mg/ml的對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 對蜀葵花中的槲皮素、木犀草素和山柰素等黃酮類成分進(jìn)行含量測定，故取本品粉末約0.5 g，精密稱定，精密加入75%乙醇25 ml，鹽酸 5 ml，稱定重量，加熱回流 1.5 h，放冷，用75%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。對照品與供試品色譜圖分別見圖2。

圖2 HPLC色譜圖（橫坐標(biāo)為保留時(shí)間；縱坐標(biāo)為電壓）

2.2.4 考察線性關(guān)系 精密吸取對照品溶液2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0、17.5 μl注入液相色譜儀，測定峰面積。并以槲皮素（1）、木犀草素（2）、山柰素（3）的峰面積值（Y）分別對其相應(yīng)的進(jìn)樣量（X）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程依次為：

Y1=5583.7X1-19730，R1=0.9998；Y2=3657X2-20722，R2=0.9998；Y3=5539.6X3-156299，R3=0.9999。結(jié)果表明，槲皮素、木犀草素、山柰素分別在0.0775～0.5425 mg、0.090～ 0.630 mg、0.1000～ 0.7000 mg范圍內(nèi)，與其相應(yīng)的峰面積具有良好的線性關(guān)系。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.2.3”項(xiàng)下的供試品溶液10 μl，重復(fù)進(jìn)樣6次，結(jié)果槲皮素、木犀草素、山柰素的RSD依次為0.69%、1.02%、0.59%，表明精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取同一批樣品，按“2.2.3”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液6份，分別于0、2、4、6、8、10、12 h 注入液相色譜儀，結(jié)果槲皮素、木犀草素、山柰素的RSD依次為0.55%、0.71%、0.56%，結(jié)果表明供試品溶液在12 h內(nèi)測定穩(wěn)定性良好。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批樣品約0.5 g，照供試品溶液制備方法制得供試品溶液6份，分別精密吸取10 μl，注入液相色譜儀，結(jié)果RSD分別為槲皮素0.69%、木犀草素1.10%、山柰素的0.55%，表明該含量測定方法具有良好的重復(fù)性。

2.2.8 回收率試驗(yàn) 取已知含量的樣品約0.25 g，共6份，精密稱定，分別加入槲皮素、木犀草素、山柰素對照品溶液 0.41、0.25、0.52 mg，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測定并計(jì)算回收率，結(jié)果見表4。

表4 蜀葵花加樣回收率試驗(yàn)（n=6）

2.2.9 含量測定 分別取11批樣品約0.5 g，精密稱定，照供試品溶液制備方法制得供試品溶液。精密吸取供試品溶液10 μl，注入液相色譜儀，測定其峰面積值，計(jì)算槲皮素、木犀草素、山柰素的含量，結(jié)果見表5。

表3 蜀葵花matK序列遺傳距離（K2P）

表5 不同產(chǎn)地蜀葵花含量（n=6）

3 討論

DNA條形碼分子鑒定技術(shù)是對生物體內(nèi)能夠代表該物種的、標(biāo)準(zhǔn)的、有足夠變異的、易擴(kuò)增且相對較短的DNA片段[14-17]進(jìn)行的檢測方法。DNA條形碼已經(jīng)成為物種鑒定的重要工具。本實(shí)驗(yàn)成功擴(kuò)增并測定了11份蜀葵花matK序列，測序長度772 bp，G+C含量為25.91%～34.97%，遺傳距離為0.0000～0.0404，平均遺傳距離為0.0105，相似度為91%～99%。結(jié)果表明，不同地區(qū)蜀葵花matK序列具有一定的變異性，此變異可能與蜀葵花所含活性蛋白表達(dá)不同有關(guān)。該方法對不同地區(qū)蜀葵花具有較大的鑒定潛力。

通過本研究發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)蜀葵花中槲皮素平均含量0.2096～1.6591 mg/g，木犀草素平均含量0.1119～1.1623 mg/g，山柰素平均含量0.5333～2.8872 mg/g，提示不同地區(qū)對應(yīng)組分的含量差異較大。蜀葵花功效組分含量差異可能是由蜀葵花生長的土壤、陽光、水分、氣候等多種因素導(dǎo)致使不同地區(qū)蜀葵花新陳代謝發(fā)生變化，從而引起不同地區(qū)蜀葵花槲皮素、木犀草素及山奈素等功效組分含量變化?？梢姴煌貐^(qū)蜀葵花matK序列變異性與功效組分含量具有一定相關(guān)性，有必要進(jìn)一步深入研究其功效組分合成機(jī)制與原理[18-22]。