黃曉燕 丘早瑜 陳麗丹 李林海

世界衛(wèi)生組織(WHO)頒布的《院內(nèi)感染防治實(shí)用手冊》數(shù)據(jù)顯示60% 的細(xì)菌感染與使用醫(yī)療器械有關(guān)［1］,包括手術(shù)器材及植入材料。銀、銅具有抗菌作用早有報(bào)道,在醫(yī)用耗材中加入具有強(qiáng)烈抗菌功能的銀、銅金屬納米單質(zhì)或離子均可達(dá)抗菌目的［2,3］,但其具體作用及機(jī)制尚在探索階段,無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。本實(shí)驗(yàn)通過研究Ag+、Cu2+對臨床常見致病細(xì)菌［大腸埃希菌(escherichia coli,CRE)、肺炎克雷伯菌(carbapenemresistant klebsiella pneumoniae,CRKP)、銅綠假單胞菌(pseudomonas aeruginosa,PAE)、金黃色葡萄球菌(staphylococcus aureus,MASA)及糞腸球菌(enterococcus faecails,EFA)］的抗菌性能,為臨床使用和研發(fā)新型抗菌材料提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1Ag+、Cu2+溶液的配制 利用滅菌去離子水配制濃度均為 0.1 M 的硝酸銀(AgNO3)和氯化銅(CuCl2·2H2O)水溶液,用0.22 m 的濾菌器過濾后裝在無菌容器備用,其中硝酸銀的配制及保存需要避光操作。

1.1.2菌株

1.1.2.1臨床菌株 隨機(jī)選取本院檢驗(yàn)科微生物室分離的來源于傷口分泌物及組織的多重耐藥菌株飾物CRE、CRKP、PAE、MARA、EFA,所有菌株均采用法國梅里埃VITEK MS 全自動(dòng)快速微生物質(zhì)譜檢測儀進(jìn)行鑒定,菌株保存于-80℃冰箱。

1.1.2.2標(biāo)準(zhǔn) 菌株 CRE(ATCC25922)、CRKP(ATCC700603)、PAE(ATCC27853)、MARA(ATCC25923)、EFA(ATCC29212)干粉均購自廣東臨床檢驗(yàn)中心,溶解后轉(zhuǎn)種血平板備用。

1.1.2.3菌株貯存 將上述臨床菌株及標(biāo)準(zhǔn)菌株接種至血平板,35℃ CO2溫箱培養(yǎng)24 h 備用。

1.1.3陽離子調(diào)節(jié)肉湯(CAMHB) 的配制 稱取CAMHB 肉湯干粉22.0 g,加熱溶解于1000 ml 去離子水中,121℃高壓滅菌20 min 備用。

1.1.4無菌去離子水 取去離子水121℃高壓滅菌20 min 后備用。

1.2方法

1.2.1菌懸液的制備［4］取上述所有菌株的24 h 新鮮培養(yǎng)物接種至CAMHB 肉湯,35℃ CO2溫箱恒溫增菌6 h 后,用比濁儀配制成0.5 麥?zhǔn)蠁挝坏木鷳乙?相當(dāng)于108cfu/ml),再用無菌去離子水梯度稀釋為100 倍,使之成為106cfu/ml 的菌懸液,備用。

1.2.2梯度濃度Ag+、Cu2+溶液的配制 將0.1 M 的Ag+、Cu2+離子溶液梯度稀釋為10-2～10-8M 的溶液,備用。

1.2.3Ag+、Cu2+離子抑菌實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)孔：分別取100 μl 配制好的10-2～10-8M 濃度Ag+、Cu2+離子溶液置于96 孔板中,加入106cfu/ml 細(xì)菌懸液100 μl,振蕩混勻。以上步驟重復(fù)3 次作平行試驗(yàn),蓋好蓋板,置35℃CO2溫箱共同培養(yǎng) 6 h。對照孔：取100 μl 滅菌去離子水置于96 孔板中,加入106cfu/ml 細(xì)菌懸液100 μl,振蕩混勻。以上步驟重復(fù)3 次作平行試驗(yàn),蓋好蓋板,置35℃ CO2溫箱共同培養(yǎng)6 h。取出培養(yǎng)液,吹打混勻,每孔用無菌去離子水稀釋100 倍,各取100 μl 接種至血平板,置35℃ CO2溫箱培養(yǎng)24 h,記錄平板菌落數(shù)取平均值,計(jì)算殺菌率。殺菌率(%)=(Ncontrol-Nsample)/Ncontrol×100%。Ncontrol 為空白組菌落數(shù),Nsample為實(shí)驗(yàn)組菌落數(shù)。

1.3觀察指標(biāo)及判定標(biāo)準(zhǔn) 比較兩種離子對CRE、CRKP、PAE、MARA、EFA 及ATCC25922、ATCC700603、ATCC27853、ATCC25923、EFAATCC29212 的MBC。參照GB/T 2591 標(biāo)準(zhǔn),殺菌率≥99%可以報(bào)告有強(qiáng)抗菌作用；殺菌率≥90%可以報(bào)告有抗菌作用。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用軟件GraphPad Prism 7.04 對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和運(yùn)算。

2 結(jié)果

①當(dāng)Ag+濃度≥10-7M、Cu2+濃度≥10-5M 時(shí),對CRE 有殺菌作用；當(dāng)Ag+濃度≥10-6M、Cu2+濃度≥10-4M 時(shí),對ATCC25922 有殺菌作用。兩種離子對CRE 的MBC 均較ATCC25922 小。見圖A1,圖B1。

A1 Ag+ concentration

B1 Cu2+ concentration

②當(dāng)Ag+濃度≥10-7M、Cu2+濃度≥10-6M 時(shí),對CRKP 有殺菌作用；當(dāng)Ag+濃度≥10-7M、Cu2+濃度≥10-6M 時(shí),對ATCC700603 有殺菌作用。兩種離子對CRKP 的MBC 與ATCC700603 一致。見圖A2,圖B2。

A2 Ag+ concentration

B2 Cu2+ concentration

③當(dāng)Ag+濃 度≥10-6M、Cu2+濃 度≥10-5M 時(shí),對PAE 有殺菌作用；當(dāng)Ag+濃度≥10-7M、Cu2+濃度≥10-6M 時(shí),對ATCC27853 有殺菌作用。兩種離子對PAE 的MBC 均比ATCC27853 高。見圖A3,圖B3。

A3 Ag+ concentration

B3 Cu2+ concentration

④當(dāng)Ag+濃度≥10-7M、Cu2+濃度≥10-6M 時(shí),對有MASA 殺菌作用；當(dāng)Ag+濃度≥10-7M、Cu2+濃度≥10-6M 時(shí),對ATCC25923 有殺菌作用。兩種離子對MASA 的MBC 與ATCC25923 一致。見圖A4,圖B4。

A4 Ag+ concentration

B4 Cu2+ concentration

⑤當(dāng)Ag+濃 度≥10-5M、Cu2+濃 度≥10-5M 時(shí),對EFA 有殺菌作用；當(dāng)Ag+濃度≥10-6M、Cu2+濃度≥10-5M 時(shí),對ATCC29212 有殺菌作用。對于Ag+,EFA 的MBC 比ATCC25923 高,但對于Cu2+,兩種細(xì)菌的MBC 一致。見圖A5,圖B5。

A5 Agg++ concentration

B5 Cu2+ concentration

3 討論

通過實(shí)驗(yàn),可以觀察到臨床菌株與標(biāo)準(zhǔn)菌株的MBC 相同或者變化不大,均只需要較低的Ag+、Cu2+濃度,就可以達(dá)到卓越的抑菌效果,推測其殺菌能力與細(xì)菌的耐藥性相關(guān)性不大。在細(xì)菌感染耐藥率高居不下的現(xiàn)狀下,Ag+、Cu2+的研究前景是可觀的,有望為臨床新材料的開發(fā)帶來新的飛躍。同時(shí),Ag+、Cu2+對革蘭陰性桿菌的抑菌作用比革蘭陽性球菌強(qiáng),對PAE及EFA 的殺菌性能較差,分析可能與細(xì)菌的結(jié)構(gòu)及耐藥機(jī)制有關(guān)。在結(jié)構(gòu)上,由于革蘭陽性球菌的細(xì)胞壁比陰性桿菌厚,金屬離子不能輕易滲透到細(xì)胞內(nèi),故MBC 相對較大；其次,PAE 的耐藥機(jī)制中的細(xì)胞膜通透性改變(如孔蛋白減少、生物被膜的形成),可能減少離子的攝取和吸收,且具有主動(dòng)外排系統(tǒng)能把Ag+、Cu2+泵出菌體外而導(dǎo)致MBC 變大；而EFA 的MBC 增大原因主要為細(xì)胞壁滲透障礙導(dǎo)致Ag+、Cu2+難以進(jìn)入菌體,及質(zhì)粒介導(dǎo)的鈍化酶的產(chǎn)生有對Ag+、Cu2+的破壞和滅活的作用等,故抑菌效果相對弱。盡管如此,Ag+、Cu2+仍然對所有實(shí)驗(yàn)菌株具有高度敏感性。目前關(guān)于金屬離子的應(yīng)用大多是傷口外用敷料及皮膚表面的涂抹、噴灑消毒［5-7］,且其抑菌作用的研究大多數(shù)采用標(biāo)準(zhǔn)菌株,很少用臨床菌株,本文選用來源于傷口分泌物及組織的臨床菌株與標(biāo)準(zhǔn)菌株對比來研究Ag+、Cu2+的抑菌性能,更貼近臨床實(shí)際。

綜上所述,Ag+、Cu2+對臨床五種常見致病菌及標(biāo)準(zhǔn)菌株均有明顯抑菌作用,可作為除抗生素外的新型有效抗菌材料廣泛應(yīng)用于臨床。