賈哲 董海鵬 韓婷 徐文娟 李春帥 劉夢楠 林青華 趙崇軍 徐新房 李向日

檳榔是棕櫚科植物檳榔ArecacatechuL.的干燥成熟種子，始載于晉代李當之《藥錄》，在中國有一千多年的藥用歷史。功效為殺蟲，消積，行氣，利水，截瘧[1]。檳榔幼果為食用檳榔，皮殼一起嚼食，食用后讓人有醉酒的感覺，使兩頰發(fā)紅、心跳加快。機體出現(xiàn)以上反應與檳榔中的生物堿類成分有關。兩種檳榔各自所含的多種生物堿中，含量最高且起關鍵作用的都是檳榔堿(arecoline)[2-4]，且前期研究發(fā)現(xiàn)食用檳榔中的檳榔堿含量明顯低于藥用檳榔[5]，血清代謝組學發(fā)現(xiàn)藥用檳榔水煎液具有一定的心臟毒性[6-7]。檳榔堿可興奮M-膽堿受體，引起腺體分泌增加，也可興奮N-膽堿受體，表現(xiàn)為興奮骨骼肌、神經(jīng)節(jié)及頸動脈等，還具有增加腸蠕動，抑菌、驅(qū)蟲作用[8]。針對檳榔堿的毒性報道多集中在致口腔粘膜下纖維性變[9-13]、生殖系統(tǒng)[14-15]、神經(jīng)系統(tǒng)[16]、肝臟[17]和遺傳毒性[18]等方面，目前未見對其胚胎發(fā)育及心臟毒性的報道。檳榔堿性質(zhì)不穩(wěn)定，氫溴酸檳榔堿是其穩(wěn)定存在形式。

斑馬魚與人類具有87%的基因同源性，可被廣泛應用于模型構(gòu)建、藥物毒理學評價等[19]研究。其身體透明，具有可識別的肝臟、心臟等器官，常以有機整體參與實驗，可以直觀地從整體水平評價藥物的毒理作用[20]。發(fā)育中的幼魚組織快速的細胞分裂和分化，特別容易受到外界有毒物質(zhì)的侵害[21]。

因此本文以氫溴酸檳榔堿為研究對象，探討氫溴酸檳榔堿對斑馬魚的胚胎發(fā)育毒性和心臟毒性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

AB系野生型斑馬魚購置于中國科學院水生生物研究所，養(yǎng)殖于集中式斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)(水溫28.5℃、光照周期為14小時光照/10小時黑暗)，每日喂食3次活體豐年蝦。暗周期開始前選擇健康的成年斑馬魚按雌雄比1∶2放入產(chǎn)卵缸內(nèi)，中間放置隔板，于第二天光周期開始后抽去隔板，半小時后收集魚卵于干凈的培養(yǎng)皿中，胚胎培養(yǎng)液沖洗3遍，在顯微鏡下挑選受精后6小時且發(fā)育正常的胚胎，一部分作為胚胎發(fā)育毒性的研究對象；一部分重新放入新的含胚胎培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，28.5℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，相同光照條件下發(fā)育至受精后4天，于受精后3天在體式顯微鏡下挑選出健康的斑馬魚幼魚，作為心臟毒性的研究對象。

1.2 試劑與儀器

氫溴酸檳榔堿標準品(上海詩丹德生物技術有限公司，批號：1344/18868，含量> 99.0%)。NaCl，KCl，Na2HPO4，K2HPO4，MgSO4，CaCl2，NaHCO3，甲基纖維素均為分析純，購置于北京化工廠。

體視顯微鏡(Stemi508，卡爾·蔡司股份公司)；TE-2000-S光學倒置顯微鏡(NIKON)；斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)(北京愛生生物科技有限公司)；細胞移液器(10 μL、200 μL、1 mL和5 mL，Eppendorf)；電子分析天平(METTLER TOLEDO)；斑馬魚心跳血流觀測軟件(MicroZebralab, Viewpoint)；Image J V1.8.0軟件(National Institutes of Health)。

1.3 樣品制備

斑馬魚胚胎培養(yǎng)液：按照Zebrafish Book標準配制NaCl 0.137 mol/L，KCl 5.4 mol/L，Na2HPO40.25 mol/L，K2HPO40.44 mol/L，CaCl21.3 mol/L，MgSO41.0 mol/L，NaHCO34.2 mol/L的水溶液。

氫溴酸檳榔堿儲備液：精密稱取25 mg，置于50 mL容量瓶中，加斑馬魚胚胎培養(yǎng)液至刻度，搖勻，即得儲備液500 μg/mL。

3%甲基纖維素固定液：將400 mL斑馬魚胚胎培養(yǎng)液置于燒杯中，水浴加熱到70℃，邊攪拌邊加入12 g甲基纖維素，逐漸形成一種淤漿，攪拌后將該淤漿置于冰箱冷卻過夜，即得。

1.4 氫溴酸檳榔堿對胚胎發(fā)育的毒性研究

1.4.1 藥物暴露 將已挑選好的受精后4小時的健康胚胎(透明狀受精卵)隨機轉(zhuǎn)移進含有不同濃度(200、300、400、500 μg/mL)氫溴酸檳榔堿的12孔板中，每孔20個胚胎，每組設置4孔重復。28.5℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔24小時更換氫溴酸檳榔堿樣品溶液1次并移除死亡的胚胎，以保證溶液中各參數(shù)穩(wěn)定。取不同親本的胚胎重復實驗3次。

1.4.2 氫溴酸檳榔堿對不同發(fā)育階段斑馬魚胚胎發(fā)育表型影響的觀測 以培養(yǎng)液中發(fā)育的胚胎為對照組，通過倒置光學顯微鏡于受精后24、48和72小時的時間點觀察藥物暴露后胚胎的發(fā)育情況與形態(tài)變化，并拍照記錄。胚胎的發(fā)育情況與形態(tài)變化主要關注各時間點魚體長度、畸形情況和各臟器是否異常及隨暴露時間的延長以上各指標的變化。

1.4.3 受精后24小時斑馬魚胚胎自主抽動的測定 記錄受精后24小時每個濃度下1分鐘內(nèi)胚胎的自主抽動次數(shù)，每個孔取15枚胚胎進行統(tǒng)計。

1.4.4 受精后48小時斑馬魚胚胎心率的測定 記錄受精后48小時每個濃度下胚胎10秒內(nèi)心臟跳動次數(shù)，每個孔取15枚胚胎進行統(tǒng)計。

1.4.5 受精后48、72小時斑馬魚胚胎孵化率的測定 統(tǒng)計不同濃度氫溴酸檳榔堿暴露組中斑馬魚胚胎的孵化率(孵化率=已孵化胚胎/總胚胎個數(shù)×100%)。由于胚胎在受精后48小時開始孵化，直到受精后96小時完成孵化，因此，分別選擇受精后48和72小時統(tǒng)計胚胎的孵化率。

1.5 氫溴酸檳榔堿對心臟的毒性研究

1.5.1 藥物暴露 隨機選取受精后4天的斑馬魚幼魚于12孔板中，分別暴露于不同濃度(25、50、100 μg/mL)的氫溴酸檳榔堿中24小時，每孔20尾，每組設置4孔重復。同時，以正常的斑馬魚胚胎培養(yǎng)液為對照組。整個暴露過程在28.5℃恒溫培養(yǎng)箱中進行，且整個實驗重復3次。

1.5.2 心率、血流指標評價 計算斑馬魚幼魚心率前，將斑馬魚幼魚從培養(yǎng)箱中取出放置在室溫下30分鐘以適應環(huán)境溫度。不同濃度藥物暴露組和對照組中每孔隨機選擇15只斑馬魚幼魚，將其固定于3%甲基纖維素中。用發(fā)針調(diào)整斑馬魚的體位，使其兩眼盡量重合，頭部與尾部保持在同一水平面上。在體視顯微鏡下，找到斑馬魚的心臟，在心臟跳動清晰可見時，計數(shù)每分鐘的心跳次數(shù)，每只斑馬魚計數(shù)3次。同時，在斑馬魚心跳血流觀測軟件上截取水平且圖象清晰的血管區(qū)域，設置60秒錄制時間，通過計算該設定時間內(nèi)的像素變化，計算血流量及血流速。

1.5.3 表型分析評價 不同濃度藥物暴露組和對照組中每孔隨機選擇15只斑馬魚幼魚，將其固定于3%甲基纖維素中。用發(fā)針調(diào)整斑馬魚的體位，使其兩眼盡量重合，頭部與尾部保持在同一水平面上。在顯微鏡下觀察并拍照，用Image J V1.8.0軟件測算各組斑馬魚靜脈竇(sinus venosus，SV)-動脈球(bulbus arteriosus，BA)即SV-BA間距，每只斑馬魚重復測量3次。

1.5.4 病理組織學評價 在實驗暴露終點，使用斑馬魚胚胎培養(yǎng)液將不同濃度氫溴酸檳榔堿暴露組中的斑馬魚幼魚沖洗三次，轉(zhuǎn)移到干凈的含4%多聚甲醛的1.5 mL離心管中，室溫保存。在乙醇中逐步脫水，石蠟包埋，切成4～5 μm的薄片后進行HE染色，在顯微鏡下觀察以確認不同濃度氫溴酸檳榔堿暴露處理對斑馬魚心臟組織病理學的改變。

1.6 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果

2.1 氫溴酸檳榔堿對胚胎發(fā)育的毒性研究

2.1.1 氫溴酸檳榔堿對不同發(fā)育階段斑馬魚胚胎發(fā)育表型的影響 與對照組胚胎比較，不同濃度氫溴酸檳榔堿暴露組的受精后24小時的胚胎未見明顯異常；受精后48小時的幼魚均見魚體短小，心囊水腫，心包出血，卵黃囊水腫，脊柱彎曲，尾巴變形，眼部及魚體黑色素沉積減少，同時均存在不出膜的情況，且給藥濃度越高，表現(xiàn)越顯著；受精后72小時均見魚體短小，明顯心囊及卵黃囊水腫，脊柱彎曲，尾部畸變，眼部黑色素沉積減少，且給藥濃度越高，毒性表現(xiàn)越顯著，同時均存在幼魚游泳緩慢的情況。見圖1。

注：紅色箭頭表示心囊水腫；白色箭頭表示卵黃囊水腫；黑色箭頭表示脊柱彎曲；白色虛線區(qū)域表示尾部畸變。圖1 對照組和氫溴酸檳榔堿不同濃度組斑馬魚幼魚在不同時間點的發(fā)育形態(tài)(×40)

2.1.2 受精后24小時斑馬魚胚胎自主抽動的測定 由表1可知，不同濃度氫溴酸檳榔堿暴露組與對照組之間具有顯著的統(tǒng)計學差異(P<0.01)。隨著氫溴酸檳榔堿濃度的升高，斑馬魚胚胎自主抽動次數(shù)增加，呈濃度依賴性。

表1 氫溴酸檳榔堿對受精后24小時的斑馬魚胚胎自主抽動次數(shù)的影響

2.1.3 受精后48小時斑馬魚胚胎心率的測定 由表2可知，除200 μg/mL濃度組之外，其他濃度氫溴酸檳榔堿暴露組均與對照組之間具有顯著的統(tǒng)計學差異(P<0.01)。隨著氫溴酸檳榔堿濃度的升高，斑馬魚胚胎心率減緩，呈濃度依賴性。

表2 氫溴酸檳榔堿對受精后48小時的斑馬魚胚胎心臟跳動次數(shù)的影響

2.1.4 受精后48、72小時斑馬魚胚胎孵化率的測定 由表3可知，對于受精后48和72小時斑馬魚胚胎的孵化率，不同濃度氫溴酸檳榔堿暴露組與對照組之間具有顯著性差異(P<0.01)。隨著氫溴酸檳榔堿濃度的升高，受精后48和72小時的斑馬魚胚胎孵化率均降低，且呈濃度依賴性。

表3 氫溴酸檳榔堿對受精后48和72小時的斑馬魚胚胎孵化率的影響

2.2 氫溴酸檳榔堿對心臟的毒性研究

2.2.1 心率、血流指標評價 由表4可知，與對照組比較，100 μg/mL濃度組的斑馬魚心率、血流量和平均血流速三項指標均有顯著性差異(P<0.05)。其他濃度暴露組的心率呈現(xiàn)增加的趨勢，血流量和平均血流速呈現(xiàn)減少的趨勢，且均呈濃度依賴性。見表4。

表4 氫溴酸檳榔堿各濃度組的斑馬魚幼魚心率、血流量和平均血流速(n=4)

2.2.2 表型分析評價 與對照組相比，50 μg/mL濃度組出現(xiàn)尾巴彎曲，心臟部位未見明顯異常；100 μg/mL濃度組出現(xiàn)明顯的體長縮短，心囊水腫，卵黃囊水腫等現(xiàn)象。見圖2。

藥物暴露24小時后各組斑馬魚幼魚的SV-BA間距見表5。由表5可知， 與對照組比較， 25 μg/mL濃度組的斑馬魚SV-BA間距無顯著性差異(P>0.05)；50和100 μg/mL濃度組有顯著性差異。組間數(shù)據(jù)差異隨著氫溴酸檳榔堿暴露濃度的增加而增加。

表5 氫溴酸檳榔堿各濃度組的斑馬魚SV-BA距離

2.2.3 病理組織學評價 通過光學顯微鏡拍照發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，50、100 μg/mL濃度組的斑馬魚心臟結(jié)構(gòu)改變，形成細小型的管狀心臟，心房心室管腔面積明顯縮小，心肌壁變薄、心肌細胞數(shù)量減少。見圖3。

注：黑色箭頭表示心囊水腫；白色虛線區(qū)域表示尾部畸變；紅色雙向箭頭表示SV-BA距離。圖2 對照組和氫溴酸檳榔堿不同濃度組斑馬魚幼魚的表型觀察(×40, ×100)

注：紅色箭頭表示心臟區(qū)域；紅色實線區(qū)域表示心房心室管腔面積。圖3 氫溴酸檳榔堿各濃度給藥組的斑馬魚心臟組織病理切片(×100, ×400)

3 討論

受精后24小時為斑馬魚發(fā)育過程中的咽囊期，該時期主要特點為：視網(wǎng)膜和皮膚早期色素沉著，中鰭折疊，卵黃血紅細胞出現(xiàn)，心臟開始搏動[22]。與對照組比較，不同濃度氫溴酸檳榔堿暴露的受精后24小時胚胎未見明顯異常，分析原因可能是卵膜能夠阻止一部分化合物與胚胎接觸，對胚胎具有一定的保護作用。胚胎發(fā)育至受精后24小時尾部表現(xiàn)出強烈的抽動。自主抽動是斑馬魚運動神經(jīng)系統(tǒng)未發(fā)育完全的表現(xiàn)，不受機體控制，由其運動神經(jīng)元調(diào)控，隨著發(fā)育過程中神經(jīng)系統(tǒng)的完善而逐漸減弱。氫溴酸檳榔堿雖未對胚胎的形態(tài)發(fā)育造成影響，但在某種程度上能夠影響胚胎的運動系統(tǒng)或者神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育，使得氫溴酸檳榔堿各濃度暴露組的胚胎活動遠強于對照組。

受精后48小時為斑馬魚發(fā)育過程中的孵化期(長胸鰭)，該時期主要特點為：出膜成為幼魚，開始長胸鰭，背上位靜息，卵黃變細，視網(wǎng)膜上虹膜色素細胞豐富，頭部顯著黃色[22]。與對照組比較，不同濃度氫溴酸檳榔堿暴露的受精后48小時的斑馬魚幼魚的形態(tài)發(fā)育過程出現(xiàn)較為明顯的毒性反應，且呈濃度依賴性。斑馬魚胚胎在受精后48小時心臟已基本發(fā)育完全，即出現(xiàn)規(guī)律的心跳，此后心率基本趨于穩(wěn)定，因此心率為胚胎毒性測試實驗中一個非常重要的亞致死毒理學指標。結(jié)果表明氫溴酸檳榔堿導致斑馬魚胚胎心率明顯降低，且呈劑量—毒性效應關系；受精后48小時胚胎進入孵化期，此時的孵化率結(jié)果發(fā)現(xiàn)氫溴酸檳榔堿可干擾胚胎的正常孵化。

受精后72小時為斑馬魚發(fā)育過程中的孵化期(突口)，該時期主要特點為：寬口突出于眼前方，虹膜色素細胞出現(xiàn)于卵黃帶且覆蓋眼部一半，背部黃色與頭部色調(diào)一致[22]。不同濃度氫溴酸檳榔堿暴露的受精后72小時的斑馬魚幼魚的形態(tài)發(fā)育過程出現(xiàn)明顯的毒性反應，且呈濃度依賴性。受精后72小時大部分胚胎孵化完全，此時的孵化率結(jié)果表明氫溴酸檳榔堿會干擾胚胎的正常孵化，且濃度越高，孵化率下降越明顯，出膜時間延遲，發(fā)育停滯，并出現(xiàn)多種嚴重的畸形。胚胎孵化過程需要消化絨毛膜的酶和機械力的共同作用。脊柱彎曲主要由于肌肉組織損壞，包括肌肉細胞壞死以及肌纖維受損，還與鈣離子通道紊亂、脊柱骨原件自身發(fā)生畸形有關。氫溴酸檳榔堿對中樞神經(jīng)存在擬膽堿作用，抑制乙酰膽堿介導的效應，如抑制骨骼肌收縮等作用機制可能是孵化率降低和魚體畸形的主要原因。

心臟是胚胎發(fā)育過程中最早發(fā)生并發(fā)揮功能的器官，心率是心臟功能正常與否最直觀的反映。正常斑馬魚幼魚的心率一般在120次/分鐘左右，本研究中對照組幼魚的心率為120.60±1.38次/分鐘，因此可排除試驗中外界環(huán)境和遺傳因素對斑馬魚心率的影響。與對照組比較，氫溴酸檳榔堿可明顯提高幼魚的心率。血流量也是毒理研究領域中的一個非常有價值的參數(shù)。某些心臟問題由于病因的不同，是無法通過心率來測定的，需要通過血流量或血流速檢測才能確定。與對照組比較，氫溴酸檳榔堿可使幼魚的血流量和平均血流速呈現(xiàn)下降的趨勢。由于斑馬魚透明，通過顯微鏡可以清晰觀察斑馬魚心臟形態(tài)，斑馬魚心臟的發(fā)育基本在受精后48小時之內(nèi)完成。受精后30小時已經(jīng)形成具有完全功能的心室和心房，受精后36小時心臟發(fā)生環(huán)化，環(huán)化的結(jié)果是心房和心室有部分的重疊，心室在心房的右前側(cè)。靜脈竇(血液進入斑馬魚心房，SV)和動脈球(血液流出斑馬魚心室，BV)之間的距離將會發(fā)生改變。兩者之間的大小即SV-BA間距，是評價心臟環(huán)化是否正常的指標之一，測量靜脈竇和動脈球的間距可用來量化藥物對斑馬魚心臟毒性影響的程度[23]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，氫溴酸檳榔堿可以引起斑馬魚心臟結(jié)構(gòu)的變化，同時改變斑馬魚幼魚的SV-BA間距，具有心臟毒性。

綜上所述，氫溴酸檳榔堿對斑馬魚胚胎發(fā)育過程及心臟具有毒性作用，為綜合評價檳榔的毒性提供了研究思路，但其更為深入的毒性機制還有待于進一步研究與實踐，以期提高檳榔臨床使用和日常食用的安全性。