徐坡 謝靖 彭媛 陸士奇

膿毒癥是嚴(yán)重創(chuàng)傷、重癥感染等多種危重疾病應(yīng)激狀態(tài)下的常見(jiàn)并發(fā)癥，具有高發(fā)病率，高死亡率的特點(diǎn)，其高死亡率與它易致多臟器功能損傷直接相關(guān)。40%～50%的膿毒癥可導(dǎo)致心功能不全[1]，心肌細(xì)胞損傷是膿毒癥心功能不全發(fā)生的主要原因，細(xì)胞凋亡在膿毒癥的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，早在2008年Flierl MR等[2]的研究就證明抗凋亡治療有逆轉(zhuǎn)膿毒癥心肌損傷的作用。本研究通過(guò)觀察參附注射液對(duì)膿毒癥小鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)、心肌線粒體超微結(jié)構(gòu)及心肌組織B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2基因(B-cell lymPhoma-2，Bcl-2)、BH3介導(dǎo)的死亡域激動(dòng)劑(BH3 interacting-domain death agonist，Bid)、截短型Bid(truncated Bid，tBid)、半胱胺酸-天門冬胺酸酶(cysteine-dePendent asPartate-sPecifc Proteases-9，Caspase-9)蛋白表達(dá)的影響，從線粒體凋亡通路探討參附注射液對(duì)膿毒癥小鼠心肌線粒體損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

選取56只5～6周齡SPF級(jí)雄性C57/B6J小鼠[由常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK(蘇)2016-0010。動(dòng)物合格證編號(hào)：201915419]，動(dòng)物飼養(yǎng)在蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，溫度22～24℃、相對(duì)濕度為40%～70%的SPF環(huán)境中，自由進(jìn)食和飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 分組與造模

56只雄性C57/B6J小鼠被隨機(jī)分為4組，具體分組如下：正常對(duì)照組9只(NC組，不做任何處理)；假膿毒癥組9只(Sham組，腹腔注射溶媒)；脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)腹腔注射誘導(dǎo)膿毒癥模型組12只(LPS組)；LPS造模+參附注射液腹腔注射組(SFI組)26只。造模予LPS(sigma L2880)按8 mg/kg單次腹腔注射LPS溶液；SFI組在造模前24小時(shí)、12小時(shí)、6小時(shí)分別腹腔注射參附注射液(雅安三九藥業(yè)有限公司，劑量按10.0 mL/kg進(jìn)行)。除NC組外，另外3組別動(dòng)物，每組分別于造模后6小時(shí)，12小時(shí)各處死3只，剩余動(dòng)物和全部對(duì)照組動(dòng)物，于實(shí)驗(yàn)24小時(shí)全部統(tǒng)一處死取材，并按要求保存。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均得到蘇州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)協(xié)會(huì)批準(zhǔn)。

1.3 電鏡觀察小鼠心肌超微結(jié)構(gòu)

選用儀器：透射電鏡(日本電子JEM1400型)；超薄切片機(jī)(leica UC-7)；數(shù)碼相機(jī)(EMSIS，morada G3)。取1 cm3心肌組織若干塊，于戊二醛中固定(2.5%)，倒掉固定液入PBS緩沖液，1%鋨酸后固定2小時(shí)，乙醇梯濃度脫水(30%、50%、70%、80%、95%、100%)，環(huán)氧丙烷和環(huán)氧樹(shù)脂1∶1浸透，純環(huán)氧樹(shù)脂包埋入烤箱，超薄切片(70 nm)，鉛鈾染色。JEM1400型透射電鏡(日本)觀察心肌超微結(jié)構(gòu)，數(shù)碼相機(jī)(EMSIS，morada G3)拍照。

1.4 蘇木精—伊紅染色

心肌組織樣本放置于4%甲醛中固定，梯度乙醇脫水，二甲苯2次透明，浸蠟，石蠟包埋切片，厚度在4 μm；鋪片，烤片，脫蠟，蘇木精浸染，沖洗，0.5%氨水返藍(lán)，伊紅染色，沖洗，脫蠟，封片，晾干。于顯微鏡下觀察不同視野病理切片狀態(tài)，不同倍數(shù)下拍照，分析病理結(jié)果。

1.5 TUNEL 法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡

取石蠟包埋的心肌組織4 μm切片，以TUNEL法按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行心肌組織切片細(xì)胞凋亡檢測(cè)。具體方法如下：先將硬石蠟包埋的切片進(jìn)行二甲苯脫蠟，逐級(jí)乙醇脫水。用PBS潤(rùn)洗樣本3次，滴加100 μL 1×Equilibration Buffer，室溫孵育30分鐘。解凍FITC-12-dUTP Labeling Mix，加入緩沖液；37℃孵育60分鐘，避免光照；移除封口膜，切片置于PBS溶液中室溫孵育5分鐘；重復(fù)該步驟1次；染色,洗滌樣本，室溫放置5分鐘，重復(fù)兩次，在熒光顯微鏡(OLYMPUS IX53)下分析樣本(×100)，選擇有意義的組織，經(jīng)登錄、編號(hào)、采集、分析、讀取數(shù)據(jù)。

1.6 蛋白質(zhì)免疫印跡法

將研碎的心肌組織加入細(xì)胞裂解液，低溫勻漿，離心，應(yīng)用SDS-PAGE進(jìn)行蛋白分離，30%丙烯酰胺凝膠中電泳，CD63、CD81-200 mA、70分鐘條件下電轉(zhuǎn)膜，TBST封閉液浸泡PVDF膜于Bcl-2、Bid、tBid一抗中(稀釋比例分別為1∶1000、1∶1000、1∶2000)，4℃孵育過(guò)夜。再加入HRP標(biāo)記二抗(稀釋比例為1∶50000)，進(jìn)行免疫反應(yīng)，ECL顯色系統(tǒng)顯色，保存結(jié)果圖片，用Image J圖像分析軟件分析膠片灰度值。以上小鼠心肌病理?yè)p傷檢測(cè)每組均選取3只小鼠的心肌組織進(jìn)行。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠膿毒癥心肌損傷模型鑒定

通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)及天津市心血管中心發(fā)表的膿毒癥心肌損傷小鼠模型建立和評(píng)價(jià)[3]證實(shí)建模方法可靠，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示膿毒癥小鼠心肌組織在光鏡和電鏡下均可見(jiàn)心肌小血管周圍大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，心肌肌絲紊亂，細(xì)胞間質(zhì)水腫等表現(xiàn)。

2.2 透射電鏡下各組小鼠心肌超微結(jié)構(gòu)改變情況

電鏡顯示，對(duì)照組心肌肌絲排列規(guī)則、整齊，粗細(xì)相見(jiàn)，各條帶均較清楚，肌節(jié)結(jié)構(gòu)正常，線粒體豐富，分布在肌絲之間，大小正常，形狀多為圓形和橢圓形，線粒體的嵴很密集，平行排列，基質(zhì)內(nèi)有較多致密的基質(zhì)顆粒。Sham組與對(duì)照組相比無(wú)明顯區(qū)別，膿毒癥小鼠心肌肌絲紊亂，線粒體腫脹明顯，部分出現(xiàn)“空泡樣變”、邊界不清晰、基質(zhì)密度降低、不均勻等。造模后12小時(shí)LPS模型組小鼠線粒體改變最嚴(yán)重，線粒體平均面積和體密度明顯增大，和Sham組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。經(jīng)過(guò)參附注射液處理小鼠心肌線粒體有明顯緩解情況，空泡樣變明顯減少，線粒體腫脹有所緩解，參附組較Sham組相比線粒體立體計(jì)量指標(biāo)均有明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳情見(jiàn)圖1及表1。

表1 各組別線粒體立體計(jì)量比較

注：A：正常對(duì)照組；B：Sham組；C組：LPS組；D組：SFI組；阿拉伯?dāng)?shù)字1、2、3分別對(duì)應(yīng)相應(yīng)組別的6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)。A組為正常對(duì)照組，只選取24小時(shí)進(jìn)行心肌切片，故只有1張圖片圖1 電鏡下各組小鼠心肌超微結(jié)構(gòu)影響(1 μm)

2.3 光鏡下各組小鼠心肌細(xì)胞凋亡情況

HE染色結(jié)果：與正常對(duì)照組相比，Sham組心肌結(jié)構(gòu)大致正常，LPS組心肌組織可見(jiàn)結(jié)構(gòu)破壞、纖維不完整、肌質(zhì)溶解、局部心肌壞死，間質(zhì)水腫以及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，心肌細(xì)胞空泡樣變；SFI組心肌結(jié)構(gòu)基本完整，心肌纖維斷裂減少，間質(zhì)水腫明顯好轉(zhuǎn)，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯改善，病理?yè)p害明顯減輕。詳細(xì)情況詳見(jiàn)圖2。

注：A：正常對(duì)照組；B：假膿毒癥組(Sham)；C：膿毒癥模型組(LPS)；D：參附組(SFI)圖2 各組小鼠心肌細(xì)胞HE染色(×100)

TUNEL染色結(jié)果：TUNEL檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡，正常細(xì)胞核呈淡藍(lán)色，形態(tài)清晰、完整。凋亡細(xì)胞核呈熒光色，研究顯示，與正常對(duì)照組相比，Sham組心肌組織凋亡無(wú)明顯變化，LPS組、SFI組小鼠心肌細(xì)胞 TUNEL 凋亡率均高于Sham組(P<0.05)，但SFI組較LPS組凋亡率明顯下降(P<0.05)。詳細(xì)情況詳見(jiàn)圖3。

2.4 各組小鼠心肌組織Bcl-2、Bid、tBid、Caspase-9表達(dá)水平變化

與對(duì)照組比較，造模后12小時(shí)LPS組小鼠心肌Bcl-2表達(dá)明顯抑制(P<0.05)，Bid、tBid、Caspase-9表達(dá)上調(diào)明顯(P<0.05)；SFI組小鼠心肌Bcl-2表達(dá)較LPS組明顯增強(qiáng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),同時(shí)SFI組Bid、tBid、Caspase-9表達(dá)較LPS組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。具體見(jiàn)圖4及表3。

表2 各組小鼠心肌細(xì)胞凋亡率的比較

表3 各組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)心肌組織Bcl-2、Bid、tBid、Caspase-9灰度值比較

圖4 各組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)心肌組織Bcl-2、Bid、tBid、Caspase-9蛋白表達(dá)

注：A：正常對(duì)照組；B：假膿毒癥組(Sham)；C：膿毒癥模型組(LPS)；D：參附組(SFI)圖3 各組小鼠心肌細(xì)胞TUNEL檢測(cè)及凋亡率比較(×100)

3 討論

膿毒癥，是宿主對(duì)感染產(chǎn)生的失控反應(yīng)，并出現(xiàn)危及生命的器官功能障礙。心臟是膿毒癥損傷中最為重要的靶器官。研究指出20%～60%的膿毒癥可發(fā)生心肌抑制[1]，膿毒癥誘導(dǎo)的心肌功能障礙(sepsis induced myocardial dysfunction，SIMD)死亡率更是高達(dá)50%～70%，心功能對(duì)膿毒癥患者的預(yù)后判斷起關(guān)鍵作用。目前關(guān)于膿毒癥心肌損傷的機(jī)制研究方向繁多，歸根結(jié)底，不同機(jī)制最終都會(huì)導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡，這是膿毒癥心肌損傷的關(guān)鍵原因。

Bcl-2家族包括多結(jié)構(gòu)域抗凋亡蛋白(BH1-BH4)，多結(jié)構(gòu)域促凋亡蛋白(BH1-BH3)和促凋亡BH3-only蛋白三大類。促凋亡成員和抗凋亡成員之間的相互平衡被破壞導(dǎo)致了凋亡的發(fā)生。當(dāng)抗凋亡蛋白占優(yōu)勢(shì)時(shí)，便可調(diào)節(jié)線粒體膜通透性，抑制凋亡發(fā)生。Bcl-2是其家族中最重要的抗凋亡蛋白，孫彬栩等[4]以及Zhang N等[5]的研究指出，Bcl-2可通過(guò)編碼自身蛋白而具有抗心肌細(xì)胞凋亡的功能。Bid是只含有BH3結(jié)構(gòu)域的促凋亡蛋白，它能裂解形成tBid，激活Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，引發(fā)細(xì)胞凋亡[6]。羅敏等[7]研究中，右美托咪定預(yù)處理的方式可促使心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌組織中Bcl-2蛋白過(guò)表達(dá)，誘導(dǎo)Bax蛋白表達(dá)下降，最終有助于改善大鼠心肌缺血再灌注損傷。而陳華文等[8]對(duì)膿毒癥大鼠應(yīng)用丹參酮ⅡA，發(fā)現(xiàn)膿毒癥大鼠心肌細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)會(huì)上調(diào)，心肌細(xì)胞凋亡則會(huì)相應(yīng)減少。本研究表明，小鼠注射LPS后通過(guò)促凋亡蛋白(Bad、t-Bid)激活細(xì)胞凋亡(Caspase-9)，同時(shí)減少抗凋亡蛋白Bcl-2，增加TUNEL凋亡細(xì)胞數(shù)，這些結(jié)果與之前報(bào)道一致。

參附注射液是一個(gè)由紅參、附片提取制成，被廣泛用于休克、心跳呼吸驟停、心力衰竭等急危重癥的中藥注射劑[9-11]，并且因?yàn)榇罅康难C醫(yī)學(xué)證據(jù)，被眾多國(guó)內(nèi)急危重癥治療指南[12-13]收錄。參附注射液的藥理成分主要是人參皂苷[14]。研究證實(shí)參附注射液給藥劑量與體內(nèi)暴露量呈線性關(guān)系，多次給藥不影響藥物體內(nèi)代謝、無(wú)蓄積[15]。其作用包含了改善循環(huán)、干預(yù)血流動(dòng)力學(xué)、保護(hù)臟器細(xì)胞、減輕炎癥反應(yīng)、抗氧化應(yīng)激、增強(qiáng)免疫、減輕腫瘤藥物化療的外周毒性作用等方面。本研究應(yīng)用參附注射液可減輕膿毒癥小鼠的心肌損傷，開(kāi)拓了參附注射液的應(yīng)用范圍。本研究清楚地表明，與LPS組比較，SFI組小鼠心肌 Bcl-2 表達(dá)明顯上調(diào)，同時(shí)SFI組Bid、tBid、Caspace9表達(dá)較LPS組明顯降低(P<0.01)。Bcl-2水平的升高反映了線粒體對(duì)凋亡的易感性下降，且SFI組小鼠Bcl-2/Bid以及Bcl-2/tBid較LPS組明顯升高，說(shuō)明參附注射液可以使Bcl-2的抗凋亡作用在細(xì)胞內(nèi)占優(yōu)勢(shì)。故參附注射液可以通過(guò)上調(diào)心肌細(xì)胞 Bcl-2 表達(dá)，下調(diào)Bid表達(dá)，抑制tBid活化，抑制Caspase-9釋放，減少膿毒癥小鼠心肌線粒體凋亡，反映SFI對(duì)線粒體凋亡的保護(hù)作用。此外，通過(guò)電鏡還觀察到脂多糖誘導(dǎo)的線粒體腫脹被SFI減輕，線粒體平均面積以及線粒體體密度均明顯下降，支持了SFI對(duì)線粒體凋亡的作用。

綜上，SFI可通過(guò)增加Bcl-2的表達(dá)，降低Bid、t-Bid的表達(dá)，改善LPS誘導(dǎo)的線粒體形態(tài)，保護(hù)線粒體的完整性，阻止caspase-9釋放，減少膿毒癥小鼠心肌細(xì)胞凋亡，減輕與膿毒癥相關(guān)的心肌損傷。