周哲雯,朱伊敏,王燁菠,王 萍,林函冰,李希寧

(湖州師范學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，浙江 湖州 313000)

骨質(zhì)疏松癥是一種典型的與老年相關(guān)的疾病，其核心發(fā)病機制是成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的數(shù)量與活性失衡導(dǎo)致骨重建受損[1].成骨細(xì)胞是成骨的功能細(xì)胞，其數(shù)量增多和功能增強都可以促進骨形成.研究發(fā)現(xiàn)，成骨細(xì)胞功能障礙是骨質(zhì)疏松的主要原因[2-3].目前預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥的藥物主要集中于促進成骨細(xì)胞的增殖和分化.

哺乳動物雷帕霉素靶分子(mammalian target of rapamycin, mTOR)是一個高度保守的激酶，屬于PI3K家族的一員，與細(xì)胞的生長、增殖、分化等密切相關(guān)[4].雷帕霉素對mTOR的抑制作用在體外可損傷小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSCs)的增殖和成骨分化，并可導(dǎo)致小梁狀骨的丟失[5].雷帕霉素抑制mTOR明顯阻止了Wnt7b誘導(dǎo)的小鼠ST2細(xì)胞分化，相反激活mTOR可以促進BMSCs向成骨細(xì)胞方向分化[6]，但mTOR作用于成骨細(xì)胞的機制仍有待闡明.本研究分別利用mTOR抑制劑和激活劑改變mTOR磷酸化水平，探討mTOR磷酸化對成骨細(xì)胞的影響，為骨質(zhì)疏松的防治策略提供實驗依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

α-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清、磷酸緩沖鹽溶液(PBS)、胰蛋白酶(美國Thermo Fisher Scientific公司)；CCK-8試劑盒、細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、青鏈霉素雙抗混合液(北京索萊寶科技有限公司)；mTOR、p-mTOR、ALP、Runx2、osterix抗體與引物(美國Abcam公司).

1.2 方法

(1) 細(xì)胞培養(yǎng)：MC3T3-E1細(xì)胞株購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫.將MC3T3-E1細(xì)胞培養(yǎng)于α-MEM完全培養(yǎng)液中，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；每2～3 d更換一次培養(yǎng)液，當(dāng)細(xì)胞密度鋪滿培養(yǎng)皿80%以上時，用胰蛋白酶消化傳代培養(yǎng)至對數(shù)期.

(2) 采用細(xì)胞增殖(CCK-8)實驗檢測細(xì)胞增殖活性：將MC3T3-E1細(xì)胞接種于96孔板，培養(yǎng)時間為2 d；雷帕霉素濃度分別為0、20、40、60、80、100、120、140、160、180和200 nM，MHY1485濃度分別為0、0.5、1、1.5、2、4、6、8、10和12 μM，每組設(shè)8個復(fù)孔；培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入100 μL CCK-8溶液，輕微振動混勻，置于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h，用酶標(biāo)儀測定波長為450 nm時的吸光值(A)，檢測細(xì)胞增殖活性.

(3) 采用細(xì)胞周期檢測試劑盒評估細(xì)胞周期：將MC3T3-E1細(xì)胞接種于6孔板，并將其分為對照組、50 nM雷帕霉素組、150 nM雷帕霉素組、2 μM MHY1485組；培養(yǎng)2 d后，將MC3T3-E1細(xì)胞經(jīng)胰酶消化，收集并用PBS洗滌，隨后加入70%冷乙醇于4 ℃恒溫下固定過夜；用PBS將固定液沖洗掉，加入0.4 mL PI染料和0.1 mL RNase A于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30 min；利用流式細(xì)胞儀測定DNA含量，分析細(xì)胞周期分布.

(4) 采用蛋白免疫印跡法檢測MC3T3-E1細(xì)胞中相關(guān)蛋白的表達：將MC3T3-E1細(xì)胞接種于6孔板，實驗分組同上；采用RIPA裂解液提取總蛋白，每個泳道加入15 μg蛋白后進行SDS-PAGE電泳；電泳后轉(zhuǎn)到PVDF膜，用5%脫脂奶粉封閉2 h，加入稀釋后的抗小鼠一抗于4 ℃孵育過夜，將辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗置于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1 h，增強化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯影，應(yīng)用Gel Image System-1600凝膠成像系統(tǒng)采集圖像.

(5) 采用Real-time PCR檢測MC3T3-E1細(xì)胞中基因的表達：將MC3T3-E1細(xì)胞接種于6孔板，實驗分組同上；培養(yǎng)2 d后，采用胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，按照Trizol試劑盒說明書提取總RNA，并用Nano-Drop分光光度計測定RNA含量；按照High-Capacity cDNAReverseTranscription Kit和Power SYBR R Green PCRMaster Mix說明書合成cDNA和PCR擴增(引物序列見表1)；使用StepOnePlus System software導(dǎo)出循環(huán)值(Ct值)，基因相對表達量采用2-(△Ct)計算.

表1 ALP、osterix和Runx2引物序列

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析.CCK-8增殖實驗OD值、細(xì)胞周期分布的組間比較采用單因素方差分析；mRNA表達量、蛋白表達量采用雙因素方差分析.檢驗水準(zhǔn)α值取雙側(cè)0.05，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義.

2 結(jié) 果

2.1 成骨細(xì)胞的增殖活性

用不同濃度的雷帕霉素處理MC3T3-E1細(xì)胞2 d后，發(fā)現(xiàn)20～140 nM雷帕霉素能夠明顯促進成骨細(xì)胞的增殖，過低或過高濃度的雷帕霉素對成骨細(xì)胞的活力無顯著影響(圖1A).根據(jù)實驗檢測結(jié)果，選擇50 nM雷帕霉素作為有效刺激組，150 nM雷帕霉素作為增殖無效組，檢測經(jīng)不同濃度MHY1485處理后的成骨細(xì)胞增殖活性.結(jié)果顯示，濃度高于0.5 μM MHY1485作用于成骨細(xì)胞2 d后可明顯抑制成骨細(xì)胞的增殖，MHY1485對成骨細(xì)胞的作用呈濃度依賴性(圖1B),最終選定2 μM MHY1485作為后續(xù)實驗濃度.

圖1 不同濃度的雷帕霉素和MHY1485對MC3T3-E1細(xì)胞增殖活性的影響Fig.1 Effects of rapamycin and MHY1485 at different concentrations on proliferative activity of MC3T3-E1 cells

2.2 mTOR磷酸化水平的變化

用50 nM和150 nM雷帕霉素作用于MC3T3-E1細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)總mTOR無變化，但p-mTOR水平明顯下降，且濃度越高對成骨細(xì)胞mTOR的磷酸化抑制作用越強，而2 μM MHY1485能明顯促進mTOR的磷酸化水平(圖2).

圖2 雷帕霉素和MHY1485對MC3T3-E1細(xì)胞mTOR磷酸化水平的影響Fig.2 Effects of rapamycin and MHY1485 on mTOR phosphorylation in MC3T3-E1 cells

2.3 細(xì)胞周期的變化

結(jié)果顯示，相比對照組MC3T3-E1細(xì)胞周期中G1期(76.38%)、S期(6.74%)和G2期(16.88%)，經(jīng)50 nM雷帕霉素誘導(dǎo)后，MC3T3-E1細(xì)胞周期中G1期(64.66%)的比例明顯下降，S期(15.96%)的比例明顯上升，G2期(19.38%)的比例有所上升但變化不明顯，說明50 nM雷帕霉素能夠促使細(xì)胞從DNA合成前期進入DNA合成期，從而促進成骨細(xì)胞的增殖.經(jīng)150 nM雷帕霉素和2 μM MHY1485作用后，MC3T3-E1細(xì)胞周期中G1期(82.35%、81.61%)的比例有所上升，但變化不顯著，S期(12.03%、15.86%)細(xì)胞數(shù)明顯增加，G2期(5.61%、2.54%)的比例顯著下降(圖3).結(jié)果提示，高濃度的雷帕霉素能過度抑制mTOR磷酸化和MHY1485激活mTOR磷酸化，阻止成骨細(xì)胞分裂使細(xì)胞周期停留在DNA合成期，起到相似的抑制細(xì)胞增殖活性的作用.

圖3 雷帕霉素和MHY1485對MC3T3-E1細(xì)胞周期的影響Fig.3 Effects of rapamycin and MHY1485 on MC3T3-E1 cell cycle

2.4 成骨細(xì)胞分化活性的變化

檢測mTOR在成骨細(xì)胞分化中的作用，采用western blot和real-time定量PCR檢測與成骨細(xì)胞分化相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子ALP、osterix和Runx2的表達.結(jié)果顯示，不同濃度的雷帕霉素對成骨細(xì)胞的作用不同，50 nM雷帕霉素明顯誘導(dǎo)ALP和Runx2的表達，但osterix的變化不明顯，在150 nM雷帕霉素作用下，ALP和osterix的表達顯著升高，但Runx2的變化不明顯，說明其不同程度地抑制了mTOR的磷酸化水平，可能通過不同方式影響成骨細(xì)胞的分化功能.2 μM MHY1485顯著抑制了osterix的基因和蛋白水平，ALP的基因水平明顯降低，蛋白表達變化不顯著，對Runx2的影響不大(圖4和圖5).上述結(jié)果表明，降低mTOR的磷酸化水平，可以適當(dāng)增強成骨細(xì)胞的早期分化功能，激活mTOR則可抑制成骨細(xì)胞的分化.

圖4 蛋白水平分析雷帕霉素和MHY1485對MC3T3-E1細(xì)胞分化能力的影響Fig.4 Protein level analysis of the effects of rapamycin and MHY1485 on the differentiation ability of MC3T3-E1 cells

圖5 基因水平分析雷帕霉素和MHY1485對MC3T3-E1細(xì)胞分化能力的影響Fig.5 Gene level analysis of the effects of rapamycin and MHY1485 on the differentiation ability of MC3T3-E1 cells

3 討 論

mTOR是細(xì)胞對抗氧化應(yīng)激和細(xì)胞存活的重要調(diào)節(jié)因子之一，可以被MHY1495激活，以維持線粒體功能[7].成骨細(xì)胞是骨形成的重要功能細(xì)胞，可以產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)蛋白和基質(zhì)礦化調(diào)節(jié)因子，參與早期骨形成和晚期骨重建.體外研究表明，成骨樣細(xì)胞自噬的藥理學(xué)誘導(dǎo)可降低其氧化應(yīng)激，抑制細(xì)胞凋亡[8].

本研究結(jié)果顯示，適宜濃度的雷帕霉素能夠通過抑制mTOR磷酸化促進成骨細(xì)胞的增殖，而高濃度的雷帕霉素對成骨細(xì)胞的增殖作用呈下降趨勢.MHY1485雖能促進mTOR磷酸化，但抑制了骨細(xì)胞的增殖.進一步分析細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn)，適宜濃度的雷帕霉素能夠促進細(xì)胞從DNA合成前期進入DNA合成期，促進成骨細(xì)胞的增殖；高濃度的雷帕霉素能夠過度抑制mTOR磷酸化和MHY1485激活mTOR磷酸化，阻止成骨細(xì)胞分裂使細(xì)胞周期停留在DNA合成期，起到相似的抑制細(xì)胞增殖活性的作用.

成骨細(xì)胞分化標(biāo)志物ALP、osterix和Runx2均可作為骨轉(zhuǎn)化的標(biāo)記蛋白，與骨吸收、骨形成和骨礦化密切相關(guān)[9-10].ALP是骨形成的血清標(biāo)志物，與成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞活性的變化有關(guān).Osterix是與成骨細(xì)胞分化和骨形成有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，只在發(fā)育的骨組織中特異性表達.Runx2是一種轉(zhuǎn)錄因子，能誘導(dǎo)不成熟骨細(xì)胞向成熟的成骨細(xì)胞分化過程中起重要作用的轉(zhuǎn)錄因子Sp7，Sp7和經(jīng)典Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)將骨祖細(xì)胞直接分化為成骨細(xì)胞，從而抑制軟骨細(xì)胞分化[11].本研究結(jié)果顯示，ALP、osterix和Runx2的變化與mTOR磷酸化水平相反，當(dāng)適宜濃度的雷帕霉素抑制mTOR磷酸化時，ALP、osterix和Runx2的表達明顯增強，MHY1495能夠促進mTOR磷酸化，從基因和蛋白水平降低ALP和osterix的表達，對Runx2無明顯改變.

mTOR通過對各種骨相關(guān)細(xì)胞的活性、功能進行調(diào)控，從而影響骨代謝過程，其中涉及多種信號分子的調(diào)節(jié)，在骨組織代謝過程中起到重要作用.然而，研究顯示mTOR磷酸化的抑制并不完全有利于骨量調(diào)節(jié)，接近極值的水平可能會影響細(xì)胞的基礎(chǔ)功能，從而呈現(xiàn)相反的結(jié)果，且細(xì)胞生長、分化在不同階段的自噬水平也不一致.本研究通過體外實驗數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，適宜濃度的雷帕霉素能夠通過抑制mTOR，增強成骨細(xì)胞的增殖活性和分化能力，而過度抑制或激活mTOR磷酸化則會誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡，減弱細(xì)胞分化功能.此外，有必要進行進一步的臨床研究，以確認(rèn)mTOR和骨質(zhì)疏松癥之間可能存在的關(guān)系，進一步研究未來預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥的治療方法.