李少剛，李永芹,2，許樂樂,2，陳道海,2，王鋰韞,2,3

( 1.嶺南師范學(xué)院 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣東 湛江 524048； 2.廣東省粵西海鮮資源可持續(xù)利用工程技術(shù)研究中心，廣東 湛江 524048； 3.廣東省特殊兒童發(fā)展與教育重點實驗室，廣東 湛江 524048 )

日本無針烏賊(Sepiellajaponica)屬軟體動物門、頭足綱、十腕目、烏賊科、無針烏賊屬，因其高度進化、發(fā)展并集中的神經(jīng)系統(tǒng)，被認(rèn)為是研究眼睛形態(tài)發(fā)育的模式生物[1]。在胚胎發(fā)育過程中，有關(guān)頭足類動物光敏度的研究表明，在孵化前，胚胎在視網(wǎng)膜最終分化之前會變得光敏[2-3]。與其他頭足類動物不同，烏賊卵周圍有黑色的包膜，從而減弱了進入胚胎的光線，烏賊胚胎會在黑暗的視覺環(huán)境中發(fā)育，當(dāng)眼部器官分化到第一個視網(wǎng)膜色素出現(xiàn)的時期，烏賊胚胎對光照做出反應(yīng)[4-8]。目前針對日本無針烏賊胚胎期眼部發(fā)育的研究多集中于外源性因素，如光照、飼料、藥物等，而關(guān)于轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控機制對日本無針烏賊胚胎期眼部分化的影響卻鮮有報道。

多細(xì)胞生物視覺結(jié)構(gòu)的形態(tài)發(fā)生受到一個保守的基因轉(zhuǎn)錄控制網(wǎng)絡(luò)所調(diào)控[9]。在基因轉(zhuǎn)錄控制網(wǎng)絡(luò)中，paired-box 6(pax6)是高度保守的轉(zhuǎn)錄因子家族paired-box的成員之一[10-11]，也被認(rèn)為是控制眼睛形態(tài)發(fā)生的通用基因，有研究表明，其在多細(xì)胞生物眼睛光敏感受器的發(fā)育過程起到重要作用[12-13]。除pax6之外，SIX Homeonox 3 (six3)、Eyes Absent (eya)基因也參與了多細(xì)胞生物視細(xì)胞的增殖、視網(wǎng)膜前體的分化、光敏感受器神經(jīng)元的分化和維持，以及其他非視網(wǎng)膜組織和器官的發(fā)育過程[14-17]。筆者在日本無針烏賊胚胎不同發(fā)育期轉(zhuǎn)錄組測序分析的水平[18]上進一步探討與日本無針烏賊胚胎眼部發(fā)育過程相關(guān)調(diào)控基因six3、eya及pax6的表達變化。

不同研究者對烏賊胚胎發(fā)育的分期各有不同，劉振勇等[19]將烏賊受精卵到出膜幼體分為22期；蔣霞敏等[20]從胚胎的受精卵階段至孵化階段將烏賊卵的發(fā)育過程分為12個階段；von Boletzky等[21]則將從受精卵到形態(tài)結(jié)構(gòu)與成體基本相似的烏賊的胚胎發(fā)育分為30個時期。綜合參考上述分期方法，筆者擬將日本無針烏賊胚胎發(fā)育過程分為3個時期、8個階段，并對不同發(fā)育階段烏賊胚胎中的six3、eya、pax6基因相對表達水平進行分析。

剛孵化的烏賊對視覺或氣味的提示會立即做出反應(yīng)并能表現(xiàn)出對某些重復(fù)視覺刺激的習(xí)慣，表明烏賊胚胎在孵化之前的發(fā)育過程中便能探測到刺激[6,22]。筆者探討分子水平日本無針烏賊胚胎期眼部發(fā)育相關(guān)調(diào)控基因的表達變化，旨在查明烏賊相關(guān)調(diào)控基因?qū)ρ劬Πl(fā)育的影響機制，為探究烏賊的視覺機制，如烏賊快速適應(yīng)偽裝的視覺機制，同時為日本無針烏賊胚胎的人工繁育和增養(yǎng)殖提供分子水平數(shù)據(jù)參照。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

當(dāng)天產(chǎn)卵的日本無針烏賊卵采自中國南海汕頭海域，轉(zhuǎn)移至實驗室烏賊孵化養(yǎng)殖缸中培養(yǎng)，養(yǎng)殖缸規(guī)格0.4 m×0.2 m×0.3 m，烏賊卵附著于尼龍繩上, 并在下方用塑料籃盛起，24 h人工增氧。孵化用水為砂濾海水，水溫(28±1) ℃，鹽度27±1，pH 7.5～8.2，連續(xù)充氣，每日換水，換水量為養(yǎng)殖缸的1/3[23]。

自獲得烏賊卵當(dāng)日起，觀察和記錄每日培育狀況及養(yǎng)殖環(huán)境。同時，隨機挑取3～5顆烏賊卵，在體視顯微鏡(Nikon SMZ800N，Tokyo，Japan;目鏡C-W10×B/22，物鏡 Plan Apo 1×WF WD:70)下觀察和記錄，并進行分期及細(xì)分階段。每個階段取50顆烏賊卵，迅速用預(yù)冷的PBS溶液(Rnase free)沖洗，然后將每個卵分別保存于液氮預(yù)冷的滅菌密封袋中，立即置于液氮中冷凍3 h，置于-80 ℃超低溫冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 總RNA提取及cDNA反轉(zhuǎn)錄

每個階段的日本無針烏賊胚胎各取6顆，于研缽中加液氮充分碾磨，每個胚胎轉(zhuǎn)移100 mg粉末于1.5 mL離心管中，采用RNAiso Plus (TaKaRa, 日本)試劑盒提取總RNA，提取方法依據(jù)說明書進行操作。經(jīng)微量核酸測定儀(NanodropTMOne, Thermo ScientificTM, 美國)及凝膠電泳測定RNA質(zhì)量濃度及純度后，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒 (Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit, Roche,瑞士)對RNA進行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄方法依據(jù)說明書進行操作，反轉(zhuǎn)錄后cDNA置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物設(shè)計

根據(jù)已構(gòu)建的日本無針烏賊轉(zhuǎn)錄組測序及注釋信息[18]，結(jié)合美國國立生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫中已報道的軟體動物基因組序列，采用Primer Premier 5.0軟件對six3、eya、pax6、gapdh(內(nèi)參)、rpl23a(內(nèi)參)基因進行引物設(shè)計，由通用生物公司設(shè)計合成，引物序列見表1。

1.4 熒光定量PCR

以提取到的8個階段烏賊樣品的cDNA(與轉(zhuǎn)錄組取樣一致，每個胚胎取100 mg)作為模板(n=6)，以gapdh和rpl23a作為內(nèi)參基因，使用PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Foster, USA)，通過BioRad公司的熒光定量PCR儀(CFX96 Touch, California, USA) 對six3、eya、pax6基因在不同階段的烏賊胚胎中的相對表達水平進行檢測。反應(yīng)程序為：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40 個循環(huán); 95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 30 s。每個樣品及內(nèi)參均設(shè)置 2個平行，采用GraphPad Prism 7軟件對數(shù)據(jù)進行處理，并根據(jù)Ct值，用2-ΔΔCt法對結(jié)果進行分析。

表1 試驗用引物序列

1.5 統(tǒng)計分析

對獲得的熒光定量結(jié)果采用SPSS 23軟件進行統(tǒng)計分析，差異顯著水平檢驗采用單因素方差分析，*表示差異顯著，其中，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001。

2 結(jié)果與分析

2.1 日本無針烏賊胚胎發(fā)育過程

根據(jù)日本無針烏賊胚胎發(fā)育特征(圖1)，及基因表達分析研究，將日本無針烏賊胚胎發(fā)育劃分為3個時期[受精卵—眼原基形成期(SJ1)、功能器官分化期(SJ2)、幼體孵化期(SJ3)]、8個階段[受精卵—胚芽原基及胚體形成(SJ1-1)，口、漏斗原基出現(xiàn)(SJ2-2)，眼點形成(SJ2-3)，紅眼(SJ2-4)，墨囊形成(SJ2-5)，黑眼(SJ2-6)，內(nèi)殼形成(SJ2-7)，剛孵化幼體(SJ3-8)](表2)。

圖1 日本無針烏賊胚胎發(fā)育過程特征觀察Fig.1 Observation of the developmental characteristics of embryos in Japanese spineless cuttlefish S. japonicaa～b.受精卵—眼原基形成期(SJ1-1); c～h.功能器官分化期(c.SJ2-2; d.SJ2-3; e.SJ2-4; f.SJ2-5; g.SJ2-6; h.SJ2-7); i.幼體孵化期 (SJ3-8)；放大倍數(shù)10×.a—b.fertilized egg-eye primordium formation period (SJ1-1); c—h.functional organ differentiation period (c.SJ2-2; d.SJ2-3; e.SJ2-4; f.SJ2-5; g.SJ2-6; h.SJ2-7); i.larval incubation period (SJ3-8)；magnification 10×.

表2 日本無針烏賊胚胎發(fā)育過程

2.2 日本無針烏賊胚胎不同發(fā)育階段six3、eya、pax6基因表達分析

基因表達分析結(jié)果表明，以gapdh、rpl23a為內(nèi)參，six3、eya基因表達量均隨烏賊胚胎發(fā)育從受精卵—眼原基形成期到幼體孵化期3個時期8個階段逐漸增加；six3基因在幼體孵化期第8階段相對表達量相比受精卵—眼原基形成期第1階段及功能器官分化期6個階段均顯著增加，功能器官分化期第7階段相比受精卵—眼原基形成期第1階段及功能器官分化期第2、3階段均顯著增加；eya基因在幼體孵化期第8階段相對表達量相比受精卵—眼原基形成期第1階段及功能器官分化期第2階段顯著增加，功能器官分化期第7階段相比受精卵—眼原基形成期第1階段顯著增加。pax6基因相對表達量隨烏賊胚胎發(fā)育從受精卵—眼原基形成期到功能器官分化期有所增加，但從功能器官分化期第2階段開始直至幼體孵化期第8階段基因表達量逐漸降低；以gapdh基因為內(nèi)參，pax6基因在幼體孵化期第8階段相對表達量相比受精卵—眼原基形成期第1階段及功能器官分化期第2～6階段顯著降低，而以rpl23a基因為內(nèi)參，3期相對表達量無顯著差異(圖2)。

圖2 日本無針烏賊不同胚胎發(fā)育階段six3、eya及pax6基因相對表達量(n=6)Fig.2 The relative transcript levels of six3，eya，and pax6 genes in different embryonic developmental stages of Japanese spineless cuttlefish S. japonica a～b.six3基因； c～d.eya基因； e～f.pax6基因； 圖中數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；*.P<0.05， **.P<0.01.a—b.six3 gene； c—d.eya gene； e—f.pax6 gene； values are expressed as the mean±SD； *.P<0.05， **.P<0.01.

3 討 論

3.1 six3、eya及pax6基因在日本無針烏賊胚胎發(fā)育期中的表達量

本項目組日本無針烏賊轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫[18]使用短reads組裝軟件Trinity組裝拼接后獲得58 054條Unigene，這些Unigene中，作為研究對象的six3基因，其Unigene長度為1220 nt，GC含量為48.61%；eya基因，其Unigene長度為4194 nt，GC含量為39.96%；pax6基因，其Unigene長度為1036 nt，GC含量為37.45%。根據(jù)每百萬Reads中來自某一基因每千堿基長度的Reads數(shù)目(RKPM)值計算，six3基因在3個時期中的表達RPKM均值為1.06；eya基因在3個時期中的RPKM均值為0.99；pax6基因在3個時期中的RPKM均值為0.40。根據(jù)高原等[24]對RPKM值劃分定義基因表達高低的方法，將基因表達量分為以下4個水平：中高表達量RPKM(30～+∞)、偏低表達量RPKM(3～30)、低表達量RPKM(1～3)、超低表達量RPKM(0～1)。本試驗中，日本無針烏賊胚胎eya基因及pax6基因在3個時期RPKM均值均在超低表達量RPKM(0～1)的區(qū)間中，即eya、pax6基因在胚胎發(fā)育3個時期的表達量均為超低表達量，six3基因在3個時期RPKM均值在低表達量RPKM(1～3)的區(qū)間中，即six3基因在胚胎發(fā)育3個時期的表達量均為低表達量，因此推測six3、eya、pax6 3個基因在基因轉(zhuǎn)錄控制網(wǎng)絡(luò)中以較低表達量進行調(diào)節(jié)作用，如six3以較低表達量調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜發(fā)育，而過表達則可引起某些特定細(xì)胞亞群的擴增[25-29]。

3.2 雙內(nèi)參基因gapdh、rpl23a在six3、eya及pax6基因表達分析中的應(yīng)用

根據(jù)Pfaffl等[30-31]基因穩(wěn)定性測量方法，本試驗在基因表達分析中，采用雙內(nèi)參基因gapdh、rpl23a對數(shù)據(jù)進行歸一化處理。在six3、eya基因表達分析中，以gapdh及以rpl23a為內(nèi)參基因結(jié)果一致，內(nèi)參基因受候選基因表達強度影響較小，而在pax6基因表達分析中，以rpl23a為內(nèi)參基因，所分析各時期樣品的表達水平變化較以gapdh為內(nèi)參基因各時期樣品的表達水平變化大，但無顯著性差異出現(xiàn)，表達趨勢一致。目前有關(guān)日本無針烏賊基因表達分析內(nèi)參基因選擇報道較少，該結(jié)果有助于日本無針烏賊基因表達分析選擇穩(wěn)定的參考基因。

3.3 six3、eya及pax基因在日本無針烏賊眼睛發(fā)育中的調(diào)控作用

脊椎動物眼形態(tài)的發(fā)生受到包括six、eya及pax在內(nèi)的幾個重要基因的調(diào)控，它們在脊椎動物和果蠅的視網(wǎng)膜前體細(xì)胞分化及增殖，光感受器神經(jīng)元細(xì)胞的維護中起著關(guān)鍵作用[32]。Koenig等[33]研究顯示，與脊椎動物一樣，頭足類動物中six3及eya基因參與晶狀體的形成，頭足類動物中six3及eya基因在胚胎發(fā)育早期眼區(qū)(如胚胎的眼基、視葉)及在胚胎發(fā)育后期胚基板和蓋的邊緣可觀察到有明顯表達。本試驗中，six3、eya基因在日本無針烏賊不同胚胎發(fā)育時期及階段的相對表達量結(jié)果顯示，six3、eya基因在眼原基形成期有微量表達，并隨胚胎發(fā)育，從眼原基形成期到幼體孵化期8個階段相對表達量逐漸顯著增加，表明six3、eya在日本無針烏賊眼睛發(fā)育中同樣起重要作用。

在脊椎動物胚胎發(fā)育期，pax6基因在視網(wǎng)膜發(fā)育后期的腺管和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中表達[34]。在魷魚胚胎發(fā)育期，pax6基因被認(rèn)為是眼形成通用主控基因，參與光感器官的發(fā)育，pax6基因在加州魷魚(Loligoopalescens)眼睛發(fā)育過程中的表達方式與果蠅無眼基因表達方式類似，無眼基因在果蠅眼盤未分化前體細(xì)胞中表達活躍，在眼盤后端形成形態(tài)溝后的分化細(xì)胞中表達明顯下降，pax6基因在加州魷魚光區(qū)外胚層和中胚層表達明顯，而在分化的視網(wǎng)膜細(xì)胞中無表達[35]。本試驗中，pax6基因在日本無針烏賊胚胎發(fā)育功能器官分化期表達量增加，在眼點形成前期眼柄突出時表達最活躍，隨胚胎發(fā)育視網(wǎng)膜細(xì)胞分化表達逐漸降低，與加州魷魚中pax6基因表達相似，而pax6基因在日本無針烏賊眼睛發(fā)育后期調(diào)控與脊椎動物不同[36]。

3.4 six3、eya、pax6基因在基因轉(zhuǎn)錄控制網(wǎng)絡(luò)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的調(diào)節(jié)作用

six3、eya、pax6基因在日本無針烏賊眼原基形成期、功能器官分化期及幼體孵化期3個胚胎發(fā)育時期8個階段不同程度的表達水平表明，這3個基因在基因轉(zhuǎn)錄控制網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮不同調(diào)節(jié)作用。有研究表明，eya基因表達的EYA蛋白是一類重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，其在胚胎發(fā)育過程中對組織和器官的特異性分化具有重要調(diào)控作用[37-38]，EYA蛋白可以與SIX蛋白發(fā)生直接相互作用[39-40]，作為SIX蛋白的共激活因子激活SIX[41]，因而推測基因功能關(guān)聯(lián)性可能與six3、eya基因相對表達量均從眼原基形成期到幼體孵化期逐漸顯著增加相關(guān)。頭足類動物中，pax6基因調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄控制網(wǎng)絡(luò)上游[36]，同時，有研究表明，在哺乳動物眼睛晶狀體誘導(dǎo)和分化過程中，six3為pax6的下游調(diào)控基因，激活了pax6等相關(guān)基因的表達[42-43]，而在日本無針烏賊胚胎發(fā)育中，pax6基因也在較早時期(眼原基形成期至功能器官分化期)相對表達量較高，基因相對表達量在功能分化基本完成后(幼體孵化期)顯著降低。

筆者僅對日本無針烏賊胚胎不同發(fā)育階段3個眼部相關(guān)基因進行了分析研究，有關(guān)不同發(fā)育階段眼部組織學(xué)特征及不同發(fā)育階段眼部不同部位這3個基因的表達有待進一步分析。

4 結(jié) 論

根據(jù)日本無針烏賊胚胎3個發(fā)育時期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)eya、pax6基因在3個發(fā)育時期均為超低表達量基因，six3基因在3個發(fā)育時期為低表達量基因。3個基因在日本無針烏賊胚胎3個發(fā)育時期8個階段的相對表達量變化表明其在基因轉(zhuǎn)錄控制網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮不同調(diào)節(jié)作用。日本無針烏賊胚胎眼部發(fā)育過程所涉及的基因轉(zhuǎn)錄控制網(wǎng)絡(luò)機制尚未查明，筆者從胚胎3個發(fā)育時期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中尋找與胚胎生長發(fā)育，器官功能分化等相關(guān)基因進行分析，并對每一階段的基因變化進行研究探討，為構(gòu)建基因轉(zhuǎn)錄控制網(wǎng)絡(luò)，了解調(diào)控機制提供數(shù)據(jù)支持，同時也為日本無針烏賊胚胎的人工繁育和增養(yǎng)殖提供有效的數(shù)據(jù)參照。