崔 淼，吳 敏，劉 茹，黎晶晶，張輝杰，許德麟，張其中

( 暨南大學 水生生物研究所，熱帶亞熱帶水生態(tài)工程教育部工程研究中心，廣東省高校水體富營養(yǎng)化與赤潮防治重點實驗室，廣東 廣州 510632 )

羅非魚(Oreochromis)是世界范圍內(nèi)廣泛養(yǎng)殖的水產(chǎn)品之一，據(jù)統(tǒng)計，2014年中國羅非魚養(yǎng)殖產(chǎn)量已達到1.6985×106t，約達全球羅非魚養(yǎng)殖總產(chǎn)量的32%[1]。近年來，羅非魚鏈球菌病日益嚴重，給羅非魚養(yǎng)殖業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失。研究表明，羅非魚鏈球菌病的主要致病菌是海豚鏈球菌(Streptococcusiniae)和無乳鏈球菌(S.agalactiae)[2]。無乳鏈球菌是一種人、畜、魚共患的致病菌，可引起新生兒患腦膜炎、敗血癥等[3]。海豚鏈球菌至少能夠感染27種海洋和淡水魚類，死亡率高達30%～50%，而且能通過病魚感染人類，屬機會性人畜共患病原菌[4]。羅非魚鏈球菌病的優(yōu)勢菌群會發(fā)生改變，2006—2007年間，海豚鏈球菌是羅非魚鏈球菌病的主要病原菌，占總檢出率的94.7%[5]。2008年至今，羅非魚鏈球菌病主要由無乳鏈球菌引起，而海豚鏈球菌仍然是羅非魚的潛在養(yǎng)殖風險[6]。海豚鏈球菌和無乳鏈球菌均能造成羅非魚的嚴重病害，現(xiàn)有的防治方法除抗生素外還包括中草藥和疫苗等[7-8]。但僅從外部癥狀和兩種病原菌的菌落、菌體形態(tài)上，都很難準確判定病害是由哪一種鏈球菌引起的[9]，這將嚴重影響到對鏈球菌病害及時、有效的處理。

目前羅非魚鏈球菌的常規(guī)診斷方法有電鏡觀察、生化反應(yīng)和藥敏試驗等[10]，但這些方法均很難對感染魚樣本進行早期分子診斷和預(yù)警，同時一些生理反應(yīng)現(xiàn)象可能隨外界環(huán)境的變化而改變，從而容易導致誤判情況的發(fā)生[11]。普通PCR每次僅能檢測1個基因，可能會造成漏檢或誤檢[12]；多克隆抗體和單克隆抗體都是需要提前準備的，而且熒光抗體和ELISA的價格高且操作難[13-14]；盡管等溫環(huán)介導(LAMP)較方便，但容易出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象[15]；熒光定量PCR(qPCR)技術(shù)的操作要求較高，而且設(shè)備較為昂貴[16]。因此，為達到對羅非魚鏈球菌的早期預(yù)警，需要建立更加快速、高效的早期分子預(yù)警檢測技術(shù)。無乳鏈球菌與海豚鏈球菌的16S rRNA基因的同源性高度相似，達到96.6%以上[17]，但是可在16S rRNA基因的變異區(qū)設(shè)計特異性引物，對兩種菌進行區(qū)分和鑒定。表面免疫源性蛋白(Sip)屬于編碼B群鏈球菌的表面蛋白基因類群[18]，在不同種的血清型菌株中均有存在[19]。筆者選用無乳鏈球菌的Sip基因和海豚鏈球菌16S rRNA基因的特異性序列，設(shè)計引物并對引物組合優(yōu)化，建立了檢測較低含量的無乳鏈球菌和海豚鏈球菌的雙重PCR方法，旨在為羅非魚鏈球菌的早期預(yù)警提供一種靈敏、特異的分子檢測技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

無乳鏈球菌標準菌株ATCC13813、海豚鏈球菌標準菌株ATCC29178為中國水產(chǎn)科學研究院珠江水產(chǎn)研究所惠贈。無乳鏈球菌的分離菌株和海豚鏈球菌的分離菌株來源于羅非魚病魚，由本實驗室分離、鑒定和保存；嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)、遲鈍愛德華氏菌(Edwardsiellatarda)、維氏氣單胞菌(A.veronii)、創(chuàng)傷弧菌(Vibriovulnificus)、溫和氣單胞菌(A.sobria)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)、大腸桿菌(Escherichiacoli)等菌株，均由本實驗室分離、鑒定和保存。

1.1.2 試驗魚

試驗魚為尼羅羅非魚(O.niloticus)，體質(zhì)量(50±5) g，由廣東省羅非魚良種場提供。實驗室馴養(yǎng)14 d，確認正常無異樣后可用于試驗。

1.1.3 主要試劑

三羥甲基氨基甲烷、十二烷基苯磺酸鈉、無核酸酶水、1×TE緩沖液、溶菌酶、蛋白酶K、苯酚/氯仿/異戊醇、無水乙醇、70%乙醇；dNTP(25 mmol/L)、10×PCR Buffer(無Mg2+)、MgCl2(25 mmol/L)、無菌超純水、rTaq DNA聚合酶(5 U/μL)；腦心浸液培養(yǎng)基、瓊脂粉。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank中海豚鏈球菌的16S rRNA基因部分序列，設(shè)計引物P1(5′-ATACCGCATAAGAGTGATT-3′)和P2(5′-ACCACCTGTCACTTCTGCT-3′)，預(yù)期擴增片段大小為614 bp；根據(jù)無乳鏈球菌特異性基因Sip的序列，設(shè)計引物P3(5′-TGAATAAGAAATTGTTTTTAGCG-3′)和P4(5′-ACTTGTAATCGTTGGTTCTGCC-3′)，預(yù)期擴增片段大小為870 bp，由華大基因有限公司合成。

1.2.2 DNA模板的提取

從-80 ℃冰箱保存的菌種中，挑取海豚鏈球菌標準株、無乳鏈球菌標準株、嗜水氣單胞菌、遲鈍愛德華氏菌、維氏氣單胞菌、創(chuàng)傷弧菌、溫和氣單胞菌、溶藻弧菌、大腸桿菌。在無菌條件下接種于腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基上，在28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后收集菌體，各細菌基因組DNA的提取步驟，參考革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌DNA的提取方法[20]。

1.2.3 雙重PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化

雙重PCR引物組合和溫度條件的優(yōu)化為：用ddH2O分別將16S rRNA基因引物和Sip基因引物稀釋為10 μmol/L，然后取16S rRNA上、下游引物[(0.5 μL，0.5 μL)、(0.4 μL，0.4 μL)、(0.3 μL，0.3 μL)]，依次命名為A1、A2、A3；再取Sip基因上、下游引物[(0.5 μL，0.5 μL)、(0.4 μL，0.4 μL)、(0.3 μL，0.3 μL)]，依次命名為B1、B2、B3。通過AxBy(x=1，2，3；y=1，2，3)進行組合(表1)。

表1 無乳鏈球菌和海豚鏈球菌引物比例試驗組合

反應(yīng)體系為：10×PCR Buffer (無Mg2+) 2.5 μL，MgCl2(25 mmol/L) 1.5 μL，dNTP (25 mmol/L) 2.5 μL，rTaq DNA 聚合酶 (5 U/μL) 0.1 μL，引物為表1中的AxBy(x=1，2，3；y=1，2，3)，模板各l μL，ddH2O補充至25 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，52、54、56、58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，擴增30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

反應(yīng)完成后，取不同退火溫度條件下每個引物組合的PCR擴增產(chǎn)物5 μL，與1 μL 6×Loading Buffer充分混勻，在恒壓120 V、1.2%的瓊脂糖凝膠下電泳20 min。如果16S rRNA和Sip基因兩個目的條帶同時出現(xiàn)，且無其他雜帶，其對應(yīng)的引物組合和退火溫度為最佳條件。并以此建立雙重PCR檢測無乳鏈球菌和海豚鏈球菌的方法。

1.2.4 雙重PCR特異性的測定

分別取無乳鏈球菌、海豚鏈球菌、嗜水氣單胞菌、遲鈍愛德華氏菌、維氏氣單胞菌、創(chuàng)傷弧菌、溫和氣單胞菌、溶藻弧菌、大腸桿菌的基因組DNA和無乳鏈球菌和海豚鏈球菌基因組DNA的混合樣本，每種模板為1 μL。根據(jù)篩選出的最佳反應(yīng)條件進行PCR擴增，然后在恒壓120 V、1.2%的瓊脂糖凝膠下電泳20 min。

1.2.5 雙重PCR靈敏度的測定

DNA含量的測定為：將無乳鏈球菌基因組DNA 10倍梯度稀釋為9.84×10-2、9.84×10-3、9.84×10-4、9.84×10-5、9.84×10-6ng/μL；海豚鏈球菌基因組DNA 10倍梯度稀釋為9.30×10-2、9.30×10-3、9.30×10-4、9.30×10-5、9.30×10-6ng/μL。根據(jù)篩選出的最佳反應(yīng)條件和反應(yīng)體系進行擴增，以能檢測到的2種細菌基因組DNA的最大稀釋質(zhì)量濃度，確定雙重PCR的DNA靈敏度。

1.2.6 雙重PCR可重復(fù)性的檢測

取無乳鏈球菌和海豚鏈球菌各5株，提取其基因組DNA，方法同上。以2種菌基因組DNA混合樣本為模板，根據(jù)篩選出的最佳反應(yīng)條件和反應(yīng)體系進行PCR擴增。重復(fù)檢測3次，均以標準菌株ATCC13813和ATCC29178的DNA混合樣本為模板，作為陽性對照，確定雙重PCR方法的可重復(fù)性。

1.2.7 雙重PCR對模擬臨床樣品的檢測

各取150 μL菌液密度為1.48×107cfu/mL的無乳鏈球菌、1.20×107cfu/mL的海豚鏈球菌，采用腹腔注射法同時人工感染尼羅羅非魚18尾，24 h后取其腎臟組織。用十二烷基苯磺酸鈉法結(jié)合溶菌酶法[21]，提取腎組織內(nèi)細菌基因組DNA。再用所建立的雙重PCR方法進行檢測，以確定雙重PCR的臨床適用性。

2 結(jié)果與分析

2.1 優(yōu)化后的引物組合和退火溫度

由圖1可見，將16S rRNA和Sip基因引物的9種組合進行PCR擴增后，通過對引物組合進行相同反應(yīng)體系和反應(yīng)條件下的優(yōu)化選擇，A1B2引物擴增在52、54、56、58 ℃時比其他8種引物組合條帶更清晰且特異性更高，因此選擇A1B2作為引物擴增。即16S rRNA上、下游引物(10 μmol/L)的體積為0.5、0.5 μL，Sip基因上、下游引物(10 μmol/L)的體積為0.4、0.4 μL。在相同的反應(yīng)體系下，退火溫度為54 ℃時的雙重PCR的特異性條帶比52 ℃的條帶清晰，且退火溫度為54 ℃時的雙重PCR條帶比56、58 ℃的條帶特異性高，所以最終選擇54 ℃作為最佳的退火溫度。

利用優(yōu)化后的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，對無乳鏈球菌和海豚鏈球菌標準菌株的混合樣本進行檢測，出現(xiàn)兩條特異性條帶；用單一引物分別擴增16S rRNA和Sip基因，均出現(xiàn)1條特異性條帶，且條帶位置與預(yù)期結(jié)果一致(圖2)。將特異性條帶序列分別與無乳鏈球菌16S rRNA和海豚鏈球菌Sip基因序列BLAST比對，結(jié)果表明，本研究建立的雙重PCR方法擴增出的特異性條帶，為無乳鏈球菌16S rRNA和海豚鏈球菌Sip基因目的片段。

圖1 雙重PCR的引物組合優(yōu)化結(jié)果Fig.1 Primer combination optimization of duplex PCRM.2000 bp DNA標記； 1～9.退火溫度為52 ℃時，引物組合1～9的PCR擴增結(jié)果； 10～18.退火溫度為54 ℃時，引物組合1～9的PCR擴增結(jié)果； 19～27.退火溫度為56 ℃時，引物組合1～9的PCR擴增結(jié)果； 28～35.退火溫度為58 ℃時，引物組合1～8的PCR擴增結(jié)果.M.2000 bp DNA marker; 1—9.PCR amplification results of primer combinations 1—9 at the annealing temperature of 52 ℃; 10—18.PCR amplification results of primer combinations 1—9 at annealing temperature of 54 ℃; 19—27.PCR amplification results of primer combinations 1—9 at annealing temperature of 56 ℃; 28—35.PCR amplification results of primer combinations 1—8 at annealing temperature of 58 ℃.

圖2 單一引物和兩對引物PCR擴增結(jié)果Fig.2 PCR amplification of single primer and two pairs of primersM.2000 bp DNA標記； 1.Sip基因； 2.16S rRNA基因； 3.雙重PCR的結(jié)果.M.2000 bp DNA marker; 1.Sip gene； 2.16S rRNA gene; 3.the result of duplex PCR.

2.2 雙重PCR檢測無乳鏈球菌和海豚鏈球菌的特異性

由圖3可見，無乳鏈球菌基因組DNA樣品擴增的條帶為870 bp；海豚鏈球菌基因組DNA擴增的條帶為614 bp；兩種菌的基因組DNA混合樣品可同時擴增出870 bp和614 bp的目的條帶；以嗜水氣單胞菌、遲鈍愛德華氏菌、維氏氣單胞菌、創(chuàng)傷弧菌、溫和氣單胞菌、溶藻弧菌、大腸桿菌的基因組DNA為模板進行擴增，均未出現(xiàn)任何條帶。

圖3 無乳鏈球菌和海豚鏈球菌雙重PCR特異性擴增結(jié)果Fig.3 Specific amplification of duplex PCR in S. agalactiae and S. iniaeM.2000 bp DNA標記； 1.無乳鏈球菌基因組DNA； 2.海豚鏈球菌基因組DNA； 3.無乳鏈球菌和海豚鏈球菌基因組DNA混合樣品； 4～10.分別為嗜水氣單胞菌、遲鈍愛德華氏菌、維氏氣單胞菌、創(chuàng)傷弧菌、溫和氣單胞菌、溶藻弧菌、大腸桿菌的基因組DNA.M.2000 bp DNA marker; 1 .the genomic DNA of S. agalactiae; 2.the genomic DNA of S. iniae; 3.the mixed genomic DNA of S. agalactiae and S. iniae; 4—10.the genomic DNA of A. hydrophila, E. tarda, A. vickers, V. vulnificus, A. temperate, V. alginolyticus and E. coli, respectively.

2.3 雙重PCR檢測無乳鏈球菌和海豚鏈球菌的靈敏度

用本研究建立的雙重PCR方法，分別擴增不同質(zhì)量濃度的無乳鏈球菌和海豚鏈球菌基因組DNA混合樣本(圖4)。分別擴增不同質(zhì)量濃度的無乳鏈球菌和海豚鏈球菌的混合菌液(圖5)。檢測結(jié)果表明，該體系檢測無乳鏈球菌和海豚鏈球菌的靈敏度均較高，其能檢測到的無乳鏈球菌基因組DNA最低質(zhì)量濃度為9.84×10-5ng/μL，海豚鏈球菌基因組DNA最低質(zhì)量濃度為9.30×10-5ng/μL，無乳鏈球菌菌液最低密度為2.76×103cfu/mL，海豚鏈球菌菌液最低密度為2.51×103cfu/mL，兩種菌的最低檢測密度均低于半致死密度107cfu/mL，可用于羅非魚鏈球菌的早期預(yù)警分子檢測。

圖4 無乳鏈球菌和海豚鏈球菌雙重PCR 的DNA敏感性擴增結(jié)果Fig.4 DNA sensitivity amplification of duplex PCR in S. agalactiae and S. iniae M.2000 bp DNA標記； N.陰性對照； 1～5.分別為無乳鏈球菌DNA質(zhì)量濃度9.84×10-2、9.84×10-3、9.84×10-4、9.84×10-5、9.84×10-6 ng/μL和海豚鏈球菌DNA質(zhì)量濃度9.30×10-2、9.30×10-3、9.30×10-4、9.30×10-5、9.30×10-6 ng/μL.M. 2000 bp DNA marker; N. negative control; 1—5.the DNA concentration of 9.84×10-2 ng/μL, 9.84×10-3 ng/μL, 9.84×10-4 ng/μL, 9.84×10-5 ng/μL, and 9.84×10-6 ng/μL in S. agalactiae, and the DNA concentration of 9.30×10-2 ng/μL, 9.30×10-3 ng/μL, 9.30×10-4 ng/μL, 9.30×10-5 ng/μL, and 9.30×10-6 ng/μL in S. iniae, respectively.

圖5 無乳鏈球菌和海豚鏈球菌雙重PCR菌落靈敏度擴增結(jié)果Fig.5 Results of sensitivity amplification of S. agalactiae and S. iniae by duplex PCRM.2000 bp DNA標記； N.陰性對照； 1～5.分別為無乳鏈球菌菌液密度2.76×106、2.76×105、2.76×104、2.76×103、2.76×102 cfu/mL和海豚鏈球菌菌液密度2.51×106、2.51×105、2.51×104、2.51×103、2.51×102 cfu/mL.M.2000 bp DNA marker; N.negative control; 1—5.the bacterial solution concentration of 2.76×106 cfu/mL, 2.76×105 cfu/mL, 2.76×104 cfu/mL, 2.76×103 cfu/mL, and 2.76×102 cfu/mL in S. agalactiae, and the bacterial solution concentration of 2.51×106 cfu/mL, 2.51×105 cfu/mL, 2.51×104 cfu/mL, 2.51×103 cfu/mL, and 2.51×102 cfu/mL in S. iniae, respectively.

2.4 雙重PCR檢測無乳鏈球菌和海豚鏈球菌的可重復(fù)性

各取5株無乳鏈球菌和海豚鏈球菌，以2種菌的基因組DNA混合樣本為模板，在優(yōu)化的雙重PCR反應(yīng)體系下，均能同時擴增出2條特異性條帶，與陽性對照的擴增結(jié)果相同(圖6)。重復(fù)性檢測3次的結(jié)果完全一致，說明該檢測方法具有良好的重復(fù)性。

圖6 重復(fù)性檢測結(jié)果Fig.6 The results of repeatability testM.2000 bp DNA標記； 1～5.無乳鏈球菌和海豚鏈球DNA混合樣本為模板； 6.陽性對照.M.2000 bp DNA marker; 1—5. a mixed sample of S. agalactiae and S. iniae DNA as template; 6.a positive control.

2.5 雙重PCR檢測模擬臨床樣品的結(jié)果

取18尾同時人工感染無乳鏈球菌和海豚鏈球菌的羅非魚腎臟樣本，提取組織內(nèi)的細菌基因組DNA，以其作為模板進行雙重PCR反應(yīng)，能同時擴增出870 bp和614 bp的特異性條帶，陽性檢出率為100%(圖7)。

圖7 雙重PCR對同時人工感染無乳鏈球菌和海豚鏈球菌的羅非魚腎組織檢測Fig.7 Detection of kidney in tilapia infected artificially with S. agalactiae and S. iniae by duplex PCRM.2000 bp DNA標記； 1～18.18個同時人工感染無乳鏈球菌和海豚鏈球菌的羅非魚腎中提取的細菌DNA為模板.M.2000 bp DNA marker; 1—18.18 bacterial DNA extracted from tilapia kidney artificially infected with S. agalactiae and S. iniae at the same time.

3 討 論

鏈球菌給全球魚類養(yǎng)殖造成每年約2.5億美元的重大經(jīng)濟損失，其中羅非魚影響最大，其鏈球菌病的主要病原菌是無乳鏈球菌和海豚鏈球菌[22-25]。因此，研究出快速、高效、靈敏的早期預(yù)警分子檢測技術(shù)，對實現(xiàn)羅非魚鏈球菌的早發(fā)現(xiàn)、早防御和早治療具有重要的經(jīng)濟意義和社會價值。

3.1 鏈球菌早期預(yù)警的特異性

本研究建立的分子檢測技術(shù)為雙重PCR，其是在普通PCR的基礎(chǔ)上改進的，具有靈敏、經(jīng)濟、簡便的優(yōu)點。該檢測體系通過一個PCR反應(yīng)，能同時快速檢測或鑒定兩種病原微生物[26]，節(jié)省了時間、試劑和費用，可廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)病原菌的檢測。在雙重PCR反應(yīng)中，引物的設(shè)計要考慮較多的因素[27]，本研究結(jié)合了引物的特異性、擴增效率、引物二聚體等因素，獲得了兩對較為理想的引物。其中16S rRNA引物是根據(jù)海豚鏈球菌異于無乳鏈球菌的16S rRNA基因特異性序列設(shè)計的，克隆得到的16S rRNA基因片段由可變區(qū)和恒定區(qū)交叉排列構(gòu)成，可以體現(xiàn)出這兩種菌的差異，也可以測序得到目標序列。另一Sip基因引物是在無乳鏈球菌Sip基因特異性序列上設(shè)計而成，Sip基因編碼了表面免疫源性蛋白，是B群鏈球菌表面源性蛋白的特異性基因，因此，利用Sip基因引物可以克隆得到無乳鏈球菌的特異性片段。這兩對引物能分別擴增出無乳鏈球菌和海豚鏈球菌的特異基因片段，而無重疊和其他任何雜帶，并且目的片段的大小能夠在瓊脂糖凝膠電泳中明顯區(qū)分。人工同時感染無乳鏈球菌和海豚鏈球菌，羅非魚組織樣品的陽性檢出率為100%，與細菌分離鑒定的結(jié)果相同，由此可知，該檢測方法也具有較高的特異性。

3.2 鏈球菌早期預(yù)警的靈敏性

關(guān)于羅非魚鏈球菌的分子檢測技術(shù)也有報道，如通過巢式PCR鑒定出無乳鏈球菌[28]；黎炯等[29]利用無乳鏈球菌的cfb基因和海豚鏈球菌16S rRNA基因序列建立的雙重PCR，其檢測靈敏度分別為無乳鏈球菌3.2×10-3ng/μL和海豚鏈球菌3.0×10-2ng/μL。而本研究建立的雙重PCR可以檢測到：無乳鏈球菌基因組DNA質(zhì)量濃度為9.84×10-5ng/μL，海豚鏈球菌基因組DNA質(zhì)量濃度為9.30×10-5ng/μL，檢測到的目標菌基因組含量更低，靈敏度更高。Rodkhum等[30]根據(jù)海豚鏈球菌的lctO基因和無乳鏈球菌的16S rRNA基因建立的雙重PCR，在目標菌密度為106cfu/mL的魚組織中可以檢測到該菌株。而本研究建立的雙重PCR可以檢測到：無乳鏈球菌菌液密度為2.76×103cfu/mL，海豚鏈球菌菌液密度為2.51×103cfu/mL，更低于目標菌的半致死密度107cfu/mL，適用于羅非魚鏈球菌的早期預(yù)警分子檢測。

4 結(jié) 論

本研究建立的分子檢測技術(shù)，即根據(jù)海豚鏈球菌16S rRNA基因中有別于無乳鏈球菌的特異性片段、無乳鏈球菌Sip基因的特異性序列設(shè)計雙重PCR的引物，實現(xiàn)在一個反應(yīng)體系中同時鑒別羅非魚兩種鏈球菌的目的。該檢測技術(shù)具有較高的特異性、靈敏度、可重復(fù)性和穩(wěn)定性，比常規(guī)診斷方法更加簡便快捷，而且可檢測更低含量的無乳鏈球菌和海豚鏈球菌，適用于羅非魚鏈球菌的早期分子診斷和預(yù)警，將為羅非魚鏈球菌病的預(yù)防和診斷提供技術(shù)支持。