黃 洋，黎金海，王文基，郭煜文，李廣麗，陳華譜

( 廣東海洋大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，廣東省名特優(yōu)魚類生殖調(diào)控與繁育工程技術(shù)研究中心，廣東 湛江 524088 )

泰國(guó)斗魚(Bettasplendens)，屬脊索動(dòng)物門、硬骨魚綱、鱸形目、攀鱸亞目、絲足鱸科、斗魚亞科、斗魚屬，又稱五彩搏魚。泰國(guó)斗魚原產(chǎn)于泰國(guó)、馬來西亞、新加坡等，雄性泰國(guó)斗魚色彩艷麗、體形多姿、環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)、容易飼養(yǎng)，這些特點(diǎn)使其成為備受青睞的觀賞魚品種。提高泰國(guó)斗魚生產(chǎn)過程中的雄性比例可以有效提高其產(chǎn)業(yè)效益，因此開展泰國(guó)斗魚性別控制研究，提高雄性率具有十分重要的生產(chǎn)指導(dǎo)意義。

Doublesex和Mab-3相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(DMRT)是一類與性別決定和分化相關(guān)的基因家族總稱。已有研究表明，該基因家族廣泛參與多種生物的性別發(fā)育過程，其編碼產(chǎn)物與果蠅的doublesex基因和線蟲的mab-3基因編碼的產(chǎn)物具有高度的一致性，都含有一個(gè)DM結(jié)構(gòu)域，并且通過鋅指結(jié)構(gòu)與特異的DNA序列結(jié)合，調(diào)節(jié)目的基因轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而調(diào)控性別的決定和分化[1]。Doublesex和Mab-3相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子1(Dmrt1)是DMRT家族成員之一，該基因在哺乳類[2]、鳥類[3]、爬行類[4]及兩棲類[5]動(dòng)物中相繼被發(fā)現(xiàn)，研究表明，其在性別分化期的雄性性腺及雄性成體的精巢中特異性表達(dá)，在雞的基因中存在著Dmrt1基因的同源基因，而且該基因被定位于Z染色體上，經(jīng)驗(yàn)證與雞的性別分化具有較大的關(guān)聯(lián)[3,6]。多種硬骨魚類的Dmrt1基因相繼被克隆，如尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)[7]、奧利亞羅非魚(O.aureus)[8]、黑鯛(Acanthopagrusschlegelii)[9]、半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevis)[10]、斑馬魚(Daniorerio)[11]、大鱗副泥鰍(Paramisgurnusdabryanus)[12]和褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)[13]等魚類，同樣證實(shí)該基因?qū)τ谛坌孕韵俚男纬珊凸δ芫S持具有重要作用。

目前Dmrt1基因在泰國(guó)斗魚中的功能研究尚未見報(bào)道，筆者利用RACE技術(shù)，克隆出Dmrt1基因的cDNA序列，并開展序列分析、組織分布及其在胚胎發(fā)育階段的表達(dá)分析，為闡明Dmrt1基因在泰國(guó)斗魚中的生理功能和泰國(guó)斗魚雄性化技術(shù)的研發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)魚及試劑

試驗(yàn)用泰國(guó)斗魚購(gòu)于廣東省湛江市霞山區(qū)花鳥市場(chǎng)，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后暫養(yǎng)在循環(huán)水系統(tǒng)(上海海圣)，日投喂3次，暫養(yǎng)7 d后開始試驗(yàn)。

總RNA提取試劑使用TRIzol?Reagent(Life, USA)，DNase Ⅰ去除基因組，采用The ReverTra Ace-αfirst-strand cDNA Synthesis Kit試劑盒(TOYOBO,Japan)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。Smart-RACE試劑盒(Takara,Japan)，2×PCR Mix [天根生化科技(北京)有限公司]；其余化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)試劑(分析純)。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)

從泰國(guó)斗魚轉(zhuǎn)錄組中獲得泰國(guó)斗魚Dmrt1基因的部分序列，設(shè)計(jì)克隆泰國(guó)斗魚Dmrt1基因的開放閱讀框(ORF)序列。引物設(shè)計(jì)利用Primer Explorer軟件。試驗(yàn)所需引物見表1。

表1 泰國(guó)斗魚Dmrt1基因的克隆與定量分析中所用引物

1.2.2 總RNA抽提

首先將泰國(guó)斗魚置于冰上，經(jīng)過深度麻醉后取樣，根據(jù)TRIzol?Reagent試劑盒(Life，USA)說明書操作，對(duì)泰國(guó)斗魚的腦、垂體、性腺、心臟、肝臟、腎臟、脾臟、腸道和肌肉提取總RNA。于-80 ℃冰箱中取出凍存的樣品約50～100 mg，加入1 mL TRIzol?Reagent，利用注射器將各組織充分勻漿，室溫靜置5 min，令細(xì)胞裂解。隨后轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管中，加入200 μL氯仿抽提，劇烈振蕩15 s，室溫靜置15 min，使溶液分層。隨后將離心管置于冰凍離心機(jī)中，在4 ℃，12 000 r/min條件下，離心15 min。離心后將上清液轉(zhuǎn)移至另一1.5 mL離心管中，加入500 μL異丙醇，充分振蕩混勻溶液，室溫靜置5～10 min，隨后將該離心管置于離心機(jī)中，在4 ℃、12 000 r/min下，離心10 min。離心后去除上清液，加入1 mL 70%乙醇，充分振蕩洗滌沉淀物。再將離心管置于離心機(jī)中，4 ℃、12 000 r/min離心5 min，去除上清液。干燥約5 min后，加入適量DEPC溶液溶解RNA。在提取總RNA后利用核酸測(cè)定儀和瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行濃度與完整度的檢測(cè)。

1.2.3 分子克隆

以泰國(guó)斗魚全腦的總RNA作為模板，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara，Japan)的操作步驟，取RNA樣品2 μg于1.5 mL離心管中，補(bǔ)加DEPC溶液至8 μL，加入DNA酶Buffer 1 μL，隨后置于PCR儀上，37 ℃，30 min去除基因組污染，程序結(jié)束后加入DEPC 1 μL，在70 ℃下，運(yùn)行10 min，結(jié)束后將離心管立即置于冰上。加入oligo (dT) 2 μL，M-MLV 5× Buffer 5 μL，dNTP 1.25 μL，M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶1 μL，DEPC溶液4.75 μL，隨后置于PCR儀上，在42 ℃下，運(yùn)行1 h，反轉(zhuǎn)錄出全腦的cDNA。通過RACE技術(shù)，克隆出部分序列并送生工生物工程(上海)股份有限公司廣州分公司進(jìn)行測(cè)序，利用DNAMAN軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列重合拼接，獲得cDNA序列。 然后設(shè)計(jì)開放閱讀框全長(zhǎng)特異引物進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.4 組織分布

以反轉(zhuǎn)錄獲取的cDNA為模板利用泰國(guó)斗魚Dmrt1基因的特異引物，進(jìn)行Dmrt1基因在各組織中的半定量PCR檢測(cè)，并以β-actin基因作為半定量PCR檢測(cè)的內(nèi)參。反應(yīng)體系為25 μL：上下游引物各0.5 μL，2×PCR Mix 12.5 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 9.52 μL。循環(huán)反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取8 μL的PCR產(chǎn)物，進(jìn)行1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.5 熒光定量PCR

以泰國(guó)斗魚各個(gè)胚胎發(fā)育時(shí)期的總RNA反轉(zhuǎn)錄出的cDNA作為模板，構(gòu)建β-actin基因標(biāo)準(zhǔn)樣品，將內(nèi)參β-actin按10倍的濃度梯度逐級(jí)稀釋，建立標(biāo)準(zhǔn)樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線。利用Dmrt1上游引物F和下游引物R，反轉(zhuǎn)錄cDNA作為待測(cè)樣品。嚴(yán)格按照SYBR Green Realtime PCR Master Mix (TOYOBO，Japan)試劑盒說明書反應(yīng)體系，用Bio-Rad Light Cycler 480 real time PCR system 進(jìn)行熒光定量PCR，每個(gè)待測(cè)樣品重復(fù)測(cè)定3次。反應(yīng)體系為25 μL：上下游引物各0.5 μL，2×PCR Mix 12.5 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 9.52 μL。循環(huán)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性1 min；95 ℃變性5 s，55 ℃退火10 s，72 ℃延伸20 s，84 ℃收集熒光10 s，40個(gè)循環(huán)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線相對(duì)應(yīng)的域值從而獲得cDNA拷貝數(shù)。獲得的數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 泰國(guó)斗魚Dmrt1基因的序列分析

克隆的泰國(guó)斗魚Dmrt1基因cDNA序列為1037 bp，共編碼337個(gè)氨基酸(圖1)。利用ORF Finder在線工具預(yù)測(cè)開放閱讀框(ORF)為62～860 bp，共798 bp，編碼265個(gè)氨基酸殘基。使用SMART在線預(yù)測(cè)，該序列中含有1個(gè)與DNA結(jié)合的DM結(jié)構(gòu)域和1個(gè)A20樣的鋅指結(jié)構(gòu)位點(diǎn)，無信號(hào)肽。利用Softberry在線預(yù)測(cè)工具，預(yù)測(cè)Dmrt1基因的氨基酸序列的其他功能位點(diǎn)，結(jié)果顯示，其含有N端糖基化位點(diǎn)、磷酸化蛋白激酶C位點(diǎn)、磷酸化酪蛋白激酶Ⅱ位點(diǎn)和N端?；稽c(diǎn)等多個(gè)功能位點(diǎn)(表2)。

圖1 泰國(guó)斗魚Dmrt1 開放閱讀框序列及推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.1 ORF sequences and predicted amino acid sequences of Dmrt1 gene in Siamese fighting fish B. splendens

表2 Dmrt1氨基酸序列中的功能位點(diǎn)

2.2 泰國(guó)斗魚Dmrt1的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

對(duì)泰國(guó)斗魚的Dmrt1基因進(jìn)行同源性檢測(cè)顯示，與龜殼攀鱸(Anabastestudineus)同源性最高。通過美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫(kù)將泰國(guó)斗魚的Dmrt1基因序列進(jìn)行BLAST分析，再使用MEGA 5.0建立鄰接系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖2)。通過分析發(fā)現(xiàn)，泰國(guó)斗魚與龜殼攀鱸關(guān)系最近，大刺鰍(Mastacembelusarmatus)、黃鱔(Monopterusalbus)、白梭吻鱸(Sanderlucioperca)和盲曹魚(Latescalcarifer)同屬另外一支，泰國(guó)斗魚和它們關(guān)系較近，但與人類(Homosapiens)、小家鼠(Musmusculus)關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.3 泰國(guó)斗魚Dmrt1基因組織表達(dá)

Dmrt1基因在雌、雄的組織表達(dá)中存在明顯的差異(圖3)。在雄性中，該基因只在性腺和脾臟表達(dá)，其他組織不表達(dá)，并且在性腺中表達(dá)量最高；在雌性中Dmrt1基因主要在腦、垂體、心臟、脾臟和肌肉表達(dá)，在腎臟和腸道中有微弱的表達(dá)，在性腺和肝臟中未檢測(cè)到表達(dá)。無論在雌性或者雄性個(gè)體中，都有明顯的組織表達(dá)差異。Dmrt1基因在雄性性腺中表達(dá)量在一個(gè)較高的水平。

圖2 不同脊椎動(dòng)物Dmrt1氨基酸系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of Dmrt1 amino acid sequences in different vertebrates節(jié)點(diǎn)上的數(shù)字表示重復(fù)1000次的自展(Bootstrap)檢驗(yàn)置信值.The numbers on the node is the exhibition (Bootstrap) test confidence value by repeated 1000 times.

圖3 泰國(guó)斗魚Dmrt1在不同組織中的表達(dá)Fig.3 Expression profile of the Dmrt1 gene in various tissues of Siamese fighting fish B. splendens

2.4 Dmrt1基因在泰國(guó)斗魚胚胎不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)

根據(jù)熒光定量結(jié)果顯示(圖4)，泰國(guó)斗魚Dmrt1基因在早期胚胎發(fā)育過程中自受精卵起一直到孵化期均有表達(dá)，Dmrt1基因在受精卵中的表達(dá)量顯著高于其他各發(fā)育時(shí)期，在卵裂期到桑葚期表達(dá)量較低，在囊胚期表達(dá)量顯著上升，隨后表達(dá)量下降，在原腸胚至心跳期表達(dá)量維持在較低的水平，在孵化期Dmrt1基因的表達(dá)量再次顯著上升。

3 討 論

3.1 泰國(guó)斗魚Dmrt1結(jié)構(gòu)分析

Dmrt1基因參與果蠅、線蟲、脊椎動(dòng)物以及魚類的性別決定過程，在Dmrt1基因序列中存在保守區(qū)域DM結(jié)構(gòu)域，并且均含有與特異DNA結(jié)合的鋅指結(jié)構(gòu)，在泰國(guó)斗魚的Dmrt1基因中也存在DM結(jié)構(gòu)域和鋅指結(jié)構(gòu)，通過序列比對(duì)，泰國(guó)斗魚的Dmrt1基因與其他魚類的Dmrt1基因基本結(jié)構(gòu)一致，并具有進(jìn)化保守性。

圖4 胚胎發(fā)育過程中泰國(guó)斗魚Dmrt1的表達(dá)Fig.4 Expression of Dmrt1 at different development stages of embryo in Siamese fighting fish B. splendens 1.受精卵； 2. 8細(xì)胞期； 3.桑葚期； 4.低囊胚期； 5.原腸胚期； 6.眼囊期； 7.尾芽期； 8.心跳期； 9.孵化期.1.fertilized eggs; 2.eight cell stage; 3.morula stage;4.late blastula stage; 5.gastrula stage; 6.optic capsule stage;7.tail bud stage; 8.heartbeating stage; 9.hatching period.

3.2 Dmrt1基因的表達(dá)模式及功能

Kobayashi等[14]在研究Dmrt1基因在青鳉性腺分化中的表達(dá)位點(diǎn)和表達(dá)形式時(shí)發(fā)現(xiàn)，Dmrt1能夠調(diào)控精原細(xì)胞的分化。在半滑舌鰨[15]的成年魚中，Dmrt1基因只在雄性精巢中有特異表達(dá)，在其他組織均無表達(dá)。Guan等[16]在尼羅羅非魚的精巢中分離出了Dmrt1基因，組織特異性表達(dá)檢測(cè)Dmrt1基因只在成體精巢中表達(dá)，用雄激素處理遺傳上XX型幼魚，使其發(fā)生性逆轉(zhuǎn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，性腺中也有Dmrt1基因表達(dá)。李法君等[17]研究表明，Dmrt1基因在青鳉、比目魚(Cleisthenesherzensteini)和半滑舌鰨3種魚類的性腺發(fā)育過程中均發(fā)揮著重要作用。Huang等[18]發(fā)現(xiàn)Dmrt1基因在黃鱔組織中表達(dá)具有特異性，主要在精巢、精卵巢和卵巢，即生殖細(xì)胞中表達(dá)。Kobayashi等[19]發(fā)現(xiàn)，在雌、雄異體的尼羅羅非魚中，Dmrt1基因主要在輸精管中的支持細(xì)胞、上皮細(xì)胞中表達(dá)。這也說明Dmrt1基因的表達(dá)存在組織特異性，可能與性別的發(fā)育存在一定的聯(lián)系。本試驗(yàn)中，Dmrt1基因在泰國(guó)斗魚的表達(dá)與上述的組織表達(dá)情況基本相似，說明Dmrt1基因在泰國(guó)斗魚中也存在組織表達(dá)特異的情況，并且與雄性的發(fā)育或精子形成存在某種聯(lián)系。

在Dmrt1基因研究中，存在一種劑量假說。雞Dmrt1基因研究顯示，Dmrt1基因在雄性中的高劑量或高表達(dá)量開啟性腺的睪丸發(fā)育，而在雌性中的低劑量或者低表達(dá)量開啟性腺的卵巢發(fā)育[20]。暗示Dmrt1基因在雞中的表達(dá)量直接影響其性別的分化。小鼠Dmrt1基因功能的研究顯示，Dmrt1基因決定了睪丸支持細(xì)胞的分化、生殖細(xì)胞的輻射狀遷移、生殖細(xì)胞減數(shù)分裂和曲精細(xì)管的形成[21]。這也意味著Dmrt1基因在小鼠的性別分化上起著重要的作用，可能決定著雄性的發(fā)育。

Dmrt1基因在黃河鯉(Cyprinuscarpio)[22]、河川沙塘鱧(Odontobutispotamophilus)[23]和香魚(Plecoglossusaltivelis)[24]不同胚胎時(shí)期均有表達(dá)，其表達(dá)量隨著胚胎發(fā)育呈先升后降的趨勢(shì)，在原腸胚時(shí)期達(dá)到峰值。同樣Dmrt1 基因在泰國(guó)斗魚各胚胎發(fā)育過程均有表達(dá)，推測(cè)該基因在泰國(guó)斗魚胚胎發(fā)育過程中扮演著重要角色，在各時(shí)期表達(dá)結(jié)果相類似，同樣先升后降，但其在囊胚期表達(dá)量顯著上升，這與斜帶石斑魚(Epinepheluscoioides)[25]的表達(dá)結(jié)果一致，在硬骨魚中，原始生殖細(xì)胞(PGCs)最早發(fā)現(xiàn)于原腸胚時(shí)期，且原腸期與原始生殖細(xì)胞的產(chǎn)生有關(guān)[26-27]，推測(cè)該基因在囊胚期高表達(dá)可能為形成生殖細(xì)胞做好準(zhǔn)備，泰國(guó)斗魚Dmrt1基因在孵化期呈現(xiàn)高表達(dá)量，推測(cè)該基因可能參與器官的形成，在受精卵有很高的表達(dá)量可能來自父本精液的殘存。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)克隆的泰國(guó)斗魚Dmrt1基因所編碼的蛋白序列有典型的Dmrt1基因結(jié)構(gòu)特征，進(jìn)化上與龜殼攀鱸Dmrt1基因同源性高。組織分布和胚胎發(fā)育過程中的表達(dá)模式表明，Dmrt1基因可能在調(diào)控泰國(guó)斗魚雄性個(gè)體的生殖發(fā)育和胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用，Dmrt1基因與泰國(guó)斗魚的性腺分化是否有關(guān)，以及具體調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步研究。