袁高亮，朱 雷，孔祥會

( 河南師范大學 水產(chǎn)學院，河南 新鄉(xiāng) 453007 )

隨著全球集約化、工廠化養(yǎng)殖程度的不斷提高，魚類病害也急劇增加，每年因水產(chǎn)養(yǎng)殖病害問題而造成的直接經(jīng)濟損失超過百億元，給各國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展帶來巨大威脅。疫苗能夠有效地提高水產(chǎn)動物的免疫力，不但能預防水產(chǎn)動物疾病大規(guī)模暴發(fā)，而且還能減少化學類藥物的使用和降低對環(huán)境的污染，對于助推水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)綠色和可持續(xù)發(fā)展具有重要意義[1-2]。免疫接種疫苗是防治魚病非常有效的措施，其中漁用口服疫苗具有成本低、易接種、適用于不同規(guī)格的水產(chǎn)動物等優(yōu)點，一直是國內外水產(chǎn)疫苗的研究熱點[3]。然而，由于漁用口服疫苗易在胃、腸道中受到胃酸和消化酶作用而降解，免疫原性遭到嚴重破壞，保護率達不到預期效果[4]。因此，如何將口服疫苗安全高效地遞送到目的部位，使其在體內保持較長時間且不被降解，從而有利于誘發(fā)機體的免疫應答反應，并達到增強免疫的效果，已成為口服疫苗研發(fā)的關鍵。

安全高效的遞送系統(tǒng)是漁用口服疫苗發(fā)揮功能的基礎和保障，疫苗遞送系統(tǒng)是一類借助載體的疫苗導入系統(tǒng)，疫苗遞送系統(tǒng)可將抗原安全遞送到后腸而不受消化系統(tǒng)的破壞，使其吸收后被免疫細胞識別并誘發(fā)免疫應答反應，是漁用口服疫苗發(fā)揮功能的保障。目前研究較多的疫苗遞送系統(tǒng)主要包括兩大類：化學載體遞送系統(tǒng)和生物載體遞送系統(tǒng)。其中，化學載體遞送系統(tǒng)種類主要包括天然高分子聚合物和合成高分子聚合物，天然高分子聚合物又包括海藻酸鹽、殼聚糖[5]與脂質體等；而合成高分子聚合物主要包括聚乳酸羥基乙酸共聚物(PLGA)和聚乳酸聚乙二醇共聚物(PELA)等。生物載體遞送系統(tǒng)種類包括細菌、真菌、昆蟲與植物等，其中，細菌主要有大腸桿菌(Escherichiacoli)、乳酸桿菌(Lactobacillus)和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)等，應用較多的昆蟲載體包括甜菜夜蛾和家蠶等，植物載體包括藻類、煙草和水稻等。疫苗遞送技術研發(fā)為口服疫苗的發(fā)展提供了有力的技術支撐，從而加快漁用疫苗的推廣和應用，對于水產(chǎn)健康養(yǎng)殖和可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。筆者主要從漁用口服疫苗遞送系統(tǒng)的概況與種類兩個方面對近年來漁用口服疫苗遞送系統(tǒng)的相關研究進展進行綜述，以期為進一步研究新型高效的漁用口服疫苗遞送系統(tǒng)提供參考依據(jù)。

1 漁用口服疫苗遞送系統(tǒng)的概況

從動物福利、方便程度、成本節(jié)省等角度考慮，口服接種都是水產(chǎn)動物比較理想的免疫接種方式。早在1942年，Duff[6]就成功研發(fā)了殺鮭氣單胞菌(Aeromonassalmonicida)的滅活口服疫苗，拉開了口服疫苗防控水產(chǎn)動物疾病的序幕。但相比較人用和獸用的口服疫苗研究，漁用口服疫苗的發(fā)展較為緩慢。20世紀末期，研究人員嘗試開發(fā)遞送漁用口服疫苗的載體，以確保疫苗到達后腸，提高免疫保護率[7]。隨著工業(yè)的發(fā)展和制備工藝的創(chuàng)新，化學遞送載體在人類生物制品制備領域的研發(fā)和應用逐漸成熟，有效地避免了口服疫苗在胃或前腸被降解，同時也增強了疫苗有效成分的遞呈作用。1995年Boudinot等[8]開展了聚乳酸—羥基乙酸共聚物納米微球遞送漁用口服疫苗的研究，這是合成高分子聚合物作為水產(chǎn)疫苗遞送載體的首次嘗試，2年后，天然高分子聚合物海藻酸鹽也被用作水產(chǎn)動物口服疫苗的遞送載體，以保護疫苗不被消化道降解[9]。進入21世紀后，隨著水產(chǎn)動物免疫學和基因工程技術的發(fā)展，生物載體也逐漸用在漁用口服疫苗的生產(chǎn)和遞送中。其中，植物載體最早在2005年應用于水產(chǎn)口服疫苗，Companjen等[10]將馬鈴薯作為表達和遞送載體，成功表達了綠色熒光蛋白和大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位融合蛋白，用該遞送載體口服免疫鯉魚(Cyprinuscarpio)，能引起特異性免疫反應。2007年，首次報道了草魚(Ctenopharyngodonidellus)呼腸孤病毒內衣殼非融合蛋白VP6和增強型綠色熒光蛋白在桿狀病毒/甜菜夜蛾細胞中的表達，為昆蟲載體的研發(fā)應用提供了技術支撐[11]。近年來，隨著人們對魚體免疫系統(tǒng)尤其是腸黏膜免疫的深入了解以及生物工程技術的快速發(fā)展，越來越多不同類型的遞送載體在漁用口服疫苗上應用[12-13]。目前研究較多的漁用口服疫苗遞送載體主要包括天然高分子聚合物、合成高分子聚合物、細菌(益生菌)、真菌、病毒/昆蟲與植物等，且不同種類的遞送載體各有優(yōu)缺點(表1)。

表1 不同類型漁用口服疫苗遞送載體的優(yōu)缺點比較

2 漁用口服疫苗遞送系統(tǒng)的種類

2.1 化學載體遞送系統(tǒng)

化學載體遞送系統(tǒng)主要依賴可生物降解微球(微囊)的作用，其原理在于微囊降解速度緩慢，使口服疫苗避免胃酸和消化酶的破壞，減少接種次數(shù)，增強免疫應答[14]。隨著新型材料的發(fā)現(xiàn)和微囊包封工藝的不斷創(chuàng)新和成熟，漁用微囊口服疫苗已經(jīng)在實驗室內取得了較好的免疫效果，微囊分為天然高分子聚合物和合成高分子聚合物兩種[15]。

2.1.1 天然高分子聚合物載體

海藻酸鹽[16]、殼聚糖與脂質體等天然高分子聚合物均是口服疫苗遞送載體的合適選擇。其中，海藻酸鹽、殼聚糖是受關注度最高的陰離子型和陽離子型天然高分子聚合物[17-18]，其優(yōu)點包括價格低、無毒、可生物降解、生物相容性好等。通過天然高分子聚合物對疫苗進行吸附、包裹或鍵合，不僅可以避免胃酸和消化酶對抗原的破壞，而且有利于控制疫苗的釋放速度[19]。但天然高分子聚合物也有缺點，比如包封時會有污染物存在，且疏水性差，同批間的質量不均一等[20]。

近年來，天然高分子聚合物已應用在傳染性造血組織壞死病病毒、魚類淋巴囊腫病毒、傳染性胰腺壞死病毒、嗜水氣單胞菌(A.hydrophila)、殺鮭氣單胞菌、海豚鏈球菌(Streptococcusiniae)等病原的口服疫苗包封[21-27]。Ballesteros等[21]研制了虹鱒(Oncorhynchusmykiss)的微囊化傳染性造血組織壞死病病毒疫苗，有效避免了疫苗在胃腸內的降解，且免疫后虹鱒體內IgM、IFN-1和Mx-1等相關免疫基因的表達出現(xiàn)明顯上調，免疫組相對存活率提高至56%。用海藻酸鈉將滅活嗜水氣單胞菌疫苗包裹后口服免疫異育銀鯽(Carassiusauratusgibelio)，結果顯示，口服微囊化疫苗的相對存活率為61.1%，高于對照組的50%[22]。經(jīng)修飾的殺鮭氣單胞菌重組蛋白包埋在海藻酸鹽中，口服藻酸鹽疫苗后可明顯提高鯽魚(Carassiusauartus)血清的抗體效價[23]。Tian等[24]制備了魚類淋巴囊腫病毒的微囊疫苗，證明海藻酸鹽是口服疫苗的良好遞送載體，在保護疫苗不被破壞的同時，也能引起魚體的免疫反應。此外，也有同時用兩種包封材料作為遞送系統(tǒng)的，如選用廣泛用于控制口服疫苗釋放的海藻酸鹽和殼聚糖作為海豚鏈球菌口服疫苗的復合遞送載體，優(yōu)化了制備微球和包封的條件，使包封率達到92.38%，并在體內和體外對疫苗穩(wěn)定性和安全性進行了評價[25]。Halimi等[26]采用電離層凝膠化將海藻酸鹽和殼聚糖混合后包封格式乳球菌(L.garvieae)和海豚鏈球菌疫苗，免疫虹鱒后，兩種疫苗的免疫保護率分別達到66.67%和76.67%，均比非包封疫苗對照組高。然而，用海藻酸鈉包封的鯉春病毒血癥病毒DNA疫苗未達到預期保護率，與對照組相比甚至加速了鯉魚死亡，分析原因可能是海藻酸鹽的接種劑量或接種程序不適宜[27]。

天然高分子聚合物適合作為口服疫苗的遞送系統(tǒng)，在口服過程中可以起到保護疫苗和緩釋作用，并且將不同材料聯(lián)合使用效果將會更好。但是，不同口服疫苗所需包封基質應針對魚的種類和特定病原體進行相應調整，且接種次數(shù)和劑量仍需進一步研究。

2.1.2 合成高分子聚合物載體

目前，研究較多的合成高分子聚合物主要有聚乳酸—羥基乙酸共聚物和聚乳酸—聚乙二醇共聚物等。高銘蔚等[28]用聚乳酸—羥基乙酸共聚物包裹無乳鏈球菌(S.agalactiae)滅活疫苗免疫尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)，其產(chǎn)生的抗體可在高水平維持較長時間。Kole等[29]同樣用聚乳酸—羥基乙酸共聚物作為遞送系統(tǒng)對滅活病毒性出血性敗血癥病毒疫苗進行包封，試驗中先將兩個試驗組的褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)進行浸泡接種，兩周后再用同等劑量的疫苗分別進行了浸泡接種和口服接種，結果顯示，免疫組血清、皮膚黏液和腸道黏液中特異性抗體滴度在免疫后均升高，且相關免疫基因的表達水平也顯著上調，攻毒后相對存活率浸泡/口服組為73.3%，高于浸泡/浸泡組的60%。Ma等[30]初步評價了殼聚糖和聚乳酸—羥基乙酸共聚物遞送載體對海豚鏈球菌疫苗的保護效果，口服微囊疫苗組的羅非魚脾臟和腎臟中部分細胞因子(IL-1β, TNF-α, CC1和 CC2)基因表達水平顯著上調，且不同免疫劑量的相對保護率為41.67%～95.83%。以上研究結果表明，聚乳酸—羥基乙酸共聚物對口服疫苗可起到緩釋作用，并具有較好免疫效果。

化學載體遞送系統(tǒng)可保護抗原成分免受消化液破壞，并能產(chǎn)生較好免疫效果，但也存在一些問題。首先，包封材料大多價格昂貴，且關鍵配方和工藝參數(shù)均可影響口服疫苗的保護效果[31]；其次，漁用口服疫苗化學載體的研究不夠深入，主要借鑒畜禽的劑量和種類，但由于水生生物腸道黏膜免疫系統(tǒng)的特殊性，往往達不到理想的效果。這些均需在以后的研究中加以優(yōu)化，研發(fā)出高效、便捷、易于推廣的漁用疫苗化學載體遞送系統(tǒng)。

2.2 生物載體遞送系統(tǒng)

生物載體遞送系統(tǒng)是指能保護和增強疫苗攝入，且具有生物活性的載體，多指天然的生物餌料或益生菌，此類載體大多兼具高效表達外源蛋白的功能。生物載體遞送系統(tǒng)相比其他遞送系統(tǒng)具有雙重優(yōu)勢，不僅抗原呈遞的有效性較高，且能表達外源抗原，簡化了疫苗制備和使用程序，但通過生物載體表達的蛋白一般效率不高。因此，篩選高效表達的生物載體是未來研究的重點。目前，細菌、真菌、病毒、昆蟲和植物[32]等已陸續(xù)被選用為生物載體。

2.2.1 細菌載體

大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、乳酸乳球菌等是生產(chǎn)亞單位疫苗中最廣泛的蛋白表達和傳遞系統(tǒng)，其中益生菌也常作為餌料添加劑應用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)，并且已被證實能起到很好地防治疾病和提高免疫力的作用[33]。來自水產(chǎn)動物腸道的一些益生菌能定殖于腸道，一次接種便可長期免疫，且益生菌可改善魚體消化功能，提高其生長效率，從而獲得較好的經(jīng)濟效益，相比其他細菌，更適合作為漁用口服疫苗的遞送載體。

大腸桿菌作為經(jīng)典的原核表達系統(tǒng)，在重組亞單位疫苗的研發(fā)和生產(chǎn)中應用較多，其中Daniel等[34]用大腸桿菌成功表達了病毒性神經(jīng)壞死病毒的衣殼蛋白，結果顯示，口服免疫組的魚血清中特異性抗體滴度顯著上調，免疫保護率達100%。此外，草魚口服含有草魚呼腸孤病毒VP5或VP7蛋白的滅活大腸桿菌，對草魚也具有很好的保護作用[35]。

乳酸菌安全無毒，環(huán)境脅迫抗逆性高，其表面表達的一些抗原可作為天然的免疫佐劑。此外，乳酸菌的外源基因容量大，部分種類可定殖于腸道，是一種理想的基因工程口服疫苗的載體，目前乳酸桿菌屬和乳球菌屬作為疫苗傳遞系統(tǒng)的相關研究最多[36-38]。Cui等[39]選用植物乳酸桿菌制備并遞送鯉春病毒血癥病毒疫苗與錦鯉皰疹病毒疫苗，經(jīng)口服免疫鯉魚和錦鯉(C.carpiokoi)后，可改善魚體消化功能，激發(fā)魚體產(chǎn)生特異性抗體，且免疫組的免疫保護率分別為71%和53%。還有學者分別將維氏氣單胞菌(A.veronii)外膜蛋白AI(OmpAI)和W(OmpW)在干酪乳酸桿菌中表達，并以口服的形式免疫鯉魚，結果免疫組保護率為40%～66.7%[40-41]。另外，Zhao等[42]將牙鲆彈狀病毒的糖蛋白成功表達于乳酸乳球菌細胞表面，實現(xiàn)了對牙鲆彈狀病毒較強的免疫保護作用，免疫保護率達60.7%。綜上可知，目前乳酸菌作為口服疫苗遞送系統(tǒng)，針對細菌或病毒等不同類型病原均適用，但免疫保護率相比注射疫苗較低，其具體免疫程序仍需進一步研究。

此外，也有枯草芽孢桿菌被用作口服疫苗遞送載體的研究，如將草魚呼腸孤病毒S6編碼的外衣殼蛋白VP4與枯草芽孢桿菌的衣殼蛋白CotC基因融合，制備成口服疫苗，用該疫苗免疫草魚，發(fā)現(xiàn)可在草魚腸道引發(fā)先天性和特異性免疫，且免疫保護率達到57%[43]。Yao等[44]用枯草芽孢桿菌制備的無乳鏈球菌疫苗，對羅非魚進行口服免疫，ELISA檢測顯示免疫的魚血清中有特異性抗體，攻毒后免疫保護率達到41.7%。

以上研究表明，細菌(尤其是益生菌)不僅可以促進魚體消化，且能引發(fā)先天性和適應性免疫，適用于口服疫苗遞送系統(tǒng)。但是免疫保護率相對較低，針對不同病原體沒有具體的免疫程序，且具體的免疫機制研究較少，需進一步研究。

2.2.2 真菌載體

相比具有原核表達系統(tǒng)的細菌，酵母菌等真菌的真核表達系統(tǒng)所表達的外源蛋白免疫原性更好，更容易激發(fā)機體的免疫反應。酵母具有繁殖快、適口性好、易于進行基因操作等優(yōu)點，其作為漁用口服疫苗的載體，不僅改善了一般口服疫苗適口性差的缺點，而且也延長了疫苗在水產(chǎn)動物體內產(chǎn)生免疫力的持續(xù)時間。目前，酵母已被證明可以表達外源蛋白并將其安全遞送到多個物種的黏膜免疫系統(tǒng)[45-49]。水產(chǎn)上用于口服疫苗遞送系統(tǒng)的酵母主要有釀酒酵母和畢赤酵母。有研究證明，鯽魚口服含綠色熒光蛋白載體的釀酒酵母可以在后腸高效表達綠色熒光蛋白，隨后以卵清蛋白為免疫原，構建含不同表達載體(在腸道上皮細胞中表達和在酵母細胞中表達)的重組釀酒酵母，結果檢測到所有口服免疫組均有特異性血清抗體，且前者比后者引起的免疫反應更強[50]。研究結果表明，釀酒酵母可作為口服疫苗的載體，為口服疫苗的安全遞送提供了新的思路。Han等[51]初步評價了用重組釀酒酵母制備的嗜水氣單胞菌口服疫苗對鯽魚的保護效果，通過免疫組織化學檢測到鯽腸道黏膜表達抗原蛋白基因，且特異性抗體顯著增加，攻毒后累計死亡率為46.7%，相比對照組有了明顯的下降。Cho等[52]用重組釀酒酵母表達的神經(jīng)壞死病毒的衣殼蛋白作為疫苗口服灌喂七帶石斑魚(Epinephelusseptemfasciatus)，攻毒后重組酵母破碎組和重組酵母非破碎組免疫保護率分別為96.5%和75%，結果表明，以酵母作為生產(chǎn)和遞送載體，經(jīng)口服免疫后對石斑魚保護效果較好，并且重組酵母的狀態(tài)對免疫效果有一定的影響。此外，也有嘗試用畢赤酵母作為口服疫苗的遞送載體，將含有綠色熒光蛋白的畢赤酵母飼喂鯉魚和虹鱒，經(jīng)檢測，鯉魚在口服24 h后，前腸和中腸有綠色熒光，虹鱒在口服僅6 h后前腸、中腸和后腸均可檢測到綠色熒光，表明利用畢赤酵母作為遞送載體，均可將抗原完整地傳遞到不同魚腸黏膜上皮細胞[53]。綜上所述，酵母表達和遞送系統(tǒng)操作簡單，易于大規(guī)模生產(chǎn)，相比原核表達系統(tǒng)遞送的疫苗性質更穩(wěn)定，免疫原性更高，適于作為口服疫苗的傳遞系統(tǒng)，而且酵母又是天然的飼料添加劑，具有適應各種魚類消化道環(huán)境的特性，有助于在水產(chǎn)養(yǎng)殖中開發(fā)和應用。

2.2.3 病毒/昆蟲載體

桿狀病毒/昆蟲細胞表達系統(tǒng)經(jīng)過近30年的發(fā)展已成為重組蛋白生產(chǎn)的重要平臺，也是口服疫苗的主要遞送系統(tǒng)之一。目前已廣泛應用于人用疫苗和獸用疫苗生產(chǎn)上，但在漁用疫苗上還處于實驗室研究階段。桿狀病毒可單獨作為遞送載體，直接進入哺乳動物和魚類細胞。Li等[54]利用桿狀病毒作為遞送載體制備鯉皰疹病毒疫苗，經(jīng)注射和口服對異育銀鯽進行免疫，結果口服免疫組的相對保護率為59.3%，注射免疫組的相對保護率為80%。昆蟲也可單獨作為口服疫苗的遞送系統(tǒng)[55-56]。目前研究較多的是利用桿狀病毒作為載體導入昆蟲體內表達抗原蛋白，制成凍干粉口服免疫魚類，例如，將含有草魚呼腸孤病毒VP6的重組桿狀病毒導入蠶中，在120 h后將其制成凍干粉口服疫苗，當飼喂含1%、5%、10%的凍干粉飼料時，可檢測到草魚血清中有VP6的特異性抗體[57]。綜上所述，桿狀病毒、昆蟲及桿狀病毒/昆蟲細胞表達系統(tǒng)均可作為口服疫苗遞送系統(tǒng)進一步開發(fā)利用，但由于生產(chǎn)條件和技術要求較高，會導致生產(chǎn)成本增加，影響漁用口服疫苗的推廣使用。

2.2.4 植物載體

隨著交叉學科的應用，尤其是近年來分子免疫學和基因工程技術的發(fā)展，在過去的10年中，利用植物作為抗原生產(chǎn)系統(tǒng)受到了廣泛的關注。植物載體的優(yōu)點在于易于規(guī)模化生產(chǎn)、成本低等，其已成為國際上新型高技術疫苗研究的趨勢[58]。目前，利用轉基因植物生產(chǎn)漁用疫苗已有報道[59]。轉基因植物疫苗通常指用一種或多種病原的保護性蛋白整合進植物表達載體，使其在可食性植物中表達，使水產(chǎn)動物攝食時獲得免疫。植物細胞是天然的生物膠囊，作為遞送系統(tǒng)可減少口服疫苗在水產(chǎn)動物消化道內的降解，并且具有抗原活性高，無需純化蛋白可直接使用等優(yōu)點[60]。在畜禽方面，Aleksey等[61-62]將目標肽(禽流感病毒H5N1的M2e肽)與不同載體蛋白融合在浮萍中獲得了較高水平的表達，口服免疫小鼠后檢測出其體內出現(xiàn)特異性抗體。該研究結果證明了禽流感病毒M2e在核轉化浮萍中表達的可行性，為開發(fā)基于浮萍表達遞送系統(tǒng)的漁用口服疫苗提供參考。 Seong等[63]將神經(jīng)壞死病毒的衣殼蛋白在煙草葉綠體中成功表達，對小鼠和斑馬魚進行口服免疫，隨后在小鼠和斑馬魚體中檢測出特異性抗體。利用水稻愈傷組織制備和遞送的條石鯛虹彩病毒和草魚呼腸孤病毒口服疫苗，可成功誘導黏膜免疫[64-65]。以上研究表明，以植物為表達系統(tǒng)生產(chǎn)和遞送漁用口服疫苗具有可行性，且植物表達遞送系統(tǒng)相對其他遞送系統(tǒng)生產(chǎn)條件最簡單，能最大程度降低成本，操作方便，尤其針對草食性魚類無需加工可直接口服免疫，為進一步推動口服疫苗的應用提供了強有力的技術支撐，是目前國內外研究的熱點之一，但利用植物表達遞送系統(tǒng)進行漁用疫苗的導入和應用仍需深入研究。

3 總結與展望

水產(chǎn)動物疾病的頻發(fā)已成為水產(chǎn)動物健康養(yǎng)殖和可持續(xù)發(fā)展的瓶頸，由于水產(chǎn)動物所處環(huán)境的特殊性，采用常規(guī)的注射接種免疫較為繁瑣且成本較高，口服免疫是一種較為方便的免疫方式。漁用口服疫苗在水產(chǎn)養(yǎng)殖中有著廣闊的應用前景，口服疫苗的應用受接種對象規(guī)格大小、接種時間和次數(shù)等限制較少。利用口服疫苗對水產(chǎn)動物進行免疫不僅有效避免了由于注射引起的機體應激反應和機械損傷，而且可以減少人力和物力的投入，降低養(yǎng)殖成本，在養(yǎng)殖生產(chǎn)中易于推廣和應用。但其缺點也較為明顯：易受消化液的破壞，抗原免疫性下降，免疫保護率低等?？诜呙邕f送載體的應用可減少疫苗在胃腸道的降解，并且使抗原物質能夠緩慢而持久地釋放，以便達到更好的免疫效果。雖然目前遞送載體的種類較多，但大多處于研發(fā)的初級階段，尚不能滿足實際應用需求。因此，今后漁用口服疫苗的研究重點應是研發(fā)價格低廉、保護效果好的遞送載體以及不同載體的聯(lián)合使用。此外，口服免疫時合理的免疫劑量、適宜的免疫時間及次數(shù)等仍需要進一步優(yōu)化，以提高疫苗免疫保護率，從而防控魚類疾病發(fā)生，確保水產(chǎn)動物健康養(yǎng)殖和可持續(xù)發(fā)展。