丁秀瓊，黃 武，劉建芳，雷曉凌，麥嘉惠，黃健勇，聶芳紅

( 1.湛江海關(guān)技術(shù)中心，廣東 湛江 524000； 2.廣東海洋大學(xué) 食品科技學(xué)院，廣東 湛江 524088；3.廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524088； 4.水產(chǎn)品深加工廣東普通高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524088 )

亞歷山大·弗萊明于1928年發(fā)現(xiàn)青霉對(duì)某些細(xì)菌生長(zhǎng)具有抑制性，1939年霍華德·威廉·佛洛里和鮑里斯·錢恩首次提純了青霉素并于1944年得以公開使用[1]?？咕幬锏陌l(fā)現(xiàn)為保證人類健康發(fā)揮了重要作用，但由于這類藥物在臨床治療、畜牧業(yè)、水產(chǎn)養(yǎng)殖等方面的不合理使用甚至濫用，致使多重耐藥細(xì)菌甚至超級(jí)耐藥菌出現(xiàn)，嚴(yán)重威脅公共健康?！度蚩咕啬退幓仡櫋穂2]報(bào)告指出，全球每年有70萬人因?yàn)槟退幬⑸锒劳?，預(yù)計(jì)到2050年，死亡數(shù)字會(huì)飆升到1000萬，甚至超過癌癥的死亡率。耐藥細(xì)菌會(huì)通過多種方式進(jìn)入環(huán)境，隨后遷移到人類身上[3]。耐藥基因在同種或不同種屬細(xì)菌間轉(zhuǎn)移傳播使得細(xì)菌耐藥性得以迅速產(chǎn)生及擴(kuò)散[4-5]。細(xì)菌耐藥性已成為全球公共衛(wèi)生領(lǐng)域最復(fù)雜的威脅。

常見的多重耐藥譜以耐β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、四環(huán)素類、氯霉素類、磺胺和氟喹諾酮類藥物為主。細(xì)菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類藥物產(chǎn)生耐藥的主要機(jī)制是細(xì)菌產(chǎn)生了β-內(nèi)酰胺酶，該酶水解本類藥物的抗菌活性基團(tuán)(β-內(nèi)酰胺環(huán))導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)該類藥物產(chǎn)生耐藥。由質(zhì)粒介導(dǎo)的超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBL)具有更廣的水解譜，攜帶該類ESBLs基因(主要為TEM型、CTX型、OXA型及SHV型)的細(xì)菌常呈現(xiàn)多重耐藥表型，且易于在不同種屬細(xì)菌之間隨著耐藥質(zhì)粒的移動(dòng)而散播[5]。大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)中最常見的是攜帶CTX-M基因的質(zhì)粒，已在中國(guó)及歐洲多個(gè)國(guó)家的人和其他動(dòng)物體內(nèi)檢測(cè)到[6]。質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮耐藥(PMQR)自1998年在美國(guó)肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)[7]中發(fā)現(xiàn)以來，在大腸埃希氏菌、假單胞菌(Pseudomonas)、弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacterfreundii)、沙門氏菌(Salmonella)、奇異變形桿菌(Proteusmirabilis)等越來越多的細(xì)菌中得到證實(shí)[6,8-12]。目前已報(bào)道的質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類耐藥機(jī)制主要有3類，即qnr家族、aac(6′)-Ib-cr和喹諾酮類藥物特異性外排泵qepA[13]。大腸埃希氏菌中最常見的是攜帶qnr基因的質(zhì)粒，已在中國(guó)、法國(guó)、德國(guó)、丹麥、阿根廷、墨西哥等國(guó)家的人和動(dòng)物體內(nèi)檢測(cè)到[6]。PMQR基因介導(dǎo)低水平耐藥，但在喹諾酮類藥物的選擇壓力下會(huì)導(dǎo)致高水平耐藥性的產(chǎn)生[8]。而且攜帶PMQR基因的質(zhì)粒通常還攜帶其他耐藥基因(如ESBLs基因)，它們共同轉(zhuǎn)移使受體細(xì)菌表現(xiàn)為對(duì)多種抗菌藥物耐藥[5,9,14-15]。

大腸埃希氏菌廣泛分布于人類和溫血?jiǎng)游锏哪c道內(nèi)，通常對(duì)宿主無害[16]。但目前研究發(fā)現(xiàn)，大腸埃希氏菌耐藥性已十分嚴(yán)重[13,17-18]，并因其常攜帶質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子和整合子等移動(dòng)遺傳元件，在抗性基因的傳播中發(fā)揮重要作用[19-20]。世界衛(wèi)生組織制定了《遏制抗微生物藥物耐藥性的全球戰(zhàn)略》，并已在全球范圍啟動(dòng)了若干監(jiān)測(cè)系統(tǒng)，以收集用于今后抗生素耐藥性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，建議監(jiān)測(cè)的物種包括大腸埃希氏菌[21]。所以大腸埃希氏菌的耐藥性及耐藥性基因攜帶情況調(diào)查研究具有重要意義。

我國(guó)是世界水產(chǎn)養(yǎng)殖大國(guó)，2018年總水產(chǎn)養(yǎng)殖量超過5.0×107t，水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)量占世界總量的78%以上，是世界上唯一養(yǎng)殖水產(chǎn)量超過捕撈總量的國(guó)家[22]。隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展，養(yǎng)殖用藥量也隨之增加。水環(huán)境及水生動(dòng)物體內(nèi)的細(xì)菌已發(fā)展出耐藥性，成為耐藥基因的儲(chǔ)藏地，嚴(yán)重影響我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖的可持續(xù)發(fā)展[23-25]。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于水產(chǎn)品中大腸埃希氏菌耐藥情況的報(bào)道較少[26-30]，而湛江地區(qū)尚未見相關(guān)報(bào)道。筆者通過對(duì)湛江地區(qū)水產(chǎn)品中大腸埃希氏菌耐藥情況的檢測(cè)分析，查明其耐藥基因類型，旨在為指導(dǎo)水產(chǎn)養(yǎng)殖合理用藥、水產(chǎn)品安全評(píng)價(jià)及抗生素耐藥性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源

近江牡蠣(Crassostreaariakensis)、翡翠貽貝(Pernaviridis)、菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum)、文蛤(Meretrixmeretrix)、華貴類櫛孔扇貝(Mimachlamysnobilis)等鮮活樣品均購自湛江某水產(chǎn)市場(chǎng)，產(chǎn)地湛江。樣品購買后充氧并在1 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室備檢。凍羅非魚片、凍熟對(duì)蝦仁等冷凍樣品為本實(shí)驗(yàn)室日常檢測(cè)樣品及湛江某水產(chǎn)公司提供。采樣時(shí)間為2012年11月—2013年1月、2015年7月—2016年8月。按照GB 4789.38—2012《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸埃希氏菌計(jì)數(shù)》[31]的方法進(jìn)行檢測(cè)，必要時(shí)用VITEK2全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)進(jìn)一步鑒定確認(rèn)。從686份樣品中共檢測(cè)得到52株大腸埃希氏菌(表1)。

表1 52株大腸埃希氏菌分離株編號(hào)及來源

1.1.2 主要試劑

二水合氯化鋇、丙三醇、氯化鈉、濃硫酸(廣東光華科技股份有限公司)；營(yíng)養(yǎng)瓊脂、營(yíng)養(yǎng)肉湯、Mueller-Hinton瓊脂(MHA瓊脂，北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司)；Taq聚合酶(南京諾唯贊生物科技有限公司)；耐藥基因上下游引物(上海生工生物科技有限公司合成)；GeneGreen核酸染料、100 bp DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(天根生化科技有限公司)。

21種藥敏紙片包括：青霉素類，哌拉西林(PRL，100 μg/片)；青霉素類+酶抑制劑，阿莫西林/克拉維酸(AMC，30 μg/片)；喹諾酮類，環(huán)丙沙星(CIP，5 μg/片)、氧氟沙星(OFX、5 μg/片)、諾氟沙星(NOR，5 μg/片)、左氧氟沙星(LEV，5 μg/片)、萘啶酸(NA，30 μg/片)；單環(huán)內(nèi)酰胺類，氨曲南(ATM，30 μg/片)；磺胺類，復(fù)方新諾明(SXT，25 μg/片)；硝基呋喃類，呋喃妥因(F，30 μg/片)；氨基糖苷類，慶大霉素(CN，10 μg/片)、鏈霉素(S，30 μg/片)、阿米卡星(AK，30 μg/片)；四環(huán)素類，四環(huán)素(TE，30 μg/片)；第三代頭孢菌素類，頭孢噻肟(CTX，30 μg/片)、頭孢他啶(CAZ，30 μg/片)；第四代頭孢菌素類，頭孢吡肟(FEP，30 μg/片)；大環(huán)內(nèi)酯類，紅霉素(E，10 μg/片)；酰胺醇類，氯霉素(CHL，30 μg/片)；以上均購自英國(guó)OXOID公司。頭孢+酶抑制劑，頭孢他啶/克拉維酸(CAZ/CLA，30/10 μg/片)、頭孢噻肟/克拉維酸(CTX/CLA，30/10 μg/片)，均購自美國(guó)BD公司。

1.1.3 主要儀器

SW-CJ-1F型潔凈工作臺(tái)(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司)，SPX-250B-G型光照培養(yǎng)箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司)，H1650-W型臺(tái)式高速離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司)，XW-80A型旋渦混合儀(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)，DYY-6C型電泳儀(北京市六一儀器廠)，Hema 9600PCR型基因擴(kuò)增儀(珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司)，Gel Doc XR+型凝膠成像分析儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 藥敏試驗(yàn)

參照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI)制定的翻譯版M100-S23《抗菌藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)(第23版資料增刊)》[32]指導(dǎo)原則和執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)，用K-B紙片擴(kuò)散法測(cè)定52株大腸埃希氏菌對(duì)19種抗菌藥物的敏感性及產(chǎn)ESBLs菌株表型確證試驗(yàn)。在MHA平板上，同時(shí)貼頭孢他啶和頭孢他啶/克拉維酸，頭孢噻肟和頭孢噻肟/克拉維酸。若兩組藥物中任意一組，在加入克拉維酸后，其抑菌圈比未加入克拉維酸的抑菌圈相比，其增大值≥5 mm，即判定該大腸埃希氏菌是產(chǎn)ESBLs菌株，以大腸埃希氏菌ATCC25922作為質(zhì)控菌株。

1.2.2 耐藥基因檢測(cè)

采用煮沸法提取產(chǎn)ESBLs菌株及對(duì)喹諾酮類藥物表現(xiàn)出完全或中度抗性的菌株的總DNA制備模板。采用PCR法，進(jìn)行ESBLs基因(bla TEM、blaSHV、blaCTX、blaOXA)和PMQR基因[qnrA、qnrB、qnrS、qnrC、qnrD、aac(6′)-Ib-c、qepA、oqxA、oqxB]的檢測(cè)。引物參照文獻(xiàn)設(shè)計(jì)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系：模板DNA 2 μL、上游引物(10 μmol/L)1 μL、下游引物(10 μmol/L)1 μL、2×Taq聚合酶體系(含染料)10 μL、ddH2O 6 μL，反應(yīng)體系總體積為20 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，根據(jù)不同引物設(shè)置對(duì)應(yīng)的退火溫度，退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃徹底延伸10 min；4 ℃保溫5 min。引物的核酸序列、終產(chǎn)物長(zhǎng)度、退火溫度見表2。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

表2 ESBLs 及PMQR 基因擴(kuò)增相關(guān)信息

2 結(jié) 果

2.1 耐藥性

52株大腸埃希氏菌分離菌株均至少對(duì)1種及以上抗菌藥物具有耐藥性，對(duì)紅霉素耐藥率最高，其次是復(fù)方新諾明、四環(huán)素、頭孢噻肟、阿莫西林—克拉維酸、氯霉素、氨曲南、頭孢吡肟、頭孢他啶、鏈霉素、萘啶酸、氟苯尼考、哌拉西林，對(duì)氧氟沙星、慶大霉素、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、諾氟沙星耐藥率較低，均對(duì)阿米卡星敏感(表3)。

表3 52株大腸埃希氏菌分離株耐藥情況

52株菌株分別有46個(gè)不同的耐藥表型，其中編號(hào)為C0211、P0711、P0902、P1101、R0111的菌株只對(duì)紅霉素耐藥，編號(hào)為R0612、R1103的菌株對(duì)四環(huán)素、復(fù)方新諾明等4種藥物耐藥，編號(hào)為d14、d18的菌株對(duì)頭孢吡肟、氨曲南等7種藥物耐藥，其余43株菌均有不同的耐藥表型(表4)。

52株菌株中32株對(duì)β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥，10株確證為產(chǎn)ESBLs菌株，檢出率為19.2%(10/52)；檢出15株對(duì)喹諾酮類藥物耐藥菌株，檢出率為28.9%(15/52)；2株菌株為產(chǎn)ESBLs及喹諾酮類藥物耐藥菌株，檢出率為3.8%(2/52)，均分離自文蛤(表4)。

自新鮮貝類中分離的菌株，對(duì)哌拉西林耐藥率最高，其次為氧氟沙星、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、諾氟沙星，對(duì)呋喃妥因敏感；而從冷凍水產(chǎn)品中分離的菌株對(duì)哌拉西林、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星均敏感，均具有對(duì)呋喃妥因的耐藥性?？梢姴煌瑏碓吹姆蛛x菌株對(duì)抗菌藥物的耐藥性有差異(表3)。

76.9%(40/52)的菌株具有多重耐藥性(耐藥種類3～9類)。其中，來自新鮮貝類的菌株占40%，來自冷凍水產(chǎn)品的菌株占60%；8重以上耐藥菌株中冷凍水產(chǎn)品分離菌株占87.5%(7/8)?？梢妬碓从诶鋬鏊a(chǎn)品的分離菌株多重耐藥性較來源于新鮮貝類的分離菌株嚴(yán)重(表4)。

2.2 耐藥基因檢測(cè)

10株產(chǎn)ESBLs大腸埃希氏菌分離株中有8株菌株攜帶1種或2種ESBLs耐藥基因，2株菌株未檢測(cè)出ESBLs耐藥基因；15株喹諾酮類耐藥大腸埃希氏菌分離株均攜帶3種或3種以上PMQR基因。blaTEM基因和blaSHV基因檢出率分別為80%和70%，未檢出blaCTX、blaOXA基因；PMQR基因檢出率為：qnrA、aac(6′)-Ib-c及qepA 100%(15/15)，qnrS 60%(9/15)，oqxB 53.3%(8/15)，qnrD 6.7%(1/15)，未檢出qnrB、qnrC和oqxA基因。結(jié)果表明，blaTEM基因?yàn)?2株大腸埃希氏菌分離菌株中常見ESBLs基因型，qnrA、aac(6′)-Ib-c及qepA基因?yàn)槌Ｒ奝MQR基因型。編號(hào)為M1003和M0612的菌株同時(shí)攜帶ESBLs基因和PMQR基因，分別對(duì)8種及16種抗菌藥物耐藥，為6重耐藥和9重耐藥細(xì)菌，表現(xiàn)出較廣的耐藥譜及多重耐藥表型(表4)。

表4 52株分離菌株的耐藥表型和耐藥基因種類

分離株Isolate來源Source耐藥表型Phenotypic resistance耐藥基因Resistance geneC0511近江牡蠣TE、ATM* 、SXT、PRL*、E、S、CHL/M0521 2文蛤TE、SXT、PRL*、NA#、E、CHL、SqnrA、aac(6')-Ib-c、qepA、oqxBd19凍對(duì)蝦仁TE、SXT 、AM*C、E、CTX、S、F/d20 2凍對(duì)蝦仁SXT、AMC*、NA#、E、CHL、CTX*、SqnrA、qnrS、aac(6')-Ib-c、qepA耐藥7種 Seven kinds of resistanceC0222近江牡蠣TE、AMC*、E、CHL、CTX*、S/d561凍羅非魚FEP*、ATM*、SXT、AMC*、E、CAZ*、CTX*、S、FblaTEM、blaSHVd12 2凍對(duì)蝦仁FEP*、ATM*、SXT、AMC*、NA#、E、CHL、CAZ*、CTX*qnrA、aac(6')-Ib-c、qepAd16凍羅非魚片TE、FEP*、ATM*、SXT、AMC*、E、CAZ*、CTX*、S/M06111文蛤CN、TE、FEP*、CIP#、ATM*、SXT、PRL*、CAZ*、CTX*、OFX#、SblaTEM、blaSHVd8凍羅非魚片ATM*、SXT、TE、FEP*、AMC*、E、CHL、F /耐藥8種 Eight kinds of resistanced27 2凍魷魚TE、SXT、AMC*、NA#、E、CHL、CTX*、FqnrA、qnrS、aac(6')-Ib-c、qepA、oqxBd10凍對(duì)蝦仁TE、FEP*、ATM*、SXT、AMC*、E、CHL、CAZ*、CTX*、S/d13 2凍羅非魚TE、FEP*、ATM*、SXT、AMC*、NA#、E、CAZ*、CTX*、FqnrA、qnrS、aac(6')-Ib-c、qepA、oqxBd11凍羅非魚片TE、FEP*、ATM*、SXT、AMC*、E、CAZ*、CTX*、S、F/d28 2凍魷魚FEP*、ATM*、SXT、AMC*、NA#、E、CHL、CAZ*、CTX*、FqnrA、qnrS、aac(6')-Ib-c、qepA、oqxB耐藥9種 Nine kinds of resistanced52凍羅非魚TE、FEP*、ATM*、SXT、AMC*、NA#、CHL、CAZ*、CTX*、S、FqnrA、qnrS、aac(6')-Ib-c、qepA、oqxBd15凍面包蝦TE、FEP*、ATM*、SXT、AMC*、E、CHL、CAZ*、CTX*、S、F/M06121,2文蛤CHL、LEV#、CAZ*、CTX*、OFX#、SCN、TE、FEP*、CIP#、ATM*、SXT、PRL*、NA#、E、NOR#blaTEM;qnrA、qnrS、aac(6')-Ib-c、qe-pA、oqxB

3 討 論

3.1 耐藥性檢測(cè)

所有分離菌株均表現(xiàn)出對(duì)至少1種藥物耐藥，76.9%的菌株多重耐藥。對(duì)紅霉素、復(fù)方新諾明、四環(huán)素、頭孢噻肟的耐藥率較高。結(jié)果與張夢(mèng)涵等[30]研究得出水產(chǎn)品中大腸埃希氏菌對(duì)四環(huán)素、復(fù)方新諾明、阿莫西林—克拉維酸耐藥率高的結(jié)果相似。葉蕾[29]研究亦發(fā)現(xiàn)，廣州市水產(chǎn)養(yǎng)殖品中含有大量的抗四環(huán)素、復(fù)方新諾明的菌株，而耐紅霉素的菌株則相對(duì)較少。多重耐藥研究結(jié)果與107株蝦源大腸埃希氏菌中多重耐藥菌株比例高達(dá)86.7%[41]和湛江東海島對(duì)蝦育苗場(chǎng)養(yǎng)殖水體細(xì)菌52.1%的菌株呈現(xiàn)多重耐藥結(jié)果[26]相近，提示本地區(qū)水產(chǎn)品中大腸埃希氏菌耐藥狀況較為普遍，多重耐藥較嚴(yán)重。這可能與養(yǎng)殖水體污染以及養(yǎng)殖過程中不規(guī)范用藥有關(guān)。

3.2 ESBLs基因和PMQR基因檢測(cè)

筆者對(duì)25株產(chǎn)ESBLs菌株及PMQR菌株分別進(jìn)行耐藥基因檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ESBLs基因檢出率為80%，PMQR基因檢出率達(dá)100%，進(jìn)一步證實(shí)了水產(chǎn)品源大腸埃希氏菌中存在質(zhì)粒介導(dǎo)的超廣譜β-內(nèi)酰胺酶耐藥及質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮耐藥，它們已成為潛在的耐藥基因庫，必須重視和控制水產(chǎn)品中細(xì)菌耐藥性的發(fā)生和傳播。blaTEM基因?yàn)?2株水產(chǎn)品大腸埃希氏菌分離株常見ESBLs基因型，未檢出blaCTX和blaOXA基因，與研究結(jié)果——blaCTX基因?yàn)榈耸显r(Procambarusclarkii)[41]、魚源[27]、動(dòng)物源致病性大腸埃希氏菌[15]主要ESBLs基因型，以及劉五高等[6]的綜述結(jié)論——腸桿菌科中攜帶CTX基因的質(zhì)粒較為常見不同，這可能與地域或來源不同有關(guān)。2株產(chǎn)ESBLs菌株未檢測(cè)到相關(guān)耐藥基因，提示可能存在其他的本試驗(yàn)未檢測(cè)的blaESBLs基因(如blaVIM、blaNDM等)。qnrA、aac(6′)-Ib-c及 qepA基因?yàn)?2株水產(chǎn)品大腸埃希氏菌分離菌株常見PMQR基因型，與國(guó)內(nèi)外專家研究結(jié)果[13,27,42-43]相符。95%(20/21)的攜帶耐藥基因的分離菌株具有較廣的耐藥譜(3～16種)并呈現(xiàn)多重耐藥(3～9重)。其中編號(hào)M0612的菌株同時(shí)攜帶ESBLs基因和PMQR基因，對(duì)16種9大類藥物耐藥，提示同時(shí)攜帶PMQR基因和ESBLs基因有增加菌株耐藥性的可能性，與王彬婷等[15,44]的研究結(jié)果相同。后續(xù)研究可進(jìn)行遺傳元件的檢測(cè)以及對(duì)ESBLs、PMQR 耐藥菌株進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移試驗(yàn)，進(jìn)一步探討ESBLs基因與PMQR基因的傳播機(jī)制。

4 結(jié) 論

研究結(jié)果表明，湛江地區(qū)水產(chǎn)品中大腸埃希氏菌普遍耐藥，且耐藥譜廣。菌株同時(shí)攜帶ESBLs基因和PMQR基因有增加細(xì)菌耐藥性的可能性。