湯曼利，李舒馨，彭 云，陳瑩瑩，王亞楠，馬桂珍，暴增海

( 1.江蘇海洋大學(xué) 海洋生命與水產(chǎn)學(xué)院，江蘇 連云港 222005； 2.河海大學(xué) 海洋學(xué)院海洋生物系，江蘇 南京 210098 )

隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)集約化程度越來越高，水體中的污染物包括氨氮、亞硝態(tài)氮等化學(xué)污染物和弧菌等病原微生物的大量積累給產(chǎn)業(yè)造成了巨大損失，制約了水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展[1-2]。氨氮等化學(xué)污染物的增加引起養(yǎng)殖水體日漸富營養(yǎng)化，養(yǎng)殖水質(zhì)惡化造成水中有害菌孳生，導(dǎo)致養(yǎng)殖病害頻發(fā)；由弧菌引起的疾病流行面積廣、發(fā)病率高，給養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大危害。目前我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)普遍使用化學(xué)法凈化水體，水產(chǎn)病害的防治主要依賴抗生素，但長期施用抗生素會導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生、對非靶生物產(chǎn)生毒害、破壞微生態(tài)平衡和對水產(chǎn)品消費(fèi)者造成健康威脅等問題[3-4]，而利用微生物治理養(yǎng)殖水體中的污染物能夠彌補(bǔ)化學(xué)治理的不足，具有安全、無污染、可持續(xù)等優(yōu)點(diǎn)，是發(fā)展無抗、健康養(yǎng)殖的有效手段和發(fā)展趨勢。

近年來，海洋微生物的抑菌作用及其代謝產(chǎn)物研究在國內(nèi)外引起廣泛重視。日本對海洋微生物進(jìn)行了廣泛研究，發(fā)現(xiàn)約有27%的海洋微生物具有抗菌活性，其中放線菌產(chǎn)生的活性次生代謝產(chǎn)物約占目前已發(fā)現(xiàn)微生物活性次生代謝產(chǎn)物的50%，海洋放線菌中的鏈霉菌、小單胞菌等可對副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、哈維氏弧菌(V.harveyi)、鰻弧菌(V.anguillarum)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)、鯊魚弧菌(V.carchariae)、霍亂弧菌(V.cholerae)等多種弧菌具有較強(qiáng)抑制作用[5-13]。海洋放線菌作為產(chǎn)新型抑菌活性物質(zhì)的潛在來源，篩選海洋抑菌放線菌具有重要意義。從海洋中尋找具有拮抗弧菌作用的新型放線菌成為國內(nèi)外的研究熱點(diǎn)[14-16]。除了抑制弧菌等病原菌，海洋放線菌也可以利用環(huán)境所提供的營養(yǎng)物質(zhì)(污染物)生長繁殖，發(fā)揮凈化水質(zhì)的作用[17-18]。開發(fā)利用海洋放線菌資源對調(diào)整和改善養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境、促進(jìn)水生動物健康生長、實現(xiàn)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)持續(xù)發(fā)展發(fā)揮了重要作用[19-20]。

為獲得高效抑制弧菌并降解氨氮的多功能放線菌菌株，本試驗從37株海洋放線菌中篩選對弧菌具有抑菌活性并能降解氨氮的優(yōu)良放線菌菌株，并對菌株進(jìn)行種類鑒定，旨在為養(yǎng)殖水體污染物的治理提供優(yōu)良菌株。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試海洋放線菌

37株海洋放線菌菌株，由本實驗室在連云港海域中分離純化并保存。

1.1.2 供試病原菌

副溶血弧菌、創(chuàng)傷弧菌(V.vulnificus)、嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)由揚(yáng)州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院水產(chǎn)病害實驗室提供，本實驗室保藏；陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)、弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacterfreundii)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、角斑病菌(Pseudomonassyringae)、青枯病菌(Ralstoniasolanacearum)、白色念珠菌(Moniliaalbican)為本實驗室保藏。

1.1.3 培養(yǎng)基

(1)放線菌活化培養(yǎng)基：高氏Ⅰ號培養(yǎng)基；

(2)放線菌發(fā)酵培養(yǎng)基：高氏Ⅰ號液體培養(yǎng)基；

(3)副溶血弧菌、創(chuàng)傷弧菌、嗜水氣單胞菌、陰溝腸桿菌、弗氏檸檬酸桿菌活化培養(yǎng)基：2216E培養(yǎng)基；

(4)白色念珠菌活化培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基；

(5)大腸桿菌、角斑病菌、青枯病菌、金黃色葡萄球菌活化培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。

(6)氨氮降解菌篩選培養(yǎng)基[21]：葡萄糖5.0 g，(NH4)2SO40.05 g(氨氮質(zhì)量濃度約為50 mg/L)，NaCl 1.0 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，水1000 mL，pH 7.2。

1.2 海洋放線菌不同菌株無菌發(fā)酵液抑菌作用的測定

將供試37個放線菌菌株在高氏Ⅰ號培養(yǎng)基斜面上活化5 d，用無菌水洗下菌苔，制成5×106cfu/mL的菌懸液，按18%的接種量接入裝有60 mL高氏Ⅰ號液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶內(nèi)，于28 ℃、180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)7 d。發(fā)酵液于4 ℃、5000 r/min離心15 min，上清液用孔徑0.22 μm的細(xì)菌過濾器過濾除菌，得到無菌發(fā)酵液。

以副溶血弧菌、創(chuàng)傷弧菌為指示菌，采用牛津杯法測定不同菌株無菌發(fā)酵液的抑菌活性[22]。將在2216E培養(yǎng)基斜面上培養(yǎng)24 h的指示菌分別用無菌水洗下，制備成5×106cfu/mL的菌懸液，取0.1 mL菌懸液涂布于2216E培養(yǎng)基平板上，制成含菌平板，每個含菌平板上等距離放置4個牛津杯，

每個牛津杯分別注入不同放線菌菌株的無菌發(fā)酵液200 μL，28 ℃條件下培養(yǎng)24 h，測量抑菌圈直徑，比較不同菌株無菌發(fā)酵液的抑菌活性。每菌株3個平行。

1.3 具有較強(qiáng)抑菌作用放線菌抑菌譜的測定

采用牛津杯法測定1.2中篩選出的抑制弧菌作用較強(qiáng)的放線菌菌株無菌發(fā)酵液對10種病原菌的抑菌作用[23]。

1.4 具有較強(qiáng)抑菌作用放線菌菌株氨氮降解率的測定

1.4.1 氨氮標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的制作

稱取235.8 mg (NH4)2SO4溶于水，定容至100 mL，制成氨氮質(zhì)量濃度為500 mg/L的氨氮貯備溶液，取氨氮貯備溶液進(jìn)行稀釋，制成氨氮質(zhì)量濃度分別為5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 mg/L的氨氮標(biāo)準(zhǔn)溶液，取不同質(zhì)量濃度的氨氮標(biāo)準(zhǔn)液100 μL，分別加入溶液A和溶液B各5 mL，充分混合后，放入37 ℃水浴顯色20 min，取出后冷卻至室溫，在637 nm下測定其吸光值(D637)。以氨氮質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，D637為縱坐標(biāo)，計算回歸方程，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

溶液A的配制：稱取0.3622 g含2個結(jié)晶水的亞硝基鐵氰化鈉，溶于水并定容至25 mL，配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.25%亞硝基鐵氰化鈉溶液，用棕色試劑瓶4 ℃保存。稱取5.00 g苯酚，溶于400 mL水，加入2.0 mL配制好的亞硝基鐵氰化鈉溶液，定容至500 mL，為溶液A，用棕色試劑瓶4 ℃保存。

溶液B的配制：稱取2.50 g NaOH、2.0 g檸檬酸三鈉和3.5 mL NaClO溶于400 mL水中，定容至500 mL，為溶液B，用棕色試劑瓶4 ℃保存。

1.4.2 氨氮降解率的測定

將篩選出的抑制弧菌作用較強(qiáng)的放線菌菌株在高氏Ⅰ號培養(yǎng)基斜面上活化培養(yǎng)5 d，用氨氮降解菌篩選培養(yǎng)基洗下菌苔，制備成5×108cfu/mL菌懸液，按5%的接種量接入裝有60 mL氨氮降解菌篩選培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，每個菌株接種3瓶，為3個平行，于28 ℃、180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)7 d。發(fā)酵液于4 ℃、5000 r/min條件下離心20 min，采用靛酚藍(lán)分光光度法[24-25]測定不同菌株的上清液的D637，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算不同菌株發(fā)酵液中的氨氮質(zhì)量濃度，以未接種的篩選培養(yǎng)基中為對照，計算不同菌株的氨氮降解率(RD，%)。

RD=(ρ0-ρ1)/ρ0×100%

式中，ρ0為對照氨氮質(zhì)量濃度(mg/L)，ρ1為處理氨氮質(zhì)量濃度(mg/L)。

1.5 兼具抑弧菌和氨氮降解功能的海洋放線菌的種類鑒定

1.5.1 形態(tài)學(xué)觀察

將篩選出的兼具抑弧菌和氨氮降解功能的海洋放線菌菌株接種于高氏Ⅰ號平板培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)7 d，觀察記錄培養(yǎng)基上菌落形態(tài)、顏色變化。

采用插片法，在高氏Ⅰ號培養(yǎng)基上劃線接種放線菌菌株，插入滅菌的蓋玻片，28 ℃分別培養(yǎng)1、3、5、7 d后，在顯微鏡下觀察插片上的氣生菌絲及孢子絲形態(tài)特征。

1.5.2 生理生化特性

采用細(xì)菌微量生化鑒定管進(jìn)行生理生化特性試驗[26]。

1.5.3 16S rDNA序列分析

用細(xì)菌基因組DNA快速抽提試劑盒提取放線菌菌株的基因組DNA作為模板，用細(xì)菌16S rDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增[27]，上引物為27F：5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′，下引物為1492R：5′-ACGGTTACCTTACCTTGTTACGAC TT-3′。PCR擴(kuò)增體系(25 μL)：2×San Taq PCR Mix 12.5 μL，上游引物27F(10 μmol/L)和下游引物1492R(10 μmol/L)各1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性50 s，52 ℃退火50 s，72 ℃延伸1.5 min，循環(huán)數(shù)35；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存[28]。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測回收純化，送生工生物工程(上海)股份有限公司測序，所得的16S rDNA序列拼接完整后與GenBank數(shù)據(jù)庫中已知序列進(jìn)行BLAST比對，采用DNAMAN 4.0軟件構(gòu)建F28菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 海洋放線菌無菌發(fā)酵液的抑菌作用的測定

37株供試放線菌中有23株的無菌發(fā)酵液對副溶血弧菌具有抑制作用，其中F28、ZF-1、F9、F4、X3-X4-3、X1-6、B1-1菌株的抑菌圈直徑大于20 mm，F(xiàn)28和ZF-1的抑菌作用最強(qiáng)，抑菌圈直徑分別為(31.57±0.63) mm和(30.27±0.45) mm，與其他菌株具有顯著差異；16株放線菌對創(chuàng)傷弧菌具有明顯的抑制作用，其中F28、F9、X3-X4-3菌株抑菌圈直徑大于15 mm，抑菌圈直徑分別為(18.93±0.92) mm、(17.83±0.96) mm和(15.23±0.96) mm，F(xiàn)28和F9與其他菌株均具有顯著差異(表1、圖1和圖2)。

表1 不同海洋放線菌對2種弧菌的抑制作用(抑菌圈直徑) mm

圖1 不同海洋放線菌無菌發(fā)酵液對副溶血弧菌的抑制作用Fig.1 Inhibitory effect of sterile fermentation broth of different marine actinomycetes on V. parahaemolyticusA.ZF-1； B.F4； C.F28； D.F9; E.8-1； F.C31； G.C42； H.B1-1； I.X3-X4-3； J.X1-6； K.S2-1； L.14-27； M.F5； N.14-14.

圖2 不同海洋放線菌無菌發(fā)酵液對創(chuàng)傷弧菌的抑制作用Fig.2 Inhibitory effect of sterile fermentation broth of different marine actinomycetes on V. vulnificusA.F28； B.F4; C.X3-X4-3; D.X1-6; E.F9; F.C:B1-1; G.C42; H.B1-1; I.S2-1;J.8-1;K.C31.

2.2 具有較強(qiáng)抑菌作用放線菌抑菌譜的測定

采用牛津杯法測定8株抑菌作用較強(qiáng)的海洋放線菌菌株無菌發(fā)酵液對10種病原菌的抑菌作用，結(jié)果顯示：菌株F28和F9抑菌作用強(qiáng)，抑菌譜廣，對10種病原菌均具有較強(qiáng)抑菌活性，抑菌圈直徑均大于14 mm，分別對3種和5種病原菌抑菌圈直徑達(dá)20 mm，對副溶血弧菌的抑菌活性最高，抑菌圈直徑分別達(dá)(31.57±0.63) mm和(27.13±0.97) mm；菌株ZF-1對9種病原菌有抑菌活性，其中對副溶血弧菌抑制效果最好，抑菌圈直徑達(dá)(30.27±0.67) mm。菌株F4、XL-7、S2-1、X3-X4-3對5種病原菌有抑菌活性；菌株14-27對4種病原菌有抑菌活性(表2、圖3)。

表2 海洋放線菌不同菌株對10種病原菌的抑菌作用(抑菌圈直徑) mm

2.3 具有較強(qiáng)抑菌作用放線菌氨氮降解率的測定

2.3.1 氨氮標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

將配制好的含有不同氨氮質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)液在637 nm下進(jìn)行比色，測定吸光值，以氨氮質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以D637為縱坐標(biāo)，制作氨氮標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。在設(shè)置質(zhì)量濃度范圍內(nèi)(圖4)，隨著氨氮質(zhì)量濃度的增加D637逐漸增大，呈正相關(guān)，計算回歸方程，工作曲線方程為：y=0.0038+0.0155x，r2=0.9967，線性相關(guān)性較好，可以用于菌株發(fā)酵液中氨氮質(zhì)量濃度的測定。

圖3 3株放線菌菌株無菌發(fā)酵液對不同病原菌的抑制作用Fig.3 Inhibitory effect of sterile fermentation broth of three strains of actinomycetes on different pathogensa.F28; b.F9; c.ZF-1.

2.3.2 具有較強(qiáng)抑菌作用放線菌氨氮降解率的測定

不同放線菌菌株在氨氮降解菌發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵7 d，采用靛酚藍(lán)分光光度法測定不同菌株發(fā)酵液的氨氮質(zhì)量濃度，計算氨氮降解率(表3)。不同菌株發(fā)酵液中氨氮質(zhì)量濃度明顯下降，8個菌株發(fā)酵液的氨氮質(zhì)量濃度均低于接種前培養(yǎng)基的初始氨氮質(zhì)量濃度(47.78±0.21) mg/L，其中7株放線菌的氨氮降解量大于20 mg/L，降解率大于40%，菌株14-27、菌株F28的氨氮降解率最高，分別為49.88%和46.86%，二者無顯著性差異，而與其他菌株差異顯著。

綜合抑菌試驗和氨氮降解試驗結(jié)果，菌株F28具有較強(qiáng)的抑菌及降解氨氮作用，故選擇菌株F28進(jìn)行種類鑒定。

表3 8株海洋放線菌的氨氮降解率

2.4 兼具抑弧菌和氨氮降解功能的F28菌株的種類鑒定

2.4.1 形態(tài)學(xué)觀察

菌株F28在高氏Ⅰ號培養(yǎng)基上初期菌落顏色為白色，5 d后變?yōu)榈S色，干燥致密，菌落邊緣呈鋸齒狀向外輻射。采用插片法，在顯微鏡下觀察，F(xiàn)28的氣生菌絲生長旺盛、分支多；孢子絲為直線形和波曲形；孢子表面光滑呈橢圓形(圖5)。

2.4.2 生理生化特性

菌株F28滴加指示劑后鼠李糖、葡萄糖生化鑒定管顏色變?yōu)辄S色，為陽性，說明該菌具有分解葡萄糖和鼠李糖的能力，不能利用肌醇、山梨醇、甘露醇、阿拉伯糖、蔗糖、麥芽糖、果糖、半乳糖作為碳源；尿素酶試驗呈陽性，表明菌株F28具有將尿素分解產(chǎn)生氨的能力；苯丙氨酸脫氨酶、賴氨酸脫羧酶、精氨酸水解酶、氧化酶、硫化氫試驗為陰性；半固體瓊脂試驗為陽性，表明菌株F28具有運(yùn)動性(表4)。

根據(jù)形態(tài)學(xué)觀察以及生理生化特性試驗結(jié)果，查閱《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》和《鏈霉菌鑒定手冊》等[29-30]相關(guān)文獻(xiàn)，認(rèn)為放線菌F28菌株符合鏈霉菌科鏈霉菌屬(Streptomyces)的特征。

表4 菌株F28的生理生化特性

2.4.3 菌株F28的16S rDNA序列分析

菌株F28的16S rDNA序列擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到單一條帶。將純化的PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司測序，應(yīng)用DNAMAN 4.0對序列測定雙反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行拼接，得到菌株F28的16S rDNA核苷酸序列，全長為1433 bp，將序列上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫，獲得登錄號為MN647548。用Clustal X與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對，菌株F28與梅久蘭鏈霉菌(S.mediolani)相似性為99.86%。選取同屬內(nèi)同源性較高的不同菌株的16S rDNA序列，采用MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，菌株F28與梅久蘭鏈霉菌NR_112465.1聚為一支(圖6)。

結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察與生理生化特性試驗測定結(jié)果，認(rèn)為菌株F28為鏈霉菌屬的梅久蘭鏈霉菌。

圖6 F28菌株16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic tree of 16S rDNA sequence of strain F28

3 討 論

3.1 放線菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水治理中的應(yīng)用

目前水產(chǎn)養(yǎng)殖中用于治理水體污染物和弧菌病害的微生物主要有乳酸菌[31-32]、芽孢桿菌(Bacillus)[33]、交替單胞菌(Alteromonas)[34]、普羅威登斯菌(Providencia)[35]等細(xì)菌，而近年來，海洋放線菌用于養(yǎng)殖水體污染物的治理引起人們的關(guān)注。You等[12]研究表明，海洋放線菌能在養(yǎng)殖池水中抑制弧菌菌膜的形成并產(chǎn)生抗菌類物質(zhì)，從而治療和預(yù)防病原性弧菌引起的對蝦病害；趙淑江等[5]從南麂島附近的海域中分離篩選出對多種弧菌均有較強(qiáng)抑制作用的多株放線菌，其中放線菌NJR0956對副溶血弧菌抑菌圈直徑達(dá)30 mm；李俠等[6]利用瓊脂塊法，測定了4株放線菌的抗菌譜，其中放線菌DJG10對鯊魚弧菌抑制作用較強(qiáng)，抑菌圈直徑達(dá)14.6 mm。相比于趙淑江等[5-6]分離的拮抗海洋放線菌，本試驗分離的海洋放線菌F28抑菌效果更強(qiáng)，抑菌譜更廣。王華等[36]研究表明，將放線菌與枯草芽孢桿菌(B.subtilis)以1∶1的接種比例接入水體中后，水體中氨氮、亞硝態(tài)氮的去除率達(dá)到最大，分別為69.2%和59.9%；王俊華等[17]在研究中發(fā)現(xiàn)，放線菌5406可以有效去除皂河黑臭水體中的氨氮、正磷酸鹽等污染物；王夢亮等[18]發(fā)現(xiàn)，光合細(xì)菌、放線菌、枯草芽孢桿菌混合培養(yǎng)能有效去除養(yǎng)殖水體中的高含量有機(jī)氮，表明海洋放線菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中具有抑菌和治理水體污染的作用。現(xiàn)有研究主要針對抑菌或降解污染物的單一功能的放線菌菌株篩選和利用，具有抑菌和降解氨氮復(fù)合作用的海洋放線菌菌株研究較少，篩選具有抑菌和降解氨氮的復(fù)合功能的海洋放線菌菌株對于開發(fā)微生態(tài)制劑具有重要意義。

3.2 梅久蘭鏈霉菌的研究現(xiàn)狀

目前有關(guān)梅久蘭鏈霉菌的研究較少。解玉紅等[37]分離得到1株將纖維素降解為乙醇的梅久蘭鏈霉菌K7-2；暴增海等[38]篩選到1株對多種植物病原真菌具有強(qiáng)抗菌作用的梅久蘭鏈霉菌ZW-1；Jiménez等[39]從高等植物煙草紅豆杉的根系中分離得到1株梅久蘭鏈霉菌AC37，其代謝產(chǎn)物為(-)-8-O-甲基四霉素，對多種病原菌有較強(qiáng)抑制作用。有關(guān)梅久蘭鏈霉菌對水產(chǎn)病原菌的抑菌作用和氨氮降解作用尚未見報道。

本試驗篩選到的梅久蘭鏈霉菌F28對弧菌和多種病原菌具有較強(qiáng)抑制作用，同時具有降解氨氮作用，表現(xiàn)出良好的開發(fā)應(yīng)用前景。今后將進(jìn)一步開展該菌株的抑菌作用機(jī)理、發(fā)酵條件優(yōu)化以及在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用效果及安全性評價等研究，為該菌株的開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

4 結(jié) 論

37株海洋放線菌菌株中有15株對副溶血弧菌和創(chuàng)傷弧菌均具有抑制作用，其中菌株F28的抑菌作用最強(qiáng)，對副溶血弧菌和創(chuàng)傷弧菌的抑菌圈直徑分別為(31.57±0.63) mm和(18.93±0.92) mm，在初始氨氮質(zhì)量濃度為50 mg/L時對氨氮的降解率為46.86%，初步鑒定菌株F28為梅久蘭鏈霉菌。