李麗萍 干小紅 周永杰 周后鳳

(1.成都市第五人民醫(yī)院藥劑科，四川 成都 611130；2. 四川大學(xué)華西醫(yī)院衛(wèi)生部移植工程與移植免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室病理研究室，四川 成都 610041)

膽管癌(Cholangiocarcinoma，CCA)是一種起源于膽管上皮細(xì)胞的原發(fā)性肝臟惡性腫瘤，在肝臟系統(tǒng)惡性腫瘤中占比10%～20%[1]。近年來，國內(nèi)外膽管癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，我國每年以5%的趨勢遞增[2]。由于其發(fā)病隱匿，臨床表現(xiàn)不明顯，80%患者首診時(shí)已進(jìn)入晚期。目前，對于膽管癌的治療主要依賴于手術(shù)切除，化療、放療措施有限[3-5]。但是，大多數(shù)患者確診時(shí)，癌細(xì)胞已發(fā)生轉(zhuǎn)移，無法通過手術(shù)切除來根治，以至于膽管癌患者5年生存率不到5%[6-7]。因此，尋找新的膽管癌靶向抗腫瘤藥物是提高其治療效果的關(guān)鍵。細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT)是指細(xì)胞逐漸失去上皮樣細(xì)胞形態(tài)和特性，獲得間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)和特性的過程[8]。在該過程中，細(xì)胞極性逐漸消失，細(xì)胞間連接減弱，細(xì)胞遷移及侵襲能力增強(qiáng)。腫瘤細(xì)胞EMT有助于其脫離原發(fā)病灶，完成侵襲及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[8-9]。在膽管癌細(xì)胞中，EMT是其發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵，抑制膽管癌細(xì)胞EMT進(jìn)程將有助于提高腫瘤治療效果[10-11]。吡非尼酮(pirfenidone，PFD)是一種廣泛用于肺纖維化治療的抗纖維化、抗炎藥物[12-13]。最近研究發(fā)現(xiàn)吡非尼酮可以有效抑制肝癌、胰腺癌細(xì)胞的增殖，及抑制結(jié)腸癌細(xì)胞EMT進(jìn)程[14-16]。但是，在膽管癌方面，吡非尼酮是否也具有抗腫瘤作用至今還不清楚。因此，本研究旨在檢測吡非尼酮對膽管癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及EMT進(jìn)程的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞 人膽管癌細(xì)胞HuCCT1購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.2 主要試劑 細(xì)胞培養(yǎng)基1640(SH30809，HyClone公司)、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS；16000-044，Gibco)購自美國Gibco公司，胰酶(C0201，Beyotime)細(xì)胞增殖與毒性檢測試劑盒(C0038，Beyotime)、ECL曝光液(P0018FS, Beyotime)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，Matrige(M8370，Solarbio)購自北京索萊寶科技有限公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠二抗(511103，Zenbio)、山羊抗兔二抗(511203，Zenbio)、β-actin抗體(200068-8F10，Zenbio)購自成都正能生物技術(shù)有限責(zé)任公司，N-Cadherin抗體(22018-1-AP，Proteintech)、E-cadherin抗體(20874-1-AP，Proteintech)、Vimentin抗體(10366-1-AP，Proteintech)購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，二甲亞砜(dimethylsulfoxide，DMSO)(A100231-0500，Sangon Biotech)購自生工生物工程(上海)股份有限公司，吡非尼酮(PFD)(純度99.98%)(HY-B0673，MCE)購自MCE生物公司。

1.3 儀器 CO2恒溫培養(yǎng)箱(新加坡ESCO公司)，膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)，全波長多功能酶標(biāo)儀(美國BioTek公司)，Eclipse Ti-s倒置顯微鏡(日本Nikon公司)。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng) 人膽管癌HuCCT1細(xì)胞用含有10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞生長融合至70%～80%時(shí)胰酶消化，進(jìn)行傳代培養(yǎng)或?qū)嶒?yàn)。

1.5 CCK-8檢測細(xì)胞活力 取對數(shù)生長期HuCCT1細(xì)胞，以每孔5×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)基，每孔加入100 μL 含有不同濃度吡非尼酮(0、0.25、0.5、0.75、1 g/L)的新鮮培養(yǎng)基，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)36 h 后，棄去培養(yǎng)基，每孔加入90 μL新鮮培養(yǎng)基和10 μL CCK-8試劑，晃動均勻后置于培養(yǎng)箱中避光孵育2 h，酶標(biāo)儀檢測450 nm處OD值。細(xì)胞活力(%)=[(OD給藥組-OD空白組)/(OD對照組-OD空白組)]×100%。

1.6 平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞克隆形成能力 取對數(shù)生長期HuCCT1細(xì)胞，以每孔1×103個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h后，分為對照組(DMSO)和給藥組(0.2 g/L PFD組)進(jìn)行給藥處理，每兩天更換一次培養(yǎng)基，藥物濃度保持不變。一周之后棄去培養(yǎng)基，PBS清洗3次，甲醇固定30 min，結(jié)晶紫染色30 min，PBS清洗5次，晾干，拍照。

1.7 劃痕愈合實(shí)驗(yàn) 取對數(shù)生長期細(xì)胞接種至6孔板中，待細(xì)胞生長融合至90%時(shí)，用槍頭垂直劃痕，PBS清洗3次，加入不含F(xiàn)BS的RPMI 1640培養(yǎng)基，并分為對照組(DMSO)和給藥組(0.25 g/L PFD組)進(jìn)行給藥處理，于處理0、48 h后觀察，并于10×顯微鏡下拍照。測量劃痕間距，計(jì)算劃痕愈合率：劃痕愈合率(%)=(0 h 劃痕寬度-48 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。

1.8 Transwell遷移實(shí)驗(yàn) 取對數(shù)生長期HuCCT1細(xì)胞，以每室5×104個(gè)細(xì)胞接種于Transwell上室，上室中分別加入含有DMSO(對照組)或給藥組(0.5 g/L PFD組)的無血清培養(yǎng)基，下室中加入10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)基，用棉簽擦去上室中細(xì)胞，PBS清洗小室3次，甲醇固定30 min，結(jié)晶紫染色30 min，PBS清洗5次。40×顯微鏡下觀察移至小室下室層面細(xì)胞，并隨機(jī)選取3個(gè)視野拍照、計(jì)數(shù)。

1.9 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) 取50 μL按1∶6稀釋的Matrigel膠包被Transwell上室膜，以每室5×104個(gè)細(xì)胞將HuCCT1細(xì)胞接種于Transwell上室，并分別加入含有DMSO(對照組)或0.5 g/L PFD(給藥組)的無血清培養(yǎng)基，下室中加入10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，棄去培養(yǎng)基，用棉簽擦去上室中細(xì)胞，PBS清洗小室3次，甲醇固定30 min，結(jié)晶紫染色30 min，PBS清洗5次。40×顯微鏡下觀察移至小室下室層面細(xì)胞，并隨機(jī)選取3個(gè)視野拍照、計(jì)數(shù)。

1.10 Western blot檢測E-cadherin、N-cadherin、Vimentin及β-actin的表達(dá) 取對數(shù)生長期HuCCT1細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞生長融合度達(dá)80%時(shí)，分別加入含有DMSO(對照組)、0.25 g/L PFD(0.25 g/L PFD組)、0.5 g/L PFD(0.5 g/L PFD組)的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)36 h后，RIPA細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，4 ℃、14000 ×g離心15 min，收集上清液，BCA法測定蛋白濃度。取40 μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，然后轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后用5%脫脂牛奶封閉液封閉膜1 h。一抗以1∶500，4 ℃孵育過夜，TBST清洗3次，二抗以1∶5000稀釋，室溫孵育1 h，TBST清洗3次，ECL顯色試劑盒顯影曝光。Image J軟件分析目的條帶灰度值，以β-actin為內(nèi)參，分析各目的蛋白表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 PFD抑制HuCCT1細(xì)胞的增殖 CCK-8結(jié)果顯示，與對照組相比，隨著PFD濃度的增加，HuCCT1細(xì)胞的活力逐漸下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，見圖1。提示PFD抑制HuCCT1細(xì)胞的增殖。PFD作用36 h的IC50為0.65 g/L。

圖1 不同濃度PFD對HuCCT1細(xì)胞增殖率的影響

2.2 PFD抑制HuCCT1細(xì)胞的克隆形成能力 平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組相比，0.25 g/L PFD處理后的HuCCT1細(xì)胞克隆數(shù)目顯著下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖2。提示PFD抑制HuCCT1細(xì)胞的克隆形成能力。

圖2 PFD對HcCCT1細(xì)胞克隆形成的影響

2.3 PFD抑制HuCCT1細(xì)胞的遷移 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組相比，0.25 g/L PFD處理后的HuCCT1細(xì)胞橫向遷移能力顯著下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖3。Transwell遷移室驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組相比，0.5 g/L PFD處理后的HuCCT1細(xì)胞縱向遷移能力也顯著下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖4。提示PFD抑制HuCCT1細(xì)胞的遷移。

圖3 PFD對HuCCT1細(xì)胞劃痕愈合的影響

圖4 PFD對HuCCT1細(xì)胞遷移的影響

2.4 PFD抑制HuCCT細(xì)胞的侵襲 Transwell侵襲室驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組相比，0.5 g/L PFD處理后的HuCCT1細(xì)胞侵襲能力顯著下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖5。提示PFD抑制HuCCT1細(xì)胞的侵襲。

圖5 PFD對HuCCT1細(xì)胞侵襲的影響

2.5 PFD抑制HuCCT1細(xì)胞的EMT進(jìn)程 Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組相比，0.25 g/L PFD、0.5 g/L PFD處理HuCCT1細(xì)胞后，上皮標(biāo)志物E-cadherin蛋白表達(dá)水平顯著升高，間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)水平都顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖6。提示PFD可能抑制HuCCT1細(xì)胞的EMT進(jìn)程。

圖6 PFD對HuCCT1細(xì)胞E-cadherin、N-cadherin、 Vimentin表達(dá)水平的影響

3 討論

近年來，膽管癌在國內(nèi)外的發(fā)病率都呈逐年上升趨勢。但是由于膽管癌的發(fā)病隱匿、臨床癥狀不明顯，所以多數(shù)患者確診時(shí)已進(jìn)入晚期，癌細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移[6]。這時(shí)，手術(shù)切除已經(jīng)無法達(dá)到根治，針對膽管細(xì)胞的靶向藥物治療成為提高膽管癌治療效果，延長患者生存時(shí)間的關(guān)鍵。但是，目前可用于膽管癌治療的藥物還十分有限。因此，新型藥物研發(fā)是提高膽管癌治療的迫切需求。由于作用機(jī)理明確、臨床安全性有保障，“老藥新用”在藥物研發(fā)領(lǐng)域一直備受關(guān)注。PFD是一種主要用于肺纖維化治療的特效藥，在肺癌方面已被報(bào)道可以減緩癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力及EMT進(jìn)程[17]。Tomsloba等[14]研究發(fā)現(xiàn)PFD可以通過抑制肝細(xì)胞的細(xì)胞周期來抑制肝臟腫瘤的發(fā)生；Usugi等[15]發(fā)現(xiàn)PFD同樣可以通過抑制細(xì)胞周期來抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖。但是，在膽管癌細(xì)胞中，PFD是否也可以抑制細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力，目前還不清楚。本研究利用不同濃度的PFD處理人膽管癌細(xì)胞HuCCT1，CCK-8檢測細(xì)胞活力結(jié)果顯示，PFD可以顯著降低細(xì)胞的活力。同時(shí)，平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PFD也可以顯著抑制HuCCT1細(xì)胞的克隆形成能力。提示在膽管細(xì)胞中，PFD單藥處理同樣具有抗腫瘤活性。最近，PFD被證明是蛋白激酶p38γ MAPK的特異性抑制劑，其可以通過與p38γ MAPK選擇性結(jié)合抑制p38γ MAPK的激酶活性，從而抑制p38γ MAPK依賴的信號傳遞[18-20]。研究表明，p38γ MAPK具有細(xì)胞周期調(diào)控激酶CDK的類似功能，可以通過磷酸化Rb蛋白調(diào)控肝細(xì)胞的再生和肝臟腫瘤的發(fā)生[14]。在膽管癌細(xì)胞中，PFD是否也通過靶向抑制p38γ MAPK而抑制細(xì)胞的增殖，還需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究來證明。

細(xì)胞遷移及侵襲是癌細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵。本研究同時(shí)利用劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)及Transwell實(shí)驗(yàn)檢測了PFD對HuCCT1細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響。結(jié)果顯示，PFD顯著抑制了HuCCT1細(xì)胞的遷移及侵襲，該結(jié)果與PFD對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞的作用效果一致[16-17]。EMT是腫瘤細(xì)胞獲得遷移及侵襲能力的關(guān)鍵。腫瘤細(xì)胞EMT過程中與EMT相關(guān)的分子標(biāo)志物表達(dá)水平將發(fā)生改變，包括上皮標(biāo)志分子E-cadherin表達(dá)水平下調(diào)、間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin、Vimentin、Snail等表達(dá)水平上調(diào)；這些功能分子表達(dá)水平的轉(zhuǎn)變，驅(qū)動細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)重塑、細(xì)胞特性改變，從而促進(jìn)癌細(xì)胞遷移及侵襲[8]。張峰偉等[21]也揭示膽管癌組織中N-cadherin的表達(dá)水平顯著高于癌旁組織，并且其表達(dá)水平與腫瘤的分化及淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移相關(guān)。本研究中，利用Western blot檢測了PFD對EMT標(biāo)志物表達(dá)水平的影響。結(jié)果顯示，PFD可以顯著上調(diào)E-cadherin的表達(dá)水平，同時(shí)下調(diào)N-cadherin、Vimentin的表達(dá)水平。提示PFD抑制了膽管癌HuCCT1細(xì)胞的EMT進(jìn)程，與PFD抑制HuCCT1細(xì)胞遷移及侵襲的抗腫瘤效果一致。雖然PFD治療肺纖維化的作用機(jī)制尚不清楚，但有研究顯示PFD抑制TGF-β、TGF-α、PDGF等介導(dǎo)的細(xì)胞增殖、上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化是其抗纖維化的主要作用方式[22-23]。TGF-β信號通路是胞外環(huán)境刺激調(diào)控細(xì)胞行為的主要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。研究顯示，TGF-β信號通路可以通過下游的Smad-依賴途徑和非Smad-依賴途徑調(diào)控細(xì)胞的EMT進(jìn)程[24-25]。在肺癌細(xì)胞中，PFD通過下調(diào)TGF-β受體的表達(dá)水平、抑制Smad2的磷酸化及核轉(zhuǎn)位，來抑制細(xì)胞EMT[17]。另外，馬博昭等[16]研究顯示，在腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)的HT29結(jié)腸癌細(xì)胞EMT過程中，PFD可能通過抑制腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞TGF-β的分泌抑制HT29細(xì)胞的EMT進(jìn)程。趙宇青等[26]報(bào)道在膽管癌REB細(xì)胞中TGF-β1可以誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生EMT，其機(jī)制可能與TGF-β1-Smad信號通路異常激活有關(guān)。在HuCCT1細(xì)胞中PFD是否通過作用于TGF-β1-Smad信號通路抑制細(xì)胞EMT，需要進(jìn)一步的研究來探明。

4 結(jié)論

PFD可以有效抑制膽管癌HuCCT1細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲及EMT進(jìn)程，本研究結(jié)果將為膽管癌的防治提供新的思路。