王平 賴聞 田松明

(重慶市兩江新區(qū)第一人民醫(yī)院耳鼻喉科，重慶 401121)

鼻咽癌是一種起源于人鼻咽部上皮組織的惡性腫瘤，屬于頭頸部癌，常見于東亞和東南亞[1]；其在我國東南部地區(qū)特別是廣東省高度流行，治療方案包括順鉑或5-氟尿嘧啶為主的放化療方案及外科干預(yù)[2]。放化療耐受是臨床治療失敗的主要原因，研究鼻咽癌的化療耐受靶點可為其治療提供新的方向，減輕患者痛苦，提高生存率。研究[3]表明，miR-221在骨肉瘤細(xì)胞系MG-63、SaoS-2和U2OS中明顯上調(diào)，miR-221的過表達(dá)促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的侵襲、遷移、增殖和順鉑耐藥，抑制其表達(dá)可增強骨肉瘤細(xì)胞的順鉑敏感性。miR-221-5p在人鼻咽癌微環(huán)境癌相關(guān)成纖維細(xì)胞中上調(diào)表達(dá)[4]。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，乙醛脫氫酶1家族A2成員(Aldehyde dehydrogenase 1 family member A2，ALDH1A2)的3′UTR區(qū)含有與miR-221-5p互補的序列。ALDH1A2在高級別上皮性卵巢癌組織中表達(dá)低于低級別上皮性卵巢癌組織，其過表達(dá)可抑制上皮性卵巢癌細(xì)胞株的增殖和遷移，而ALDH1A2的下調(diào)顯著增加了細(xì)胞的生長和遷移[5]。ALDH1A2在人結(jié)腸癌組織中表達(dá)下調(diào)，其過表達(dá)具有抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、克隆形成及侵襲的作用[6]。ALDH1A2與miR-221-5P在鼻咽癌中的表達(dá)和作用尚不清楚，對順鉑敏感性的影響也未可知?；谏鲜鼋Y(jié)果，本研究假設(shè)miR-221-5p可通過靶向ALDH1A2基因增加鼻咽癌細(xì)胞的順鉑敏感性，并對其進(jìn)行驗證。

1 材料與方法

1.1 材料 人永生化鼻咽上皮細(xì)胞NP69及人鼻咽癌細(xì)胞系SUNE1、HNE1和CNE2購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所，RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司，順鉑(DDP)、RIPA裂解液、胰蛋白酶、溴化噻唑藍(lán)四氮唑(MTT)和二甲基亞礬(DMSO)購自美國Sigma-Aldrich公司，ALDH1A2抗體、CyclinD1抗體、Cleave-caspase-3抗體、MRP1抗體和β-actin抗體購自英國Abcam公司，Total RNA提取試劑盒、 real-time PCR 試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RT-PCR)購自寶生物工程(大連)有限公司，引物、miR-221-5p mimics(miR-221-5p)、miR-221-5p抑制劑(anti-miR-221-5p)、ALDH1A2過表達(dá)載體(pcDNA-ALDH1A2)、ALDH1A2抑制物(si-ALDH1A2)、陰性對照(miR-con、anti-miR-con、pcDNA-con和si-con)及ALDH1A2野生型(WT)和突變型(MUT)雙熒光報告質(zhì)粒購自上海吉瑪制藥有限公司，Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒購自美國Invitrogen公司，BCA蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，酶標(biāo)儀、發(fā)光儀、顯微鏡及Real-time PCR儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將人永生化鼻咽上皮細(xì)胞NP69、鼻咽癌細(xì)胞系SUNE1、HNE1和CNE2均培養(yǎng)于含10 % FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL 鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，在飽和濕度37 ℃、5%CO2密閉培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。待細(xì)胞生長融合成一層時，洗滌，胰蛋白酶消化傳代。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 收集對數(shù)生長期的SUNE1細(xì)胞，消化并計數(shù)，用培養(yǎng)液將細(xì)胞稀釋為1×l06個/mL，接種于6孔板，繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)80%～90%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染，以不轉(zhuǎn)染的細(xì)胞為NC組。根據(jù)Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進(jìn)行操作，將載體或片段轉(zhuǎn)入SUNE1細(xì)胞。轉(zhuǎn)染分組：miR-221-5p低表達(dá)組(轉(zhuǎn)染anti-miR-con和anti-miR-221-5p)，ALDH1A2高表達(dá)組(轉(zhuǎn)染pcDNA-con和pcDNA-ALDH1A2)，miR-221-5p高表達(dá)組(轉(zhuǎn)染miR-con、miR-221-5p)，miR-221-5p和ALDH1A2低表達(dá)組(轉(zhuǎn)染anti-miR-221-5p+si-con和anti-miR-221-5p+si-ALDH1A2)，ALDH1A2的野生型(WT)和突變型(MUT)雙熒光素酶載體組(分別轉(zhuǎn)染miR-con+WT，miR-221-5p+WT，miR-con+MUT，miR-221-5p+MUT)。轉(zhuǎn)染48 h，收集細(xì)胞，驗證轉(zhuǎn)染結(jié)果，進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.2.3 Real-time PCR檢測RNA的表達(dá) 收集各組細(xì)胞，根據(jù)Total RNA提取試劑盒進(jìn)行細(xì)胞總RNA的提取，檢測濃度后按照反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，取cDNA為模板進(jìn)行 Real-time PCR反應(yīng)，合成ALDH1A2 mRNA和miR-221-5p。反應(yīng)程序為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s、59 ℃ 45 s、72 ℃ 45 s，45個循環(huán)；72 ℃5 min。運用2-ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.4 MTT法測定細(xì)胞存活率和對順鉑半數(shù)抑制量(IC50) 收集各組對數(shù)生長期的SUNE1細(xì)胞，稀釋后以2×103個細(xì)胞/孔接種于96孔板中，以不加DDP的細(xì)胞為空白對照，每孔加入不同濃度的DDP(終濃度分別為0.78125～50 μg/mL，倍比稀釋)，在細(xì)胞生長至72 h時進(jìn)行MTT實驗，每孔加入 20 μL(5 mg/mL)MTT，培養(yǎng)4 h，棄上清，每孔再加入150 μL DMSO，室溫震蕩混勻10 min，酶標(biāo)儀測定490 nm 吸光度(A)值。計算順鉑IC50值，細(xì)胞存活率=(A實驗組-A空白對照組)/(A陰性對照組-A空白對照組)×100%。每孔3個平行，實驗重復(fù)3次。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞凋亡率 收集各組SUNE1細(xì)胞，以每孔2×104個細(xì)胞接種于6孔板中，培養(yǎng)48 h，胰酶消化并收集細(xì)胞，進(jìn)行洗滌細(xì)胞，根據(jù) Annexin V/PI 試劑盒說明書進(jìn)行操作，加入 200 μL binding buffer重懸細(xì)胞，加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL 碘化丙啶(PI)混勻，避光室溫孵育20 min，再加入 300 μL binding buffer，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.2.6 Western blot檢測蛋白表達(dá) 收集對數(shù)生長期的NP69細(xì)胞和各組鼻咽癌細(xì)胞，加入RIPA裂解液裂解細(xì)胞，超聲破碎細(xì)胞，收集蛋白，測定蛋白濃度。取蛋白樣本進(jìn)行SDS-PAGE，用轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)PVDF膜，將膜用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入稀釋的一抗(ALDH1A2抗體1∶1000、CyclinD1抗體1∶3000、Cleave-caspase-3抗體1∶2000、MRP1抗體1∶1000和β-actin抗體1∶4000)，4 ℃孵育過夜，洗膜3次，加入稀釋的酶標(biāo)二抗，室溫孵育1 h，洗膜，顯影拍照，以β-actin 為內(nèi)參照，分析蛋白表達(dá)水平。

1.2.7 雙熒光素酶報告實驗 根據(jù)1.2.2進(jìn)行SUNE1細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染，將構(gòu)建的ALDH1A2的野生型(WT)和突變型(MUT)雙熒光素酶報告載體分別與miR-con或miR-221-5p共轉(zhuǎn)染SUNE1細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞并將細(xì)胞進(jìn)行裂解，離心收集裂解上清，根據(jù)試劑盒進(jìn)行操作，發(fā)光儀檢測熒光素酶活性。以海腎熒光素酶活性為內(nèi)參照，計算相對螢火蟲熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1 miR-221-5p、ALDH1A2 mRNA和ALDH1A2 蛋白在鼻咽癌細(xì)胞系和鼻咽上皮細(xì)胞中的表達(dá)量 與NP69組相比，SUNE1組、HNE1組和CNE2組鼻咽癌細(xì)胞中miR-221-5p的表達(dá)量均顯著上升(P<0.05)，ALDH1A2 mRNA和蛋白的表達(dá)量均顯著下降(P<0.05)，見圖1和表1。miR-221-5p和ALDH1A2在3種鼻咽癌細(xì)胞株中的表達(dá)情況一致，后續(xù)實驗選擇SUNE1細(xì)胞進(jìn)行研究。

圖1 Western Blot 檢測ALDH1A2蛋白的表達(dá)量

表1 miR-221-5p、ALDH1A2mRNA和ALDH1A2 蛋白在鼻咽癌細(xì)胞系和鼻咽上皮細(xì)胞中表達(dá)水平

2.2 低表達(dá)miR-221-5p抑制鼻咽癌細(xì)胞SUNE1增殖，誘導(dǎo)凋亡，增強對順鉑的敏感性 與NC組和anti-miR-con組相比，anti-miR-221-5p組miR-221-5p表達(dá)量顯著下降(P<0.05)，Cleave-caspase-3表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，增殖相關(guān)蛋白CyclinD1和MRP1(多藥耐藥相關(guān)蛋白1)表達(dá)均降低(P<0.05)，細(xì)胞存活率顯著下降(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，順鉑半數(shù)抑制量(IC50)降低(P<0.05)，見圖2和表2。

表2 低表達(dá)miR-221-5p抑制鼻咽癌細(xì)胞SUNE1增殖、誘導(dǎo)凋亡和增強對順鉑的敏感性

圖2 低表達(dá)miR-221-5p抑制鼻咽癌細(xì)胞SUNE1增殖、誘導(dǎo)凋亡和增強對順鉑的敏感性

2.3 高表達(dá)ALDH1A2抑制鼻咽癌細(xì)胞SUNE1增殖，誘導(dǎo)凋亡，增強對順鉑的敏感性 與NC組和pcDNA-con組相比，pcDNA-ALDH1A2組ALDH1A2和Cleave-caspase-3表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，Cyclin D1和MRP1表達(dá)顯著降低(P<0.05)，細(xì)胞存活率下降(P<0.05)，凋亡率上升(P<0.05)，順鉑半數(shù)抑制量(IC50)顯著降低(P<0.05)，見圖3和表3。

表3 高表達(dá)ALDH1A2抑制鼻咽癌細(xì)胞SUNE1增殖，誘導(dǎo)凋亡和增強對順鉑的敏感性

圖3 高表達(dá)ALDH1A2抑制鼻咽癌細(xì)胞SUNE1增殖，誘導(dǎo)凋亡，增強對順鉑的敏感性

2.4 miR-221-5p靶向ALDH1A2 TargetScan預(yù)測結(jié)果顯示，ALDH1A2的3′-UTR區(qū)含有與miR-221-5p互補的序列，見圖4A。與miR-con組相比，miR-221-5p組ALDH1A2野生型WT的螢火蟲熒光素酶相對活性顯著下降(P<0.05)，而突變型MUT的螢火蟲熒光素酶相對活性無明顯變化，見表4。Western blot結(jié)果表明，與miR-con組相比，過表達(dá)miR-221-5p可使ALDH1A2蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.05)；與anti-miR-con組相比，抑制miR-221-5p表達(dá)可使ALDH1A2蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，見圖4 B和表5。說明miR-221-5p靶向負(fù)調(diào)控ALDH1A2的表達(dá)。

表4 miR-con或miR-221-5p與ALDH1A2報告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染SUNE1細(xì)胞后雙熒光素酶活性檢測

表5 Western Blot檢測ALDH1A2的表達(dá)

圖4 miR-221-5p靶向調(diào)控ALDH1A2表達(dá)

2.5 低表達(dá)ALDH1A2可部分逆轉(zhuǎn)miR-221-5p低表達(dá)對SUNE1細(xì)胞增殖、凋亡以及順鉑敏感性的影響 抑制miR-221-5p可抑制SUNE1細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡和增強順鉑敏感性。與anti-miR-221-5p+si-con

組相比，anti-miR-221-5p+si-ALDH1A2組ALDH1A2和Cleave-caspase-3蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)，CyclinD1和MRP1蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)，細(xì)胞存活率顯著上升(P<0.05)，凋亡率顯著降低(P<0.05)，順鉑半數(shù)抑制量(IC50)顯著升高(P<0.05)，見圖5和表6。

圖5 低表達(dá)ALDH1A2可部分逆轉(zhuǎn)miR-221-5p低表達(dá)對SUNE1細(xì)胞增殖、凋亡以及順鉑敏感性的影響

表6 低表達(dá)ALDH1A2可部分逆轉(zhuǎn)miR-221-5p低表達(dá)對SUNE1細(xì)胞增殖和凋亡以及順鉑敏感性的影響

3 討論

順鉑(Cisplatin)是一種鉑族金屬抗癌化療藥物，是順式-二氯二氨合鉑的簡稱，常縮寫為DDP，目前已廣泛應(yīng)用于治療多種人惡性腫瘤，包括膀胱癌、頭頸部癌、肺癌、卵巢癌和睪丸癌[7]。順鉑主要作用機制是基于其與DNA嘌呤的交聯(lián)能力，干擾DNA修復(fù)機制，造成DNA損傷，進(jìn)而誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡；但由于其耐藥性和不良副作用，順鉑常與其他藥物聯(lián)合治療，以克服耐藥性和減少毒性。鼻咽癌可發(fā)生順鉑耐藥表型，靶向或阻斷BEX3活性可能有助于逆轉(zhuǎn)鼻咽癌順鉑耐藥表型[8]。臨床研究[9]表明，順鉑聯(lián)合吉西他濱可延長復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移性鼻咽癌患者的無進(jìn)展生存期，可作為該人群的標(biāo)準(zhǔn)一線治療方案。

大量miRNA在鼻咽癌中表達(dá)異常，以腫瘤抑制因子或致癌因子的作用調(diào)控鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展和耐藥等過程，可為患者提供有用的預(yù)后生物標(biāo)志物，為鼻咽癌治療提供新的靶點[10-11]。miR-221-5p在前列腺癌、腎細(xì)胞癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)，與癌細(xì)胞增殖、遷移和患者預(yù)后有關(guān)[12-13]。miR-221-5p在人乳腺癌微環(huán)境癌相關(guān)成纖維細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，可能參與了正常成纖維細(xì)胞向癌相關(guān)成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，并與癌相關(guān)成纖維細(xì)胞的增殖、黏附、侵襲、轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系[14]。有研究[4]表明，miR-221-5p在人鼻咽癌癌相關(guān)成纖維細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，可能與癌相關(guān)成纖維細(xì)胞的侵襲能力有關(guān)。miR-221-5p在鼻咽癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)和作用尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-221-5p在鼻咽癌細(xì)胞SUNE1、HNE1和CNE2中高表達(dá)，與前述結(jié)果[4]類似。抑制miR-221-5p表達(dá)可抑制鼻咽癌SUNE1細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并增強細(xì)胞的順鉑敏感性，說明miR-221-5p在鼻咽癌細(xì)胞增殖、凋亡和順鉑耐藥性過程中發(fā)揮重要作用。

ALDH1A2又稱乙醛脫氫酶(ALDH)1家族成員A2，是一種催化視黃醛合成視黃酸的酶，與ALDH1A1和ALDH1A3是三個高度保守的細(xì)胞同工酶，對脊椎動物成體器官和組織的正常生長、分化、發(fā)育和維持至關(guān)重要，是正常組織干細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)志物，參與自我更新、分化和自我保護(hù)[15]。ALDH1A2 在乳腺癌、卵巢癌、肝癌、胃癌和前列腺癌中表達(dá)異常，與患者總體生存率、癌細(xì)胞增殖、遷移、治療靶點、預(yù)后等有關(guān)[16-20]。ALDH1A2表達(dá)與神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者預(yù)后不良顯著相關(guān)，而且與異種神經(jīng)母細(xì)胞瘤的生長和未分化以及神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞對化療藥物13-順式維甲酸的耐藥有關(guān)[21]。ALDH1A2在鼻咽癌中的表達(dá)尚不清楚。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ALDH1A2在鼻咽癌細(xì)胞SUNE1、HNE1和CNE2中表達(dá)量均顯著下調(diào)，雙熒光素酶報告系統(tǒng)結(jié)果顯示，miR-221-5p靶向負(fù)調(diào)控ALDH1A2的表達(dá)；進(jìn)一步的實驗結(jié)果表明，低表達(dá)ALDH1A2可部分逆轉(zhuǎn)miR-221-5p低表達(dá)對SUNE1細(xì)胞增殖、凋亡以及順鉑敏感性的影響，說明miR-221-5p和ALDH1A2在鼻咽癌細(xì)胞中存在調(diào)控關(guān)系。另外，本研究通過TargetScan預(yù)測發(fā)現(xiàn)，ALDH1A2的3’-UTR序列中含有與miR-221-5p互補的核苷酸序列，提示兩者存在調(diào)控關(guān)系，也提示ALDH1A2參與miR-221-5p對鼻咽癌增殖、凋亡和順鉑耐藥性的調(diào)控。下一步將研究miR-221-5p和ALDH1A2在鼻咽癌患者中的表達(dá)，兩者對腫瘤增殖、侵襲的影響，及對癌癥分期和患者存活期的影響等，進(jìn)一步探討miR-221-5p和ALDH1A2在鼻咽癌臨床中的作用。

4 結(jié)論

在鼻咽癌SUNE1細(xì)胞中，低表達(dá)miR-221-5p可靶向促進(jìn)ALDH1A2表達(dá)，進(jìn)而抑制鼻咽癌SUNE1細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并增強細(xì)胞的順鉑敏感性的作用機制；miR-221-5p可能是鼻咽癌潛在的化療增敏靶點。